Ácidos Nucleicos: métodos analí3cos

Transcripción

1 Ácidos Nucleicos: métodos analí3cos 1

2 2

3 Espectrofotometría Ultravioleta Es una de las técnicas más u3lizadas debido a su sencillez, precisión, rapidez. Se basa en la capacidad de absorción de energía electromagné3ca que 3enen las sustancias (cromóforos). Las bases nitrogenadas (planas, aromá3cas y asimétricas) son los cromóforos más significa3vos que contribuyen al espectro de absorción ultravioleta de los á. n. (con un máximo a 260nm). Se u3liza para la detección, cuan3ficación y el análisis de pureza de las soluciones con ácidos nucleicos. 3

4 4

5 5

6 Ley de Lambert- Beer Existe una proporcionalidad entre la absorbancia, la concentración molar del cromóforo. A=εcl ε: coeficiente de extinción molar (constante de proporcionalidad) C: concentración L: longitud en cm de la longitud atravesada por la radiación L Cuando l=1 a la absorbancia se le llama, Densidad óptica (DO) y es directamente proporcional a la concentración de la sustancia. DO=εc 6

7 Las bases nitrogenadas son : Principal agente cromóforo del ADN. Más expuestas en el ssdna (o RNA) que en el dsdna, por lo que absorben más radiación. εrna εssdna>εdsdna DO=εc 1 unidad de DO a 260nm en una solución pura de ARN o ssdna 40mg/ml 1 unidad de DO a 260 nm en una solución pura de dsdna equivale a 50mg/ml Consideraciones: Estas relaciones sólo se man3ene si las soluciones son puras, una mezcla de ARN y ADN tendrá un valor intermedio. La absorbancia a 260 nm no permite dis3nguir entre el ARN y el ADN. La absorbancia del ADN varía con la temperatura. 7

8 ssdna dsdna La DO del ADN varía con la temperatura: La temperatura desnaturaliza las moléculas de ADN, que pasan a ser de cadena simple y a absorber más radiación. 8

9 Las proteínas 3enen también cromóforos tryptophan tyrosine Las proteínas presentan también cromóforos, principalmente triptófano y la 3rosina, que contribuyen a que tengan un espectro de absorción con un máximo a 280nm 9

10 Espectrofotometría UV de proteínas (fenil alanina) 10

11 11

12 Detección de contaminantes en la purificación de ADN mediante espectrofotometría El ácido nucleico puro no 3ene casi ninguna absorbancia a 300 nm, y bastante baja absorbancia a 280 nm. La pureza de una preparación de ácido nucleico puede es3marse a par3r de la forma los espectros de absorbancia. Para comprobar la pureza de la solución tradicionalmente se suele medir los ra3os: el ra3o A 260nm /A 280nm A 260nm /A 230nm 12

13 Ra3o A 260nm /A 280nm Para una solución Pura de ADN: Para una solución Pura de ARN: Las cinco bases nitrogenadas 3enen diferentes ra3os A 260nm /A 280nm: Guanine: 1.15 Adenine: 4.50 Cytosine: 1.51 Uracil: 4.00 Thymine: 1.47 El ARN 3ene un ra3o A 260nm /A 280nm ligeramente mayor debido a la diferencia de los ra3os de Uracilo y Timina. Pequeños cambios en el ph hace variar A 260nm /A 280nm (para medir Abs 10 mm Tris Cl, ph 7.5). Soluciones ácidas representarán ra3os 260/280: menor Soluciones básicas representarán ra3os 260/280: mayor. Si los ra3os son diferentes (suelen cambiar para abajo) la medición de la concentración que determinemos no es fiable y es indica3vo de contaminantes como proteínas o fenol.

14 El Ra3o A 260nm /A 280nm por si sólo no es muy sensible a la contaminación de proteína Para ver cambio sustancial en el ra3o A 260nm /A 280nm 3ene que haber una alta contaminación de proteína. A 260nm /A 280nm Solución pura proteína: 0.6 A 260nm /A 280nm Solución pura ADN: 1.8 A260/A280 ra3os of mixture DNA+Protein

15 before it is reflected in the A 260 /A 280 ratio (Figure 5). Espectro de Absorción de ADN, Proteína y mezcla

16 El Ra3o A 260nm /A 280nm es muy sensible a la contaminación de fenol

17 El Ra3o A 260nm /A 230nm Solución pura de ácidos nucleicos 2,0-2,2. Si la proporción es sensiblemente inferior era de esperar, esto puede indicar la presencia de contaminantes que absorben a 230 nm: EDTA, carbohidratos, fenol o urea

18 Mediciones puntuales vs espectro de absorbancia. Hay espectrofotómetros que sólo permiten mediciones puntuales (Absorbancia a 260nm, absorbancia a 280 nm), los de nueva generación (3po nanodrop) pueden darte un espectro de absorbancia (por ejemplo, un rango 220nm- 350nm) que es mucho más informa3vo. 18

19 Picos altos a A230nm podían indicar EDTA, carbohidratos, fenol o urea como contaminantes. Picos altos a A280 nm sugieren contaminaciones de proteína o fenol. Picos altos a A325 nm sugieren contaminaciones de parcculas (o cubetas sucia)

20 FLUORESCENCIA La fluorescencia es un 3po par3cular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias (fluoróforos) que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagné3cas y luego emi3r parte de esa energía en forma de radiación electromagné3ca de longitud de onda diferente. Los ácidos nucleicos no presentan fluorescencia, pero pueden interaccionar con moléculas fluoróforas ofreciéndoles un entorno esico y químico diferente que modifica notablemente sus caracterís3cas de emisión. 20

21 culas de estas sustancias estan libres en disoluci6n manifiestan una fluorescencia b al asociarse a las bases nitrogenadas de un acido nucleico esta fluorescencia aum notablemente. Este efecto es maximo por parte del DNA bicatenario, en cuya dob se introducen (intercalan) las moleculas en cuesti6n, pero tambien se observa en de RNA y de ssdna. Entre nucleicos las moleculas que se asocian a los acidos nucleicos po laci6n, el bromuro de etidio es sin duda la mas utilizada; la estructura plana y arom Ca3ón de E3dio: sustancia intercalante de los ácidos etidio (figura 3.2) le permite introducirse en la doble helice e intercalarse en de bases, en un ambiente hidrof6bico que estabiliza la interacci6n. Esto produce estructural importante: el desenrollamiento de la doble helice y la modificaci6n d de superenrollamiento de moleculas de dsdna circulares (capitulo 1). Por este m bromuro de etidio es una sustancia intercalante muy usada para el estudio estru DNA y de sus complejos proteicos. Ca3ón de e3dio (rojo) El Ca3ón de e3dio es una sustancia poco fluorescente que cuando se intercala entre la hélice de los ácidos nucleicos (especialmente dsdna) pero también ssrna o ssdna. 3.,._ _1-::1.::-1,:. ;.\ t&.. H 2 N Figura 3.2. Molecula del cation etidio. La fluorescencia que presenta el etidio cuando interacciona con los acidos 21 nuc utilizada universalmente como metodo de detecci6n de estos en procesos prepa

22 Espectro de Absorción del Ca3ón de E3dio El EtBr en solución acuosa absorbe máxima a 210 nm and 285 nm en el rango ultravioleta y cuando se encuentra intercalado en el ADN emite a 605nm (naranja luz visible). 22

23

24 La fluorescencia del BrEt y otros agentes intercalantes se u3liza universalmente como método de 3nción y revelado de bandas tras la electroforesis. 24

25 Alterna3vas al BrEt para teñir los a. nucléicos. El BrEt es el fluoróforo más usado para teñir los a.n. Desventajas: tóxico, necesita equipo de UV (también tóxico) y materiales de seguridad. Ventajas: potente, económico. Alterna3vas al BrEt vendidas como menos tóxicas (aunque toda molecular capaz de unirse al ADN muy aenmente es un carcinógeno potencial): SYBR Green y derivados. SYBR Green no necesita lámpara de UV, absorbe azul visible y emite verde). El SYBR Green no se usa mucho (por alto coste) para teñir ADN, se u3liza más en la PCR- cuan3ta3va. 25

26 En condiciones saturantes (cuando los a.n. están saturados de agente intercalante) la fluorescencia emi3da es proporcional a la can3dad de a.n. Los geles de agarosa teñidos con EtBr pueden usarse para cuan3ficar compara3vamente lo can3dad de ácido nucleico (fundamento de RT- PCR semi- cuan3ta3va). La fluorescencia de otras sustancias intercalantes como el SYBR green es uno de los métodos más usados la cuan3ficación con mucha precisión (PCR- cuan3ta3va). 26

27 ELECTROFORESIS La electroforesis es el movimiento de las parcculas dispersas en relación a un fluido bajo la influencia de un campo eléctrico uniforme espacialmente. En biología molecular la electroforesis se realiza con las parcculas incluidas en diferentes soportes que ayudan a la separación (ej: agarosa, poliacrilamida, etc). 27

28 SOPORTES USADOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS Agarosa. Poliacrilamida. 28

29 AGAR Mezcla heterogénea de dos clases de polisacáridos: agaropec3na y agarosa. Extraídas de algas de los géneros: Gelidium, Euchema y Gracilaria El agar nutri3vo es usado como medio de cul3vo para el crecimiento de bacterias y hongos Aplicaciones culinarias: laxante, espesante para sopas, gela3nas vegetales, helados y algunos postres y como agente aclarador de la cerveza. Agar recibe el nombre popular de gela3na japonesa. Mizuyōkan, una popular gela3na japonesa hecha con frijol rojo y agar. 29

30 AGAROSA Sustancia natural extraía del Agar. La agarosa es un polisacárido formado por repe3ciones del disacárido agarobiosa. 30

31 AGAROSA COMO SOPORTE DE ELECTROFORESIS Es soluble en agua a temperaturas superiores a los 65 C, Forma una matriz inerte y no tóxica usada en mul3tud de aplicaciones en biología molecular. 31

32

33 FACTORES ELECTROFORESIS Factores que contribuyen la base de la técnica: I) La dilución tampón o buffer. II) La matriz o soporte re3culado. III) Campo eléctrico. IV) Temperatura. V) Estructura y naturaleza de sustancias a separar. 33

34 I) Disolución tampón: Tris- Acetato- EDTA (TAE): 40mM Tris base (ph 8.0), 20mM Ace3c Acid, 1 mm EDTA Mas económico, menos capacidad tamponante. Tris Borato EDTA (TBE) 8.9 mm Tris, 8.9 mm boric acid, 0.2 mm EDTA, ph 8.3 Otros: SB (Sodium Borate), etc. Encargado de mantener el ph Aporta conduc3vidad Baja concentración de sales (fuerza iónica): baja movilidad. Alta concentración sales(fuerza iónica): subida temperatura. 34

35 II) La matriz o soporte re3culado: agarosa. Matriz en forma de poros que ejerce un efecto tamiz sobre las parcculas. 0.7%: Fragmentos ,000 pb. 2%: Fragmentos pb. Geles menores: muy blandos. Geles mayores: muy duros. III) Campo eléctrico. Voltaje de Corriente Con3nua. Máximo de 10V/cm separación polos. Cubeta mediana: 20-25cm ( V). Bajos: mayor separación bandas grandes. Altos: menor separación bandas pequeñas. 35

36 IV) Temperatura: aumenta debido al paso de la corriente y modifica las cualidades del tampón, el soporte y las propias moléculas separadas. Altas temperaturas (exceso voltaje, o sales) distorsionan la carrera. Pueden controlarse, refrigerarse. V) Estructura y naturaleza de sustancias a separar: Carga, Tamaño, topología de las moléculas. Los geles de agarosa clásicos se u3lizan para ADN bicatenario y lineal: Ø La composición de bases no altera la separación. Ø Tamaño: factor determinante. 36

37 5 Un fragmento de ADN bicatenario - y lineal se c,' mueve (entre ciertos límites).b tt 1U' )[f A con >11 una velocidad inversamente v q f ti \G-11 J. proporcional al logaritmo de su tamaño. () -4,._ f< f.c 1c. it, En un gel de agarosa, se puede determinar l ' ( j 1 '{I t el ' tamaño Desplazamiento desde el pocillo (cm) I I o-agarosa O'So/o % -6:- 0'9o/o - x - 1'2% -o- 1'4% 37

38 A mayor tamaño, mas lento viaja, pero no de una forma lineal, sino logarítmica. Bandas grandes, son muy dieciles de discriminar por tamaño En geles de agarosa se u3lizan marcadores de peso molécula, que sirven para determinar el tamaño de las moléculas y como controles de electroforesis, y 3nción. Bandas pequeñas son más fáciles de determinar por tamaño 38

39 V) Estructura y naturaleza de sustancias a separar: Topología: afecta dramá3camente al desplazamiento de las moléculas de ADN. La topología es especialmente importante en el caso de los plásmidos. Cuanto mayor sea el grado de superenrollamiento mayor será la velocidad. 39

40 V) Estructura y naturaleza de sustancias a separar: Carga, Tamaño, topología de las moléculas. 40

41 ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE Necesaria para moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos (ssdna, RNA): permite linearizarlas para poder separarlas por tamaño. De otra forma la topología de estas, debido a sus interacciones moleculares impediría poder separarlas por tamaño. Requieren buffer especial (MOPS) y agentes desnaturalizantes que linearizan las moléculas: formaldehído. 41

42 ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE 42

43 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (Polyacrylamide gel electrophoresis: PAGE) Polímero formado a par3r de acrilamida y N,N - me3lenbisacrilamida. acrilamida 43

44 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA 44

45 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA Mayor poder de separación que los de agarosa. Aplicación para la resolución de tamaños pequeños. 45

46 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA Pueden llegar a discriminar polímeros de hasta un nucleó3do de diferencia: geles desnaturalizantes de secuenciación. 46

47 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA La acrilamida es el soporte más u3lizado para la separación electroforé3ca de proteínas. 47