Tecnologías basadas en el ADN

Transcripción

1 Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas: Módulo de aprendizaje Tecnologías basadas en el ADN Fundamentos del ADN Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 1

2 Contenido La molécula de ADN: Estructura y características Replicación Empaquetamiento en el cromosoma Organización de las secuencias ADN citoplasmático Tecnología del ADN: Enzimas de restricción Electroforesis de ácidos nucleicos Polimorfismo de ADN Procedimientos para el aislamiento del ADN, en imágenes Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 2

3 La molécula del ADN: Estructura y características El ADN y el ARN son moléculas constituidas por filamentos de nucleótidos Un nucleótido consta de: Un azúcar pentosa Un grupo fosfato Una base nitrogenada Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 3 Los elementos fundamentales del ácido desoxirribonucleico (ADN) y del ácido ribonucleico (ARN) son los nucleótidos. Un nucleótido consta de: Un azúcar pentosa: en el ADN es la desoxirribosa, y en el ARN es la ribosa Un grupo fosfato Una base nitrogenada, que puede ser (en el ADN y en el ARN): Bases púricas: adenina (A) o guanina (G) Bases pirimidínicas: citosina (C) o timina (T); el uracilo (U) reemplaza la timina en el ARN La molécula de ADN consta de una cadena constituida por cuatro elementos fundamentales sencillos (A, G, C y T) que se reúnen para formar una doble hélice. Una hélice consta de dos hebras, cada una con su soporte de azúcar-fosfato, unidas por enlaces débiles de hidrógeno entre las bases adenina-timina (dos enlaces de hidrógeno) y citosina-guanina (tres enlaces de hidrógeno). La conformación de las bases A y T y la de las bases C y G son complementarias y esta es la razón por la que el ADN puede copiarse a sí mismo. Dos cadenas de soportes y de bases, que corren en direcciones opuestas (antiparalelas) forman la estructura de la doble hélice. El orden o secuencia de estas bases a lo largo de la cadena forma el código genético que lleva las instrucciones genéticas precisas para que el organismo funcione.

4 La molécula del ADN: Replicación Adaptado de Griffiths y col Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 4 5 En ciertas circunstancias (es decir, durante la replicación del ADN celular), las dos cadenas de la molécula de ADN se separan. La ARN polimerasa sintetiza un tramo corto de ARN complementario a una de las hebras de ADN en un sitio específico, conocido como el sitio de inicio de la replicación. Esta sección corta de ARN actúa como un patrón para que comience la réplica del ADN. Nuevas bases de ADN se acercan al extremo 3 y se adhieren a su pareja complementaria en la hebra del ADN patrón. Las nuevas bases se unen luego para hacer una cadena de ADN que es 'hija' del patrón anterior. Como los nucleótidos siempre se agregan al extremo 3, la síntesis de ADN ocurre en la dirección que va de 5 a 3. Este proceso se presenta en cada una de las cadenas de la molécula de ADN original.

5 { { La molécula del ADN: Empaquetamiento en el cromosoma 20 Å 110 Å 300 Å Å 3000 Å Å = angstrom, una unidad de longitud que equivale a 1/10 9 m Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 5 Una molécula de ADN es mucho más larga que un cromosoma, de manera que se necesita un mecanismo para plegar densamente y empaquetar la fibra de ADN. La mezcla del material del cual se forman los cromosomas se llama cromatina, y es la suma de la molécula de ADN más algunas proteínas. En los organismos eucariotas, el ADN se condensa con proteínas histonas, con otras no histonas y con un poco de ARN. Las histonas se organizan en nucleosomas y dan al ADN enroscado una apariencia de cuenta de collar. El enroscado adicional de los nucleosomas produce una conformación de solenoide, y todavía hace falta otro nivel de empaquetamiento para llegar a la estructura cromosómica. Los cromosomas están constituidos por regiones eucromáticas, levemente empacadas y que contienen la mayoría de los genes activos, y por regiones heterocromáticas, densamente empacadas y que aparentemente desactivan los genes a su alrededor. Con frecuencia se encuentra heterocromatina alrededor de los centrómeros. [La definición de Angstrom está modificada a partir del Merriam-Webster en línea (

6 La molécula del ADN: Organización de las secuencias ADN de copia única Centrómero ADN de copia múltiple Telómeros Adaptado de Flavell y Moore (1996) Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 6 El ADN eucariótico puede agruparse en diferentes tipos o clases: De copia única, genes que codifican proteínas ADN presente en copias múltiples: Secuencias con función conocida Codificantes No codificantes Secuencias con función desconocida Repeticiones (dispersas o en tándem) Transposones ADN espaciador Se pueden encontrar numerosas repeticiones en el ADN espaciador. Constan de la misma secuencia presente en muchas localizaciones, especialmente en los centrómeros y telómeros. Las repeticiones varían en tamaño, en número y en distribución en todo el genoma, lo que las hace sumamente apropiadas para su consideración como marcadores moleculares. Referencia Flavell, R.B. y G. Moore Plant genome constituents and their organization. En: Plant Genome Isolation: Principles and Practice (Foster, G.D. y D. Twell, eds.). John Wiley & Sons, Chichester, NY.

7 La molécula del ADN: ADN citoplasmático ADN citoplasmático ADN de los cloroplastos (ADNcp) ADN de las mitocondrias (ADNmt) Características: Herencia materna Tasas dispares de evolución (orden de los genes vs. secuencia de los nucleótidos) Acumulación lenta de mutaciones Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 7 Se encuentran cantidades pequeñas de ADN en el citoplasma, fuera del núcleo: en los cloroplastos (ADNcp) y en las mitocondrias (DNAmt). Tanto los cloroplastos como las mitocondrias tienen su propio cromosoma, del cual hay varias copias. Sus genes codifican para la traducción y la transcripción de los componentes de los organelos, y tienen funciones altamente especializadas en la expresión del fenotipo del organismo a que pertenecen. El ADN citoplásmico se hereda comúnmente, aunque no siempre, a través del progenitor materno, un modelo conocido como herencia materna. Las secuencias del ADNcp y del ADNmt tienen sus peculiaridades. El ADNmt de las plantas parece evolucionar rápidamente en lo que se refiere al orden de los genes, y lentamente en la secuencia nucleotídica. La razón de que las mutaciones se acumulen lentamente no se conoce con certeza, pero podría ser un efecto de la presencia ya sea de un mecanismo sumamente eficaz de reparación de daños del ADN o de un sistema de replicación del ADN relativamente libre de errores. En cambio, la tasa de evolución del ADNcp parece, en general, lenta, tanto en función de la secuencia nucleotídica primaria como del reordenamiento de genes.

8 Tecnología del ADN La tecnología del ADN incluye los conceptos de: Enzimas de restricción Electroforesis de ácidos nucleicos Polimorfismo del ADN Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 8

9 Enzimas de restricción Cada enzima de restricción corta el ADN en fragmentos definidos, gracias a la acción que ejerce en secuencias específicas que son su objetivo Dan lugar a extremos pegajosos o romos Los enzimas de restricción son de varios tipos: Tipo I y III, que cortan el ADN de hebra o cadena doble por fuera de la secuencia de reconocimiento Tipo II, que identifican secuencias de 4, 5 ó 6 pb y cortan por dentro de dicha secuencia T A G C Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 9 Las bacterias producen enzimas de restricción como un mecanismo de defensa contra los bacteriófagos. Estos enzimas pertenecen a una clase que parte (o corta) el ADN en posiciones internas específicas y únicas en toda su longitud. Por ello, también se los llama endonucleasas. Estas enzimas actúan como tijeras y así cortan el ADN de los fagos y los desactivan. De los tres tipos de enzimas de restricción, los tipos I y III cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia de reconocimiento. En cambio, los enzimas de tipo II identifican secuencias específicas de 4, 5 ó 6 pares de bases y cortan por dentro de estas secuencias. Debido a sus características, estos tres tipos de enzimas se han tornado esenciales para la tecnología del ADN recombinante. Los enzimas pueden cortar una secuencia dada de ADN, dejando extremos escalonados (o pegajosos) que permiten la creación de puentes de hidrógeno con una secuencia complementaria (finales contusos). Cuando dos fragmentos de ADN se cortan con el mismo enzima, se producirán fragmentos que tendrán extremos pegajosos complementarios, y a ellos se podrán adherir, por tanto, fragmentos alternativos. Los enzimas de restricción están disponibles comercialmente y suelen venir con la solución tampón apropiada y con las instrucciones acerca de las condiciones y las temperaturas de reacción.

10 Electroforesis de ácidos nucleicos Un método para separar fragmentos de ADN y permitir su visualización o su identificación (o ambos) Fuente de energía eléctrica - Gel + - Unidad de electroforesis + Adaptado de Griffiths y col Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 10 Después de la digestión a que es sometida por un enzima de restricción, la molécula de ADN se convierte en una colección de fragmentos de restricción. Estos fragmentos pueden separarse según su tamaño al hacerlos migrar en un gel de agarosa o de acrilamida. Para lograr esa separación, la mezcla de fragmentos de ADN y del sobrante de enzima se coloca en pocillos formados cerca de un borde del gel. El gel se somete luego a un campo eléctrico que hace migrar los fragmentos de ADN según su tamaño, de modo que los fragmentos grandes migran más lentamente que los fragmentos cortos. Las moléculas de ADN, que están cargadas negativamente a ph neutro, migran hacia el ánodo. Los geles de agarosa (de 0.8% a 2.0%) son muy útiles para separar fragmentos de ADN cuyo tamaño esté comprendido en el intervalo de 300 a pb. Los geles de acrilamida (de 3.5% a 20%) son muy útiles para fragmentos cuyo tamaño oscile entre 20 y 1000 pb. La visualización de los fragmentos de ADN, después de la electroforesis, se logra mediante la tinción con bromuro de etidio; las moléculas de esta sustancia se colocan entre las bases del ADN y producen una fluorescencia de color anaranjado bajo la luz ultravioleta. La distancia de migración es proporcional al logaritmo del número de bases. Por consiguiente, el tamaño real de los fragmentos obtenidos puede calcularse partiendo de la movilidad de los fragmentos de ADN de tamaño conocido.

11 Polimorfismo del ADN Diversos sucesos pueden causar variantes, más o menos complejas, en la secuencia de nucleótidos del ADN. Tales variantes se describen, generalmente, como polimorfismos El polimorfismo se manifiesta en diferencias del genotipo lo que se demuestra en los diversos perfiles de bandas que se detectan con un procedimiento apropiado y quizás del fenotipo Varios sucesos pueden producir polimorfismos: Mutaciones puntuales Inserciones o deleciones Rearreglos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 11

12 Mutaciones puntuales Las mutaciones puntuales ocurren cuando una base de la secuencia del ADN es reemplazada por otra. La longitud de la secuencia del ADN no cambia Reemplazo Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 12 Las mutaciones puntuales pueden ocurrir en una base solamente, o en unas pocas bases del mismo sitio. En el diagrama de la diapositiva, cuatro bases de la secuencia cromosómica original (parte superior) son reemplazadas por cuatro bases alternativas. Dado que el número original de bases no cambia, la longitud total de la secuencia no se altera.

13 Inserciones o deleciones Las inserciones o las eliminaciones son el resultado de la adición o la desaparición de varias bases en la secuencia del ADN. La longitud de la molécula cambia Deleción Inserción Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 13 La parte superior del diagrama ilustra una deleción: se pierden algunas bases y el fragmento de ADN resultante se vuelve más corto. La mitad inferior del diagrama ilustra una inserción: se introducen algunas bases en una sección de la secuencia del ADN. La secuencia original se torna, por tanto, más larga según el número de bases que se hayan insertado.

14 Rearreglos Los reordenamientos cromosómicos ocurren como resultado de la recombinación genética o de la inserción de elementos transponibles. La longitud de la molécula puede cambiar o quedar igual Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 14 También pueden darse cambios en la secuencia del ADN debidos a los reordenamientos; por ejemplo, cuando un segmento se da la vuelta. En estos casos, aunque quizás no cambie la longitud de la secuencia del ADN, su composición puede cambiar suficientemente para que se observe en este caso un polimorfismo.

15 Procedimiento de aislamiento del ADN en imágenes Las siguientes fotografías ilustran los diversos pasos del procedimiento para aislar ADN Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 15

16 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 16 El técnico de laboratorio está recolectando unas pocas hojas, muy jóvenes, de tomate para hacer una extracción pequeña de ADN. Para una extracción grande, se recolectarían muchas más hojas y más grandes (cerca de 10 g) de plantas más viejas.

17 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 17 El tejido de la hoja (para las extracciones pequeñas de ADN) y la solución tampón se convierten en una mezcla homogénea en un tubo de centrífuga de 1.5 ml, empleando un taladro equipado con un vástago de plástico. Para aumentar la eficiencia, se pueden usar dos taladros simultáneamente, que pueden ser controlados con pedales como los usados en las máquinas de coser.

18 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 18 Para extracciones grandes de ADN, el tejido de la hoja se homogeneiza con una solución tampón de extracción en batidoras estándar de cocina. Aunque no sean necesarios por razones de seguridad, sí conviene usar guantes y un delantal de laboratorio para proteger la ropa y la piel, ya que puede haber salpicaduras durante el procedimiento.

19 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 19 La mezcla del tejido foliar y solución tampón se vierte de la batidora, a través de una gasa, en botellas de centrífuga colocadas sobre un lecho de hielo. Se exprime la gasa para obtener tanto líquido como sea posible reteniendo en el filtro los pedazos grandes de tejido foliar, que luego se descartan junto con el filtro.

20 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 20 Después de centrifugar y resuspender la bolita (pellet) de ADN (que es todavía verde y contiene algo de material foliar), la mezcla se transfiere a un tubo nuevo al que se le agrega cloroformo. Este paso debe realizarse en una campana extractora con ventilación, y deben usarse guantes de seguridad y una bata de laboratorio.

21 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 21 Los tubos se invierten primero para mezclar suavemente el cloroformo y luego se centrifugan para separar el ADN.

22 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 22 La capa más clara, que contiene el ADN, está ahora en la parte superior y puede ser transferida a un tubo limpio. La capa inferior contiene tejido foliar no deseado, paredes celulares y otros residuos, y se descarta.

23 Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 23 Se agrega alcohol para precipitar el ADN, el cual, mediante una inversión suave, se congrega generalmente como una sustancia filamentosa. Este ADN puede ser retirado con un gancho o centrifugado. Luego se lava y se resuspende.

24 En resumen Los elementos fundamentales del ADN son los nucleótidos, que se unen haciendo una doble hélice con la que se forma la cadena del ADN La molécula del ADN se pliega cada vez más a medida que la secuencia de los nucleótidos le da forma al cromosoma El ADN se organiza en diferentes clases: de copia única, de copia múltiple y espaciador Las mitocondrias y los cloroplastos tienen su propia molécula de ADN Varios sucesos causan polimorfismos en la molécula de ADN: las mutaciones puntuales, las inserciones, las deleciones y los rearreglos Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 24

25 Hasta el momento usted debería saber Los componentes de un nucleótido De qué modo los nucleótidos forman la doble hélice del ADN Las diferentes clases de ADN Las características principales del ADN citoplasmático Lo que es un enzima de restricción La forma en que se producen los polimorfismos en la cadena de ADN Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 25

26 Referencias básicas Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin y W.M. Gelbart An introduction to genetic analysis (6a. ed.). W.H. Freeman, Nueva York. Lewin, B Genes V. Oxford University Press. Schleif, R Genetics and molecular biology (2a. ed.). Johns Hopkins University Press, Baltimore, MD, E.U. Singer, M. y P. Berg Genes and genomes. University Science Books, Mill Valley, CA, E.U. Watson, J.D., N.H. Hopkins, J.W. Roberts, J.A. Steitz y A.M. Weiner Molecular biology of the gene (4a. ed.). Vol. I: General principles. Benjamin/Cummings Publishing, Menlo Park, CA, E.U.

27 A continuación Tecnologías basadas en el ADN Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Tecnologías basadas en el ADN Tecnologías basadas en la PCR Tecnologías complementarias Consideraciones finales Glosario Derechos de Autor: IPGRI y Cornell University, 2003 ADN 26