El Proyecto Genoma Humano

Transcripción

1 La estructura del Núcleo La Replicación del ADN Niveles de Enrollamiento del ADN El Proyecto Genoma Humano

2 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 1 El presente material de trabajo ha sido diseñado con el propósito de orientar al alumno en el proceso de aprendizaje de la Biología. El alumno podrá alcanzar un óptimo rendimiento en la cursada de esta materia, cuando logre una modificación significativa y estable de sus conocimientos y sus pautas previas en lo referente a las Ciencias Biológicas. Con el objeto de ayudar a superar las dificultades que suelen plantearse durante el aprendizaje de esta asignatura, se efectúan algunas sugerencias acerca del uso del material didáctico y de la modalidad de cursada: - Lea atentamente los OBJETIVOS y los CONTENIDOS de cada unidad del programa. Esto le permitirá saber qué se espera que usted pueda lograr mediante el aprendizaje de la unidad (Objetivos) y qué temas serán tratados durante las clases (Contenidos). - Resuelva la totalidad de los ejercicios, problemas y actividades que se proponen en cada unidad. Para hacerlo, recurra al material denominado Marco Teórico de la Unidad, donde encontrará información orientadora, y a la bibliografía recomendada en clase. - No dude en acudir al docente cada vez que lo crea necesario. - Efectúe todas las Autoevaluaciones propuestas. Esto le permitirá hacer una estimación propia acerca de la evolución de sus conocimientos.

3 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 2 OBJETIVOS: Comprender la estructura del núcleo y su función Describir la estructura básica de la molécula de ADN Explicar el proceso de Replicación y sus Mecanismos de Regulación Conocer los Niveles de Enrollamiento del ADN Comprender el concepto de Cariotipo y su utilidad CONTENIDOS: El Núcleo: estructura y función La Replicación del ADN Mecanismos de Regulación de la Replicación Niveles de Enrollamiento del ADN Tipos de Cromosomas Cariotipo

4 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 3 Las distintas formas de vida poseen su propia identidad. Sin embargo todas ellas transmiten su información genética mediante la misma molécula: el ADN. 1- Cuál es la función básica del ADN? Qué estructura propone Watson y Crick para la molécula de ADN? Relacione con conceptos aprendidos anteriormente Qué significa que el ADN se replica? Mediante un esquema describa la replicación del ADN indicando : hebra líder hebra rezagada enzimas que participan ARN cebador Fragmentos de Okasaki. 5- Compare la cadena líder con la rezagada en cuanto a: a) Dirección de la síntesis. b) Presencia de fragmentos de Okasaki Explique por qué la replicación del ADN es: a) Semiconservativa. b) En horquilla. c) Bidireccional d) Discontinua Clasifique la síntesis del ADN desde el punto de vista metabólico y energético

5 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial Analice el esquema e indique: a) Qué proceso representa. b) En qué etapa del ciclo celular ocurre c) Cuál es la finalidad del mismo d) Cuales son las características de este proceso

6 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial Lea atentamente e interprete los siguientes textos:

7 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 6

8 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial La siguiente secuencia, muestra desde el enrollamiento del ADN hasta la formación del cromosoma eucariota. Explique el significado de cada paso. 11- Cuántos cromosomas poseen una célula somática humana y una célula sexual humana? Qué diferencia existe entre el material genético de una célula eucarionte y una célula procarionte?. Relacione con conceptos aprendidos anteriormente Qué es un cariotipo?. Cuál es su utilidad?. Investigue sobre este tema

9 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial Complete el siguiente esquema: 15- Los siguientes esquemas representan distintos tipos de cromosomas. Identifíquelos.

10 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 9

11 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 10 La etapa S : Duplicación del ADN Una de las etapas del ciclo celular es la fase S, donde la célula duplica su material genético. Esta etapa es crucial para la reproducción celular, ya que las células hijas deben recibir una copia exacta del ADN de la célula de cual provienen. Una vez determinado el ADN como el material hereditario y descifrada su estructura, los científicos comenzaron a investigar acerca de los mecanismos a través de los cuales el ADN se duplica. Antes de comenzar a analizar los complejos mecanismos que involucra de duplicación del ADN profundicemos acerca de nuestros conocimientos sobre la estructura del núcleo celular. Como se recordará, el núcleo de las células está constituido por una envoltura nuclear, formada por una doble membrana (bicapa fosfolipídica) separadas por un espacio, el carioplasma, varias moléculas de ADN (dependiendo de cada especie), un nucleolo o sector que contiene heterocromatina y ARN, proteínas y enzimas (ver Unidad 5, Envoltura Nuclear). La comunicación entre el núcleo y el citoplasma se establece a través de los poros de la envoltura nuclear. Estos son interrupciones de la doble bicapa, rodeadas por proteínas específicas que forman el complejo del poro. Estas Microfotografía de un núcleo celular donde se observa la envoltura nuclear, regiones de heterocromatina y eucromatina. proteínas controlan y regulan el transporte de moléculas entre el núcleo y el citoplasma. Como es lógico, impiden que el ADN salga del núcleo y evitan el ingreso de cualquier enzima que pueda dañarlo. Sin embargo, cuando el ADN se duplica, necesita que ingresen al núcleo los nucleótidos necesarios para formar la nueva molécula, las enzimas que Micrografía de las proteínas formando el complejo del poro. catalizan el proceso y las proteínas histonas en las cuales de enrolla el ADN. Durante la fase G1 del ciclo celular los poros regulan el ingreso de ribonucleótidos para la trascripción, las enzimas que catalizan este proceso y también controlan la salida de los ARNs y los ribosomas. Recordemos que durante toda la interfase el ADN se encuentra en estado Esquema de la organización y ubicación de las unidades proteicas que forman el complejo del poro

12 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 11 de cromatina (eucromatina y heterocromatina). Esta forma laxa permite copiar su información. Cómo se duplica el ADN? Ya conocido el modelo estructural de la molécula de ADN, comenzaron a formularse hipótesis acerca de su duplicación, hecho fundamental que permite transmitir la información que contiene una célula a las dos células hijas resultantes luego de la división celular. Dentro de estas hipótesis que intentaban explicar la duplicación, mencionaremos tres: La conservativa, la dispersiva y la semiconservativa. Según la hipótesis conservativa, luego de la duplicación se formaban dos moléculas hijas, una formada por ambas hebras de la molécula original y otra formada por ambas hebras nuevas. Esquemas correspondientes a las tres hipótesis propuestas para explicar el mecanismo de replicación. El modelo dispersivo proponía el intercambio de fragmentos de ADN entre la molécula antigua (original) y la molécula nueva (la copia), de forma que a cada célula hija pasaran moléculas formadas por segmentos copia y segmentos originales de la doble hélice de la célula madre. La discusión en el mundo científico continuó hasta que Watson y Crick propusieron la hipótesis semiconservativa, demostrada más tarde por Meselson y Stahl (1957). Según esta hipótesis, la molécula original se abre durante el proceso de duplicación, y cada una de las hebras que la forman sirve de molde para la síntesis de una nueva hebra complementaria. Al finalizar el proceso, las moléculas hijas así formadas contienen una hebra de la molécula original (que sirvió de molde) y una hebra sintetizada nucleótido a nucleótido, es decir, una hebra completamente nueva. Esquema de una molécula de ADN replicándose.

13 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 12 En la hipótesis semiconservativa, la molécula bicatenaria de ADN se abre en forma de horquilla y se sintetizan dos hebras nuevas. Las hebras nuevas se forman por complementariedad de bases con la hebra madre u original que están copiando, lo cual asegura la preservación de la información genética. Al final del proceso se forman dos moléculas nuevas, formadas cada una de ellas por una hebra original (de la molécula vieja) y una hebra nueva. En otras palabras, las hebras existentes sirven de molde complementario a las nuevas. El nombre de semiconservativa proviene de que en la molécula recientemente formada se conserva una hebra de la molécula original. Hebra original Hebra nueva Esquema de la formación de la horquilla de replicación y la acción de algunas de las enzimas intervinientes. La experiencia de Meselson y Stahl El experimento propuesto por estos científicos demostró de manera concluyente que la replicación del ADN seguía el modelo semiconservativo. En su experiencia, cultivaron varias generaciones de la bacteria Escherichia coli en un medio que contenía cloruro amónico como única fuente de nitrógeno y cuyo nitrógeno era el isótopo pesado N15 (recordemos que para la duplicación del ADN las células necesitan sintetizar nucleótidos y, por supuesto, bases nitrogenadas). Dado que el isótopo más frecuente en la naturaleza es el N14, todas las moléculas originales de ADN de estas bacterias contendrían N14, mientras que las que fueran sintetizadas en este nuevo medio contendrían N15. El peso de las moléculas de ADN según contengan N14 o N15 puede observarse luego de una centrifugación. Así, las moléculas formadas por N14 son más livianas que las formadas por N15. Experiencia de Meselson y Stahl

14 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 13 En el experimento, las células que se colocaron en el medio de cultivo con N15 se dejaron replicar por varias generaciones, para asegurar que todo su material genético tuviera el isótopo pesado. Luego, se tomó una muestra de este cultivo y se colocó en un medio con N14, dejando que las células se dividan (y por lo tanto repliquen su ADN) por varias generaciones, tomando muestras a distintos intervalos. Cada muestra era centrifugada. En los resultados se observó que, después de la primera generación de bacterias en el medio con N14, la banda que marcaba el centrifugado de la muestra correspondía a una molécula semipesada, es decir, que contenía N14 y N15. Este resultado demostraba que la molécula de ADN duplicado contenía una hebra original (con N15) y otra nueva (con N14). En la segunda generación, siempre utilizando el mismo medio de cultivo con N14, se obtuvieron, luego de la centrifugación, moléculas livianas y moléculas semipesadas. Las moléculas livianas, formadas íntegramente por N14 y las semipesadas, constituidas por una hebra con N14 y otra con N15. Muestra de la centrifugación de la primera generación. El ADN presenta en sus dos hebras el isótopo pesado de N15. La banda negra representa el sitio donde se deposita el ADN pesado, en el sector inferior del tubo de ensayo. Muestra de la centrifugación de la segunda generación. Las moléculas de ADN están formadas por una hebra pesada con N15 y otra liviana con N14. La banda negra, que representa la molécula de ADN se deposita más Arriba que en el 1 tubo. Muestra de la centrifugación de la tercer generación. Se observan Moléculas semipesadas y livianas, estas últimas formadas íntegramente por N14. Aquí, las dos bandas negras se depositan en posiciones que diferencian su peso, y, en consecuencia, su contenido de N14 o N15. El Proceso de Replicación El proceso de replicación es similar tanto en los organismos procariontes como en los eucariontes. Es un proceso complejo en el que intervienen más de 50 proteínas distintas agrupadas en complejos multienzimáticos. La replicación del ADN ocurre una sola vez en cada generación celular. La velocidad con que ocurre este proceso es variable; en la especie Homo sapiens, por ejemplo, se produce a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo, mientras que en procariontes la velocidad es de 500 nucleótidos por segundo. Una vez que los mecanismos de regulación celulares disparan el inicio de la etapa S, comienzan a actuar sobre la molécula de ADN numerosas enzimas: Helicasa: rompe los enlaces puente de hidrógeno entre ambas cadenas complementarias del ADN, separando sectores de la molécula bicatenaria. Topoisomerasas: alivian la tensión de la molécula de ADN evitando su hiper-enrrollamiento. ADN polimerasa: polimeriza los nucleótidos utilizando la molécula original de ADN como molde. Hay tres tipos diferentes de ADN polimerasas llamadas I, II y III. Entre éstas, la ADN polimerasa III es la responsable de la síntesis de ADN. Para que la ADN-polimerasa realice su actividad catalítica es necesario que existan en el medio iones de Mg 2+ y los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatados (datp, dgtp, dctp y dttp) que constituyen la molécula de ADN.

15 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 14 ARN polimerasa o primasa: sintetiza pequeños fragmentos de ARN que se utilizan como cebadores. Ligasa: Cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre nucleótidos de distintos fragmentos (de Okasaki, ver más adelante). La replicación comienza en sitios específicos llamados sitios de origen de la replicación. A partir de este sector (que está determinado por una combinación específica de nucleótidos) actúan las enzimas helicasas separando ambas hebras de la molécula. De este modo se forma un área conocida como "burbuja de replicación". En este punto actúan proteínas desestabilizadoras de la hélice o proteínas de unión de una sola cadena, que se acoplan a las hebras de ADN para mantenerla recta y abierta. La ADN-polimerasa es también autocorrectora ya que después de unir cada nucleótido comprueba si se han producido errores antes de incorporar el nucleótido siguiente. Si detecta un error, elimina el último nucleótido colocado y lo sustituye por el correcto. Esquema del origen de la replicación en una molécula de ADN A partir de esta acción, la ADN polimerasa es capaz de reconocer las bases libres y colocar el nucleótido con su correspondiente base complementaria (recordemos que Adenina se combina con Timina y Citocina con Guanina). De esta forma se sintetiza una nueva hebra utilizando como molde cada una de las cadenas originales. La enzima ADN polimerasa efectúa los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos de la cadena nueva. Una vez que la ADN-polimerasa localiza el nucleótido complementario, cataliza su hidrólisis separando un grupo pirofosfato (P-P) y uniendo el resto (desoxirribonucleótido-monofosfato) a la cadena de ADN que se está formando mediante un enlace fosfodiéster. La energía necesaria para esta unión se obtiene de la hidrólisis del grupo pirofosfato. Ésta es la función polimerizadora de la ADNpolimerasa. Es importante notar que en la molécula de ADN ambas hebras son antiparalelas (una se ubica en sentido 5 3 y la otra en sentido 3 5 ) y que las hebras nuevas, sintetizadas nucleótido a nucleótido, se ubican también en forma antiparalela a la hebra que están utilizando de molde.

16 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 15 En organismos procariotas, el inicio de la replicación se produce en un extremo de la molécula de ADN, por lo que se forma una horquilla de replicación que avanza desde un extremo al otro de la molécula. En eucariotas, se abren varias burbujas de replicación, lo que genera varios sitios de origen de la replicación por cada molécula. El ADN se replica en toda su longitud por confluencia de estas "burbujas". Considerando un solo origen de la replicación y la velocidad de este proceso, un cromosoma humano tardaría unas 800 horas en replicarse, pero esto no ocurre. Se ha comprobado que el ADN de células eucariontes posee varios sitios de origen de la replicación y a cada una de estas regiones se las denomina replicón. Los replicones tienden a formar grupos denominados unidades de replicación (20-80 replicones). A lo largo de la fase S del ciclo celular, a medida que unas unidades de replicación van finalizando la replicación, se activan otras nuevas, siempre por grupos, hasta que todo el DNA se haya replicado. Esquema de una horquilla de replicación. En este sector ambas hebras de ADN se separan y se inicia la síntesis de una nueva hebra complementaria. Es importante notar que una de las hebras crece en la dirección de apertura de la horquilla (cadena adelantada), mientras que la otra lo hace en dirección opuesta (cadena atrasada). La enzima ADN polimerasa posee algunas restricciones para poder cumplir con su actividad catalítica. Una de ellas es que sólo es capaz de realizar la síntesis de ADN en el sentido 5 3, motivo por el cual opera en direcciones opuestas en cada hebra. Dirección de las cadenas líder y rezagada Como se muestra en el esquema, la síntesis de ADN avanza de manera continua sobre la hebra molde que tiene libre el extremo 3. La hebra molde complementaria, que posee libre su extremo 5, inicia su síntesis en sentido opuesto a la apertura de la horquilla de replicación. Esta última, llamada hebra rezagada, se sintetiza por fragmentos. Cada vez que la horquilla de replicación separa un tramo de la molécula de ADN, se inicia una nueva cadena, siempre utilizando la dirección de síntesis 5 3. De este modo, se produce una hebra líder o continua que avanza en el sentido que avanza la horquilla de replicación y una hebra discontinua o rezagada, formada por fragmentos y también sintetizada en sentido 5 3. Estos fragmentos se denominan Fragmentos de Okasaki en honor al científico que las descubrió.

17 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 16 Otra restricción de la enzima ADNpolimerasa es que no puede iniciar la síntesis de las nuevas hebras si no cuenta con un extremo 3 libre. Por esta razón es necesario que, antes del inicio de cada hebra nueva, actúe otra enzima, la ARN polimerasa o primasa, que sintetiza un corto fragmento de ARN que actúa como cebador. De este modo, antes del inicio de cada hebra rezagada se sintetiza un pequeño fragmento de ARN cebador o primer. Luego, la ADN polimerasa continúa la síntesis de ADN. El ARN cebador o primer, corta molécula de ARN (10 pares de bases) hace que empiece a actuar la ADN polimerasa. El ARN cebador es generado por la enzima ARN primasa. Esta enzima se une directamente a la ADN helicasa, formando un complejo llamado primosoma, que se va desplazando con la cadena en formación. A medida que se producen fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se va sintetizando la cadena discontinua formando pequeños fragmentos, Fragmentos de Okazaki, cada uno de unos 1000 nucleótidos. Se utiliza un ARN cebador por cada fragmento de Okazaki. La ARN primasa, sintetiza los ARN cebadores que son incorporados a la copia en el inicio de cada fragmento de Okazaki. Características de la duplicación La síntesis de ADN presenta las siguientes características: Semiconservativa: las moléculas nuevas conservan una de las hebras de la molécula original. Bidireccional: a partir de un punto de origen, la molécula se duplicará en ambas direcciones. Discontínua: la síntesis se produce a través de fragmentos en la hebra rezagada. En síntesis, la replicación del ADN consta de los siguientes pasos: Desenrrollamiento y apertura de la doble hélice de ADN. La separación de las cadenas comienza en puntos concretos llamados puntos de iniciación. A partir de ellos se van separando las dos hebras de ADN formando la burbuja de replicación. Los dos extremos de la burbuja por donde continua la separación reciben el nombre de horquillas de replicación. La síntesis de las cadenas complementarias comienza con la síntesis del ARN cebador que es una corta cadena de ARN con una secuencia complementaria de una de las porciones de las hebras del ADN. En la hebra que tiene el sentido 3'--5' la ADN-polimerasa va colocando nucleótido tras nucleótido a continuación del ARN cebador. Esta hebra complementaria que va creciendo en sentido 5'--3' es la hebra adelantada o líder. En la hebra opuesta del ADN original, a continuación del ARN cebador, se coloca un fragmento de Okasaki y, después de éste, un nuevo ARN cebador seguido de otro fragmento de Okasaki. Luego, actúa una ribonucleasa que elimina el ARN cebador que está entre dos fragmentos de Okasaki. El sector que ocupaba el ARN cebador es rellenado por la ADN-polimerasa, que ubica desoxiribonucleótidos complementarios.

18 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 17 Síntesis de la hebra líder Síntesis de la hebra rezagada Dirección de crecimiento de la burbuja Cadenas hijas Fragmentos de Okasaki Síntesis de nuevas hebras de ADN y crecimiento de la burbuja de replicación

19 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 18 Cómo sintetiza la ADN polimerasa ambas hebras de forma conjunta? El ADN sintetizado en la cadena retrasada y su cadena molde sufren un plegamiento, esto posibilita que la ADN polimerasa pueda formar un complejo único y así sintetizar ambas hebras de ADN (la adelantada y la rezagada). Las topoisomerasas mantienen esta estructura y evitan que el ADN se súper enrolle, cortando un enlace fosfodiéster (a este corte se lo denomina nick). Además, existe una proteína llamada SSB, que estabiliza la forma monocatenaria de la hebra que se está replicando, para que no se pliegue y acople por complementariedad de bases con ella misma. Luego actúan las enzimas ligasas, que reparan los nicks en el momento en el que se sustituye el ARN cebador y se unen los fragmentos de Okasaki. Esquema de la duplicación del ADN que muestra a acción de cada enzima. Como se expresara anteriormente, existen tres tipos de ADN-polimerasa. Entre ellas, la ADN polimerasa I es la encargada de reparar la hebra, degradando el cebador, por lo que actúa como una enzima exonucleasa. Esta enzima es capaz de agregar o sustituir bases. La ADN polimerasa III es la que realiza la síntesis propiamente dicha con la acción conjunta de la enzima ADN polimerasa II. En el siguiente esquema se puede observar la secuencia de pasos de la duplicación del ADN. Observe la síntesis continua en la hebra líder, catalizada por la ADN polimerasa III. En la hebra rezagada se indican con números las diferentes etapas de la síntesis.

20 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 19 Duplicación del ADN. Las helicasas y topoisomerasas se asocian en un extremo de la horquilla de replicación, separando las hebras complementarias. Las proteínas SSB impiden que ambas hebras se replieguen sobre sí mismas. 1. La primasa sintetiza el cebador. 2. La ADN polimerasa III sintetiza la hebra complementaria al molde, originando la cadena líder y los fragmentos de Okasaki (en la hebra rezagada). 3. La ADN polimerasa I elimina el cebador (actividad de exonucleasa) y completa el sector con nucleótidos de ADN en la cadena rezagada. 4. La ligasa une finalmente los fragmentos de Okasaki. En qué momento se organizan los nucleosomas? Recordemos que el ADN eucarionte está asociado a proteínas histónicas formando los nucleosomas. Existe evidencia experimental para inferir que las histonas se acoplan a las nuevas moléculas de ADN a medida que se va replicando. Estas proteínas son las únicas que son sintetizadas en la etapa S del ciclo celular y se asocian rápidamente a la hélice en crecimiento.

21 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 20 En el esquema se observa cómo el octámero de histonas se asocia a la molécula bicatenaria que se está sintetizando, formando los nucleosomas. Se propone que las histonas pertenecientes a la molécula original pasan a formar parte de la molécula sobre la que se forma la hebra líder o continua. Sobre la otra hebra del ADN, donde se sintetiza la hebra rezagada o discontinua, se asocian histonas nuevas. La replicación llevada a cabo por la ADN-polimerasa es un proceso muy exacto, sobre todo por su actividad autocorrectora. Sin embargo, aún así se produce un error de apareamiento por cada 10 7 pares de bases. En una bacteria esto podría resultar suficiente debido a que su cromosoma sólo posee pares de bases. Sin embargo en el ADN humano existen pares de bases y durante el desarrollo embrionario, a partir del zigoto, el ADN humano se duplica veces, por lo que la información genética pronto se perdería. Esquema de la horquilla de replicación de una molécula de ADN perteneciente a un organismo eucarionte. Para aumentar más todavía la perfección de la replicación del ADN existe un complejo enzimático que detecta el nucleótido cuya base no está correctamente apareada, lo elimina y regenera la secuencia correcta. De este modo se logra bajar esta tasa de errores en uno por cada pares de bases. Este proceso se conoce con el nombre de corrección postreplicativa. Cuándo comienza la etapa S? El control de la fase S y el inicio de la replicación Los mecanismos de replicación del material genético y su regulación presentan factores que determinan su inicio y control. El Modelo del Replicón, inicialmente propuesto para la bacteria Escherichia coli, propone la existencia de secuencias de ADN que determinan el inicio de la replicación. Estas secuencias fueron identificadas en S. cerevisiae y se conocen como Secuencias de Replicación Autónoma (SRA), las cuales coinciden con los orígenes de replicación.

22 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 21 Los cromosomas de eucariontes son demasiado largos para ser replicados a partir de un solo sitio de origen (como ocurre en procariontes) por lo que contienen varios puntos de origen de la replicación. Las proteínas que indican el sitio de origen de la replicación (CRO) permanecen unidas a los orígenes de replicación durante todo el ciclo celular, pero el resto de las proteínas iniciadoras forman o no parte del complejo, dependiendo de la etapa del ciclo celular. Los trabajos de Bell y Stillman de 1993 describieron un complejo de 6 proteínas que reconocen los orígenes de replicación, denominado Complejo de Reconocimiento del Origen (CRO). Estas proteínas son esenciales para la viabilidad celular y necesarias para iniciar la replicación del ADN. Posteriormente, se han descubierto otras proteínas iniciadoras. De este modo, se determina un estado postreplicativo durante las fases S, G2 y M (sólo permanecen unidas a los orígenes las proteínas CRO únicamente) y un estado pre-replicativo, durante G1 (cuando el resto de las proteínas iniciadoras forman parte del complejo). El inicio de la replicación del material genético marca la transición entre el estado de complejo pre-replicativo (pre-rc) a complejo post-replicativo (post-rc). Complejo post-replicativo (CRO) Complejo pre-replicativo Esquema de los complejos post-replicativos (arriba) y pre-replicativo (abajo).

23 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 22 Relación entre el inicio de la fase S y el ciclo celular Los procesos de fosforilación de las diferentes proteínas que se unen al ADN para regular su duplicación, y la actividad de diferentes ciclinas, controlan la expresión de los genes necesarios para la replicación. Por otro lado, la conversión de complejos post-replicativos a pre-replicativos ocurre en la transición entre la división celular y la etapa G1. Durante la etapa G1, todo el complejo de proteínas reguladoras se encuentra unido al ADN impidiendo su replicación. Cuando estas proteínas se separan y solo permanece el CRO unido al ADN, comienza la etapa S. Cuando el complejo proteico vuelve a unirse al CRO, se reinicia la etapa G1. Enrollamiento del ADN eucarionte En las células eucariontes, el ADN se encuentra asociado a moléculas proteicas, las histonas, formando los nucleosomas (ver Unidad 8, Ciclo Celular, Interfase). Durante la interfase, el ADN unido a las histonas se presenta como largos y delgados filamentos, de aspecto difuso y granulado, formando la cromatina. Una vez concluida la fase S, el ADN duplicado (y unido a las histonas) se condensa gradualmente y comienza a formar estructuras más compactas, de menor longitud, que pueden observarse al microscopio óptico: los cromosomas. ADN asociado a histonas

24 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 23 Existen sucesivos niveles de enrollamiento del ADN que culminan con la formación de los cromosomas observables durante la etapa de división celular (mitosis o meiosis). Solenoide (30 nm de diámetro) Cromosoma La molécula de ADN se enrolla alrededor de las histonas y forma los nucleosomas. Después de la etapa S, el enrollamiento continúa, formando estructuras cada vez más compactas y de mayor diámetro. Finalmente, la molécula super-enrollada forma una cromátida. Como el ADN se ha duplicado en la etapa S, la cromátida, con su duplicado, forma el cromosoma, observable durante la división celular.

25 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 24 Durante las etapas G1 y S, el ADN permanece enrollado a nivel de nucleosomas, y es el estado en el cual son posibles los procesos de Trascripción y de Replicación. El enrollamiento permite que grandes cantidades de ADN puedan caber en el pequeño espacio que posee el núcleo. El empaqueta-miento del ADN tiende a impedir la expresión de la información genética pues, ya a nivel de los nucleosomas, las histonas deben aflojar el paquete para que pueda producirse la trascripción. Las células pueden hacer uso de niveles más altos de empaquetamiento para la inactivación de lo genes a largo plazo. La cromatina altamente compactada, no solamente se encuentra en los cromosomas durante la división celular, sino también en diversas regiones del material genético en interfase y, por lo tanto, no se expresa. Los distintos niveles de empaquetamiento del ADN reciben nombres diferentes. El primer nivel, como ya se ha indicado, lo constituyen los nucleosomas, las unidades de enrolamiento de la cromatina. Están formados por un centro o core de histonas H2A, H2B, H3 y H4, y poseen dos copias de cada una. Alrededor de ese centro se enrollan dos vueltas de ADN. Una quinta histona, la H1, sella la unidad y permite la conexión entre nucleosomas formando una estructura conocida como fibra de 11 nm. Un caso interesante lo constituyen las hembras de los mamíferos, donde en cada célula somática el cromosoma X (cromosoma sexual) está altamente compactado y se encuentra casi en su totalidad inactivo, incluso durante la interfase. Esta desactivación del cromosoma X se inicia en etapas tempranas del desarrollo embrionario, cuando en cada célula uno de los dos cromosomas X, de manera aleatoria, se desactiva. Las histonas H1 contribuyen a mantener juntos a los nucleosomas, formados por dos copias de histonas H2A, H2B, H3 y H4 (octámero) y dos vueltas de ADN cada uno.

26 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 25 El siguiente nivel de empaquetamiento lo constituyen los solenoides o fibras de 30 nm que se distribuyen alrededor de un eje imaginario. El nivel que sigue es el de los bucles o lazos, que consiste en una serie de asas de unos 300 nm de diámetro. Finalmente, éstos se superenrollan y forman los cromosomas, que consisten en dos moléculas de ADN (idénticas, ya que ocurrió la replicación en la etapa S), unidas por una estructura llamada centrómero o constricción primaria. En algunos cromosomas pueden observarse otras constricciones que unen una pequeña porción del cromosoma llamada satélite, relacionada con las regiones donde se forma el nucleolo (organizadores nucleolares) Niveles de enrollamiento de la cromatina. Un fragmento de ADN (1) se enrolla alrededor de histonas y forma nucleosomas (2). Luego, éstos se organizan en solenoides (3), que se compactan en lazos o bucles (4) y, finalmente, forman un cromosoma.

27 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 26 No todas las moléculas de ADN tienen el mismo número de nucleótidos, y por lo tanto, no todos los cromosomas alcanzarán el mismo tamaño. Además, la posición del centrómero puede variar en los distintos cromosomas. De acuerdo con estas variables, se utiliza una clasificación de cromosomas. Así, los cromosomas pueden agruparse en: - metacéntricos: el centrosoma se encuentra en la mitad del cromosoma, determinando brazos de igual longitud. El brazo es la porción de cada cromátide que se extiende desde el centrómero hasta la región terminal del cromosoma, llamada telómmero. - submetacéntricos: un par de brazos es ligeramente más corto que el otro - acrocéntricos: un par de brazos es mucho más corto que el otro - telecéntricos: el centrómero se encuentra totalmente desplazado hacia un extremo, observándose un solo par de brazos. Tipos de Cromosomas Según la posición del centrómero, los cromosomas se clasifican en distintos grupos. Obsérvese que la constricción primaria es el centrómero, pero puede haber constricciones secundarias, que determinan porciones cromosómicas llamadas satélites, relacionadas con la organización del nucleolo.

28 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 27 En la naturaleza, cada especie posee, en sus células somáticas, un número característico de cromosomas de diferentes tipos. La representación gráfica de ese número se llama cariotipo. El análisis del cariotipo constituye una de las técnicas utilizadas en la investigación científica y en el diagnóstico de enfermedades genéticas humanas. Bandas en un cromosoma Para realizar el cariotipo, se procede a teñir células y, como resultado de esa tinción, pueden observarse bandas en los cromosomas, que corresponden a regiones ricas en pares Adenina-Timina. Dichas regiones de color oscuro se denominan bandas G y son características de cada especie. En 1968 se obtuvo el primer éxito en el intento de visualizar diferencias de tinción en los cromosomas. Esta técnica, denominada bandeo, fue desarrollada por Casperson en la década de 1970, y demostró que los cromosomas se tiñen a lo largo de manera irregular. Existen distintos tipos de bandeo según el colorante y el procedimiento empleado. Mediante esta técnica se pueden distinguir la eucromatina y la heterocromatina, y otras características estructurales. Cariotipo Cariotipo de un individuo humano de sexo masculino (contiene un cromosoma Y). Consta de 23 pares de cromosomas. Los pares 1 a 3 son metacéntricos; el 4 y 5 submetacéntricos; el 6 a 12 y el X, submetacéntricos; el 13 a 15, acrocéntricos; el 16 a 18 submetacéntricos a acrocéntricos; el 19 y 20 submetacéntricos y el 21, 22 y el Y, acrocéntricos.

29 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 28 Los cromosomas de un cariotipo humano se obtienen a partir de células de la médula ósea, fibroblastos o glóbulos blancos, que, con la droga colchicina, son bloqueadas durante la división celular, el período de la metafase. Luego se analizan las células en el microscopio óptico y se las fotografía, recorta y ordenan los cromosomas de a pares según su tamaño. También se pueden obtener cromosomas del líquido amniótico del útero para realizar un diagnóstico prenatal. Los cromosomas humanos se clasifican en seis grupos según el alfabeto, de A a G, de acuerdo con su tamaño y la ubicación del centrómero. GRUPO CROMOSOMAS Nº TAMAÑO A 1 a 3 GRANDE B 4-5 GRANDE C 6 a 12 y X MEDIANO D 13 a 15 MEDIANO E 16 a 18 MEDIANO - PEQUEÑO F PEQUEÑO G Y PEQUEÑO EI cariotipo también permite reconocer anormalidades en el número de cromosomas, como excesos o defectos. Un ejemplo de exceso en el número de cromosomas se manifiesta en el Síndrome de Down, donde los individuos que presentan un cromosoma de más en el par 21, sufren retraso mental, entre otras anomalías.

30 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 29 El Proyecto Genoma: la investigación del ADN humano El proyecto GENOMA HUMANO tiene como objetivo último la determinación de la secuencia de todos los nucleótidos que componen el genoma de la especie humana. Este proyecto, iniciado en el año 1990, se dividió en tres subproyectos específicos. El primero de dichos subproyectos fue el mapa genético humano, consistente en la obtención de marcadores o variables en la población, regularmente espaciados a lo largo de los distintos cromosomas. El segundo fue la obtención del mapa físico humano o colección ordenada de clones de ADN (copias de fragmentos genómicos) que abarcaran todos y cada uno de los cromosomas. El tercero y último subproyecto consistía en la secuenciación del genoma humano y caracterización estructural de todos los genes que lo componen. Los mapas genético y físico han sido realizados de acuerdo a los objetivos inicialmente propuestos. No obstante, el mapa físico completo, si bien ha proporcionado una colección de secuencias únicas que constituyen excelentes marcas genómicas, consta de clones no aptos para su secuenciación directa debido a su gran tamaño y a la presencia de deleciones en los mismos. Por ello, la secuenciación del genoma humano se inició a partir de clones más pequeños (llamados cósmidos) de localización conocida, pero ha sido sólo tras el desarrollo de unos nuevos vectores, denominados cromosomas artificiales de bacteria (BACs), y se prevé la finalización de este objetivo último para el año Asimismo, se ha llevado a cabo un proyecto encaminado a determinar la totalidad de las secuencias de ADN expresadas (ESTs), lo que ha permitido marcar los genes humanos y estimar su número. La información proporcionada por el proyecto GENOMA HUMANO permitirá abordar el estudio de las distintas funciones del ADN, y, en particular de todos sus genes. Estos proyectos no sólo son importantes en el estudio biológico de dichos organismos, sino que además permitirán acelerar el análisis de la función de genes humanos. Asimismo, cabe destacar los proyectos de secuenciación de determinados virus por su contribución al desarrollo de terapias y al conocimiento del sistema inmune. La aplicación por excelencia del proyecto GENOMA HUMANO se encuentra dentro del campo de la Medicina. Consideremos, por ejemplo, una familia en la que algunos de sus miembros padecen o presentan predisposición a cierta enfermedad. La existencia del mapa genético humano proporciona la herramienta necesaria para asociar el fenotipo de la enfermedad con un marcador polimórfico y determinar la región genómica donde se encuentra el gen responsable de la alteración genética observada. El conocimiento de los genes existentes en esa región, obtenido tras la secuenciación del genoma, permitirá disponer de genes candidatos, entre los cuales se podrá distinguir fácilmente el causante de la enfermedad; una vez determinado dicho gen, se podrá llevar a cabo el diagnóstico inequívoco de la enfermedad asociada, así como analizar la función del gen para futuros ensayos de terapia farmacológica y génica. Independientemente de su contribución a los campos biológico y clínico, este proyecto ha impulsado el desarrollo de una serie de tecnologías y programas informáticos que permiten la generación y análisis de un gran número de datos con la precisión y eficacia requeridas. En este sentido, cabe destacar la creación de secuenciadores automáticos, estaciones robóticas, ordenadores y, recientemente, equipos que cuantifican la expresión génica. Esto ha desembocado en la puesta a punto de Servicios de Secuenciación de ADN y Análisis Genéticos, que realizan de forma rutinaria una serie de técnicas de genética y biología molecular, facilitando así la labor de la comunidad científica y médica.

31 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 30 PROBLEMAS de APLICACIÓN 1. Indique a qué fase del Ciclo Celular corresponde cada uno de los siguientes procesos: a. Replicación de las regiones heterocromatínicas. b. Regulación del Ciclo Celular. c. Finalización de la replicación de todo el ADN. d. Detención del Ciclo Celular. 2. Ubique los siguientes sucesos en el orden cronológico correcto: a. Unión de d-ribonucleótidos por complementariedad de bases. b. Acción de las helicasas. c. Formación de enlaces fosfodiester entre d-ribonucleótidos. d. Acción de las ligasas. e. Formación de los fragmentos de Okasaki. 3..Indique si la siguiente afirmación es correcta o no y justifique su elección: El nucleolo es una región del núcleo que no contiene información genética 4. Compare los Complejos Pre y Post-replicativos en cuanto a: a. Momentos del Ciclo Celular en que actúan b. Proteínas que los forman c. Función de cada uno 5. Compare la función de la Topoisomerasa con la de la Proteína SSB. 6..Observe el esquema referente al Cariotipo Humano y complete el siguiente cuadro: GRUPO CROMOSOMAS Nº TAMAÑO UBICACIÓN DEL CENTRÓMERO A 1 a 3 METACÉNTRICOS B 4-5 GRANDE C 6 a 12 y X SUBMETACÉNTRICOS D 13 a 15 ACROCÉENTICOS E 16 a 18 F G Y MEDIANO - PEQUEÑO SUBMETACÉNTRICOS a ACROCÉNTRICOS ACROCÉNTRICOS CON SATÉLITE NO POSEE SATÉLITE

32 Hecho el depósito que marca la ley Prohibida su reproducción total o parcial. 31 AUTOEVALUACIÓN 1. Señale la opción correcta respecto de a la síntesis de proteínas y la replicación del ADN: a. El primer proceso ocurre en G1 y G2 y el segundo en la etapa S b. El primer proceso ocurre en G1 y el segundo en S c. Ambos procesos ocurren durante toda la interfase d. El primer proceso ocurre durante toda la interfase y el segundo en la etapa S 2. El nucleosoma es: a. un conjunto de proteínas capaces de unir una molécula de ADN b. un conjunto de proteínas capaces de unir ARN pequeño nuclear c. la unidad de enrollamiento de la cromatina d. ADN super-enrollado 3. Durante la replicación del ADN, todos los segmentos de ARN: a. corresponden a cebadores sintetizados por la ADNpolimerasa b. aportan el extremo 3 -oh para que pueda actuar la ADNpolimerasa c. son los llamados fragmentos de Okazaki d. se encuentran únicamente en la cadena nueva de la molécula de ADN hija 4. La secuencia de nucleótidos específicos donde se inicia la replicación del ADN se conoce como: a. horquilla de replicación b. origen de replicación c. complejo de reconocimiento d..fragmento de Okazaki 5. La cromatina y los cromosomas se diferencian en : a. los genes que los componen. b. la cantidad de ADN. c. en el grado de empaquetamiento. d. en sus componentes básicos. 6. El ADN, en su estado de máxima condensación : a. no podrá expresarse pero si duplicarse. b. podrá expresarse pero no duplicarse. c. podrá expresarse y duplicarse d. no podrá expresarse (transcribirse) ni duplicarse 7..La helicasa abre la cadena de ADN: a. rompiendo los enlaces covalentes entre las bases nitrogenadas. b. rompiendo los enlaces débiles entre las bases nitrogenadas. c. al mismo tiempo que disminuye el super-enrollamiento de las cadenas. d. al mismo tiempo que se liga a ambas hebras impidiendo que se unan. 8..Las ligasas: a. reemplazan al cebador por ADN y luego lo unen a la cadena de ADN contigua b. unen las cadenas nuevas de ADN de la hebra rezagada. c. unen un cebador a un fragmento de Okasaki. d. contribuyen a unir las cadenas complementarias tras la duplicación. 9. Señale la opción correcta: a. Las bandas cromosómicas corresponden a regiones ricas en G-C b. Un cromosoma con dos brazos será telecéntrico c. Los satélites son constricciones primarias d. En el cariotipo humano no se observan cromosomas metacéntricos. 10. El nivel de empaquetamiento que sigue a los solenoides es: a. nucleosomas b. cromosoma c. cromátida d. bucle o lazo