HEPATITIS B. Aplicación de la biología molecular

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1 HEPATITIS B Aplicación de la biología molecular Bioq Mariángeles Auat Bioq Diego J. Fernández

2 VIRUS HEPATITIS B (VHB) Miembro de la familia Hepadnaviridae. Virus de DNA doble cadena pares de bases y 42 nm de diámetro. 8 variantes genómicas (A H). Posee un intermediario RNA para su replicación. Utiliza una transcriptasa inversa.

3 VIRUS HEPATITIS B (VHB)

4 VIRUS HEPATITIS B (VHB) ANTIGENO HBsAg HBcAg HBeAg CARACTERISTICAS Antígeno de la envoltura viral. Antígeno asociado con el core del VHB. Antígeno soluble relacionado con la región pre core. Beckenbaum S, Sotiropoulos GC et al. Hepatitis B and liver tranplantation: 2008 update, Rev Med. Virol. 2009; 19:7-29.

5 VIRUS HEPATITIS B (VHB) Cadena L (-) HBcAg - HBeAg Cadena S (+) HBsAg Proteína X Polimerasa

6 CICLO DE REPLICACION VIRAL Reciclaje Entrada Cadena - Cadena + Unión a RE Transporte Vesicular Traducción Citoplasma Transcripción cccdna Núcleo Reparación Hepatitis B virus Infection Natural History and clinical consequences. Ganem D. NEJM 2004; 350:

7 Majon BJ. Epidemiology and Natural history of hepatitis B.Semin Liver Disease. 2005;25 (suppl 1) : 3-7

8 GENOMA DEL VHB MUTANTE REGIÓN MUTADA MECANISMO AGENTE OPORTU NIDAD FRECUEN- CIA HBeAg menos Gen pre-core Presión Inmune (selección) Respuesta natural o inducida por tratamiento Infección Crónica Alta YMDD Gen Pol Terapéutico (resistencia) Lamivudina Infección Crónica Alta Superficie Gen S Presión Inmune (selección) HBIG o Vacuna Inmunización en zonas endémicas Baja

9 VIRUS HEPATITIS B (VHB)

10 EPIDEMIOLOGÍA MUNDIAL

11 EPIDEMIOLOGIA (ARGENTINA) El 2% de la población general está infectada y el 0.5% de los adultos es portador. La mayor prevalencia se da en los trabajadores de la salud. Existen alrededor de portadores, de los cuales sólo tienen diagnóstico. El 66% de los que cursan la enfermedad lo hacen de forma asintomática, por lo que los riesgos de sus contactos son muy altos.

12 VIAS DE INFECCIÓN Vertical o Perinatal: Vía principal en zonas endémicas. Horizontal: Exposición nosocomial: Por contacto parenteral/sexual con personas infectadas. Accidentes con agujas u otro tipo de exposición percutánea o permucosa

13 GRUPOS DE RIESGO Adictos a drogas por vía intravenosa Profesionales de la salud Individuos con conducta sexual de riesgo Recién nacidos de madres infectadas Pacientes en hemodiálisis Pacientes transfundidos

14 PATOGENESIS El VHB no es directamente citotóxico La RESPUESTA INMUNE es la RESPONSABLE de la INJURIA HEPATOCELULAR La respuesta inmune puede ser: Humoral: Ac vs HBsAg. Neutralizan su acción. No son eficaces en erradicar la infección por si solos. Celular: Responsable tanto de la sintomatología como de la resolución de la infección.

15 HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN La infección por VHB tiene tres etapas. La duración de cada una de ellas depende de: La respuesta inmunológica del individuo Su edad en el momento de la infección Y con qué cepa o genotipo del virus de la hepatitis B se infectaron.

16 HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN Fase I: Inmunotolerancia Fase II: Depuración Inmunológica Infección Aguda Infección Crónica Fase III: De baja replicación Estas etapas se hacen más evidentes en el curso de la infección crónica. La transición de una etapa a otra NO es LINEAL

17 HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN FASE DE INMUNOTOLERANCIA El sistema inmunológico básicamente ignora la infección por VHB. Hay una falta o una muy débil respuesta inmune contra hepatocitos infectados Infección aguda: corresponde al periodo de incubación En la infección crónica adquirida perinatalmente puede durar años (15 a 20 años) Daños hepáticos mínimos.

18 HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN FASE DE DEPURACIÓN INMUNOLÓGICA El sistema inmunológico finalmente reconoce al virus (ALT/AST ELEVADAS) En la infección aguda corresponde al periodo de síntomas clínicos (3 4 semanas) En la infección crónica puede durar de meses a años. En la infección adquirida perinatalmente esta etapa se observa en la adolescencia o adultez. La mayor parte del daño hepático tiene lugar durante esta fase. Aparición de mutantes e menos por selección natural, evaden el sistema inmune.

19 HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN FASE DE BAJA REPLICACIÓN El virus disminuye la tasa de replicación. Desaparición HBeAg y aparición anti-hbe. Puede detectarse ADN-VHB por técnicas sensibles de biología molecular. En esta etapa no se produce daño hepático. Pueden existir brotes de reactivación (por inmunosupresión) Retorno a la fase de depuración inmunológica.

20 70% <5 años 10% perinatal Infección Aguda Niños Infección Aguda en el Adulto > 95% Resolución 30% <5 años 90% perinatal < 5% Resolución Infección Crónica Infección Crónica ~ 3 % Hepatitis Crónica 2-10 % Cirrosis ~ 3 % Portador Crónico Inactivo 2-8 % ~ 1 % Muerte Trasplante HCC

21 INFECCIÓN AGUDA Título HBeAg HBsAg Síntomas IgM anti-hbc Malestar general. Fatiga, artralgias, síntomas anti-hbedigestivos, Coluria, ictericia, acolía, Hígado doloroso Total anti-hbc Anti-HBs semanas

22 Infección Persistente HBsAg (+) > 6 meses Portador Crónico ALT-AST dentro del rango de Ref. Biopsia hepática normal Hepatitis Crónica Función hepática anormal Histología alterada Con replicación viral Sin replicación viral HBeAg + HBeAg - Corresponde a la fase de tolerancia inmunológica Se da en infecciones perinatales Luego de la etapa de depuración inmunológica. Virus salvaje Virus mutante Aparece por presión inmune/tto. No se descarta primoinfección

23 INFECCIÓN CRÓNICA Serología HBsAg HBeAg Anti-HBe Anti-HBs ALT ADN-VHB (viremia) c/ml c/ml <10 5 c/ml Reactivación >10 5 c/ml Lesión Inflamación mínima Hepatitis crónica activa Inflamación mínima/cirrosis Normal a cirrosis Estadio cronicidad Inmunotolerante (fase I) Aclaramiento inmune (fase II) Portador inactivo (fase III) Resuelta Años Proceso dinámico caracterizado por fases replicativas y no replicativas según la interacción virus-huésped

24 HEPATOCARCINOMA CELULAR (HCC) La incidencia de HCC varía con la geografía, la etnia, la edad y el sexo. La frecuencia de HCC sigue la misma distribución geográfica que la infección por HBV. El 80% de los cáncer de hígado se deben a HBV. Integración del genoma viral y activación de oncogenes. La vacuna ha ejercido un efecto preventivo considerable en el desarrollo del HCC.

25 Laboratorio

26 LABORATORIO 1. Pruebas Bioquímicas 2. Serología 3. Biología molecular - CARGA VIRAL

27 BIOQUÍMICA DEL HÍGADO Transaminasas: ALT/AST Bilirrubinemia FAL GGT ALBUMINA COLESTEROL TIEMPO DE PROTROMBINA Hepatitis Aguda: Incrementos de 20 a 100 veces el valor de referencia Hepatitis crónica: Se elevan entre 2 y 10 veces el valor de referencia Valoran el grado de insuficiencia hepática

28 LABORATORIO Serología SUPERFICIE CORE SISTEMA E Antígeno HBsAg Infectividad HBcAg No se encuentra en circulación HBeAg Replicación Anticuerpo Anti-HBs Resolución/Inmunidad Anti-HBc Contacto Anti-HBe Puede indicar cese de replicación La existencia de Mutantes HBeAg menos nos impide afirmar que la desaparición de HBeAg y la presencia de Anti-HBe indica ausencia de replicación viral. El HBeAg no aparece en ausencia de HBsAg

29 LABORATORIO Estos marcadores son detectados por inmunoensayos competitivos y no competitivos. Enzimoinmunoanálisis de micropartículas (MEIA). Axsym-Abbott Ensayo no competitivo tipo sandwich 1. Incubación muestra 3. Lavado para eliminar el material no unido. Agregado del Ac. marcado con FAL 2. Formación inmunocomplejos (IC) Unión irreversible del IC a fibras de vidrio. 4. Se agrega el sustrato MUP y se mide el producto fluorescente MU

30 PRUEBAS SEROLÓGICAS Prueba Tipo de ensayo Sensibilidad Especificidad Resultados HBsAg No competitivo 100% 99,6% Cualitativos R/NR Anti-HBs No competitivo 100% 100% Cuantitativos UI/l Anti- HBc No competitivo 98,6% 100% Cualitativos R/NR HBeAg No competitivo 99,6% 99,5% Cualitativos R/NR Anti-HBe Competitivo 100% 99,8% Cualitativos R/NR Según insertos Axsym - Abbott

31 HBsAg negativo HBsAg positivo Hepatitis Cronica INTERPRETACION RESULTADOS Contacto Hepatitis Portador Vacunado pasado Aguda (virus Tolerante (virus salvaje) Hepatitis Cronica mutante) Portador inactivo HBsAg Anti- HBs Anti- HBc HBeAg Anti- HBe ADN- VHB ALT

32 PERFILES INUSUALES 1- Anti-HBc (+) aislado 1. Infección muy lejana con pérdida del Anti-HBs 2. Falso positivo metodológico 3. Paciente con infección Oculta (HBsAg negativo) Anti HBs +++ Anti-HBs + Anti-HBs - Evaluar infección por HIV y HCV La coinfección con HCV puede interferir en la síntesis de HBsAg. Presencia de FP para Anti-HBc en asociación con coinfección HIV/HCV.

33 PERFILES INUSUALES 2- HBsAg ( ) y HBeAg (+) La OMS y el fabricante sugieren, en estos casos, repetir la prueba en una nueva muestra. WHO/CDC/CSR/LYO/2002.2:HepatitisB Perfiles Inusuales CARGA VIRAL?

34 Métodos disponibles Hibridación Molecular LABORATORIO Biología molecular - Carga Viral 1- Hibridación Líquida (Genostics, Abbott) 2- Ensayo de captura del hibrido (Digene) 3- Branched DNA (Versant HBV-Bayer) Methods in Molecular Medicine, vol. 95: Hepatitis B and D Protocols, volume 1

35 LABORATORIO Biología molecular - Carga Viral Amplificación del DNA del VHB 1. PCR cuantitativa Cobas Amplicor Monitor (Roche) 2. Real time PCR - Taq Man Real time PCR-TaqMan

36 Cobas Amplicor Monitor (Roche) Amplificación por PCR ( DNA del VHB y estándar interno) Detección de los amplicones ( DNA del VHB y estándar interno)

37 Cuantificación del ADN del VHB Cálculo de los resultados DO HBV (A 660nm) DO QS (A 660nm) X moléculas ADN QS Ventajas del uso de QS (estándar interno o de cuantificación): 1. Compensa las diferencias en la eficiencia de extracción del DNA entre las muestras 2. Detecta posibles inhibidores en la mezcla de reacción. Inhibidores más comunes de PCR: Heparina, Talco, Saliva

38 Unidades empleadas: Expresión de los resultados Ejemplo 1. Copias ADN-VHB/ ml copias/ml (10 7 ) 2. Log 10 log 6,8 3. UI/ml UI/ml Falta de estandarización en los resultados entre los distintos métodos. OMS (2001) crea un estándar internacional asignándole un valor de UI/ml (10 6 UI/ml) (Saldanha et al., Vox Sang 2001;80:63 71) Cada prueba debe convertir sus datos a UI. Cobas Amplicor HBV Monitor (Roche) 1 UI/ml = 5.6 copias/ml Permitirá comparar los datos de diferentes laboratorios.

39 DIFERENCIAS EN LA SENSIBILIDAD Y RANGO LINEAL ENTRE LOS DISTINTOS METODOS

40 UTILIDAD DE LA CARGA VIRAL 1- DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR VHB Útil para Dx de Hepatitis crónica HBeAg(-). Perfiles serológicos inusuales?? 2- EVALUACIÓN Y PRONÓSTICO Niveles séricos DNA-VHB > 10 4 copias/ml UI/ml es un predictor de riesgo significativo para el desarrollo de cirrosis y CHC. La relación es independiente del estado del HBeAg y del nivel de ALT. JAMA. 2006;295(1):65-73 Gastroenterology 2006;130: TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN CUANDO TRATAR SELECCIÓN DE LA TERAPIA. ADN-VHB: 10 9 (J Antimicrob. Chemotherp.) MONITOREO Respuesta virológica Journal of Hepatology 39 (2003) S31 S35

41 TRATAMIENTO Objetivo Evitar la progresión a cirrosis hepática y CHC. Supresión de la replicación viral sostenida Normalización de las transaminasas En pacientes con HBeAg (+) la seroconversión Idealmente la seroconversión del HBsAg. A quien tratar? Pacientes con riesgo de progresión de la enfermedad. Hepatitis Crónica HBeAg (+) y HBeAg (-)

42 TRATAMIENTO Guías de consenso con recomendaciones HBeAg (+) HBeAg (-) ADN-VHB ALT ADN-VHB ALT > UI/ml > 2x VSR > 2000 UI/ml > 2x VSR AASLD 2007 > UI/ml < 2x VSR Biopsia inflamación y fibrosis > 2000 UI/ml < 2x VSR Biopsia inflamación y fibrosis Hepatology 2007; 45:507-39

43 TRATAMIENTO Criterios de respuesta al tratamiento Criterios de Respuesta Bioquímico Virológico Serológico Histológico Criterios de Respuesta al Tratamiento Parámetro Normalización o mejoría de las aminotransferasas Disminución del DNA-VHB (caída 1 log) Seroconversión del HBeAg y HBsAg Disminución o desaparición de la actividad necroinflamatoria o fibrosis El monitoreo de la carga viral durante el tratamiento debe hacerse siempre con el mismo método

44 Drogas usadas TRATAMIENTO Inmunomoduladores (vía subcutánea Tto. limitado) IFN IFN pegilado: unido a una molécula de polietilenglicol que produce una molécula de mayor tamaño con disminución de su excreción renal y prolongación del efecto biológico Análogos de nucleósidos/nucleótidos (vía oral Tto. prolongado) Son moléculas VIROSTÁTICAS. Inhibición competitiva de la ADNpol. Lamivudina: se asocia a una alta tasa de desarrollo de resistencia (70% a los 4 años) Adefovir, ENTECAVIR, Telbivudina.

45 Caso Clínico

46 CASO CLINICO Paciente de sexo femenino, de 20 años de edad que ingresa en enero 2009 al servicio de Hepatologia- Trasplante hepatico Tiene antecedentes de atresia de vías biliares corregida a los 2 meses de vida en el Hospital Gutiérrez. Presentó 3 episodios de hemorragia digestiva alta por varices esofágicas secundarias a Hipertensión portal que requieren tratamiento endoscópico. Al año se presenta con múltiples episodios de infecciones urinarias y un estadío cirrótico avanzado. Es así que se decide PLAN DE TRASPLANTE HEPATICO. Se realiza protocolo pre trasplante.

47 PERFIL DE LABORATORIO AST (UI/L) ALT (UI/L) BT (mg/dl) BD (mg/dl) BI (mg/dl) FAL (UI/L) GGT (UI/L) PT (g/dl) ALB (g/dl) 2.8 3

48 PERFIL DE LABORATORIO HBsAg No Reactivo No Reactivo Anti-HBc (total) No Reactivo No Reactivo Anti-HBs Reactivo Reactivo HBeAg Reactivo Reactivo Anti-HBe No Reactivo No Reactivo HCV No Reactivo - AFP PERFIL INUSUAL NUEVA MUESTRA

49 PERFIL DE LABORATORIO Carga viral: No detectable por método de amplificación Cobas Amplicor Monitor (Roche) Carga viral: No detectable por método de amplificación Cobas Amplicor Monitor (Roche) Se descarta infección por VHB. La posibilidad de la presencia de FP para HBeAg repetidamente esta descripto en el inserto de la prueba. El 3,42% (8/234) presentaron HBeAg(+) repetidamente en ausencia de HBsAg. Axsym Abbott HBe 2.0

50 Conclusiones

51 CONCLUSIONES Es imprescindible el uso de técnicas de Biología Molecular en el diagnóstico, pronóstico y monitoreo del tratamiento de la infección por VHB. Evaluamos la utilización de la carga viral en dilucidar perfiles serológicos inusuales. Se aspira a que las técnicas moleculares tengan mayor sensibilidad y una mayor amplitud en el rango lineal (Real time PCR Taq Man) y además lograr estandarizar los resultados con el uso universal de estándares internacionales. Genotipificación a futuro.

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