Bioquímica Frazer Paula

Transcripción

1 Bioquímica Frazer Paula

2 Proceso perfectamente coordinado de acontecimientos moleculares en los que participan los gametos masculinos y femeninos e implica la coincidencia en espacio y tiempo de los mismos. Se inicia con la adhesión de los espermatozoides a la zona pelúcida del ovocito y finaliza con la primera división normal del cigoto. El proceso natural de fecundación en el ser humano es casi desconocido.

3 Los gametos deben haber completado sus etapas de maduración. En el tracto genital femenino los espermatozoides sufren un proceso de activación caracterizado por: un cambio de permeabilidad de la membrana a los iones calcio la adquisición de una movilidad hiperactiva.

4 Interacción espermatozoide-cúmulo Interacción espermatozoide-zona pelúcida Incorporación del espermatozoide al ovoplasma Activación ovocitaria Formación de pronúcleos

5 Los espermatozoides (EZ) ascienden hacia las trompas de Falopio por las contracciones peristálticas de las mismas. Pueden ayudar a dirigir a los EZ hacia el centro de la masa, la disposición radial de las células que rodean al ovocito la presencia de glicosaminoglicanos en la matriz extracelular.

6 Los EZ atraviesan las células del cúmulo gracias a los movimientos flagelares. Gran cantidad de EZ sufren la reacción acrosomal, hialuronidasa terasa

7 Algunos EZ consiguen atravesar el cúmulo con el acrosoma intacto. La zona pelúcida es una matriz de glicoproteínas que sintetiza y segrega el ovocito en crecimiento. Esta compuesta por: ZP1 estructural ZP2 anclaje ZP3 reconocimiento

8 Sólo los EZ con el acrosoma intacto pueden unirse al ZP3. Tras la unión la ZP3 inicia la reacción acrosomal en el espermatozoide. Se producen una serie de cambios: Aumenta la permeabilidad del Na + hacia el interior del espermatozoide. Ingresa Ca ++. La expulsión de protones provoca el aumento de ph que permite que se fusionen las membranas. La fusión se realiza en varios puntos, liberándose el contenido acrosomal rápidamente, que digiere la membrana pelúcida.

9 Contacto inicial de la cabeza espermática con la membrana plasmática ovocitaria. Los movimientos del flagelo se detienen después de la fusión de membranas. La membrana acrosomal interna se degrada en la membrana ovocitaria siguiendo un proceso similar a la fagocitosis.

10 La fusión entre el espermatozoide y el ovocito provoca cambios en el metabolismo de éste como, Liberación de calcio Elevación del ph intracelular Incremento de la actividad respiratoria Este proceso va acompañado de dos fenómenos Reacción cortical Reanudación de la meiosis

11 Entrada de Ca ++ Despolarización de la membrana Se transfiere al resto de la membrana Bloqueo momentáneo de la polispermia Aumento de ph Contracción citoesqueleto REL libera Ca ++ Retracción del citoplasma Espacio e/m. plasmática m. vitelina Los gránulos corticales se aproximan a la membrana Se funden en ella Liberan su contenido Bloqueo de la polispermia

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13 Los ovocitos maduros detienen su ciclo en la meiosis II por el dominio de moléculas como: factor promotor de la maduración (MPF) proteína mitógeno activada (MAP). Fusión de gametos Inactivación de MPF Disminución de MAP Continua el Ciclo celular Extrusión del 2do cuerpo polar

14 PRONÚCLEO FEMENINO 1. Descondensación de los cromosomas maternos. 2. Formación del pronúcleo femenino. PRONÚCLEO MASCULINO 1. Ruptura de la membrana nuclear. 2. Desaparición de la teca perinuclear. 3. Descondensación de la cromatina. 4. Formación de la envoltura nuclear.

15 El centríolo distal dará origen al centrosoma del cigoto ubicación de los pronúcleos formación del primer huso mitótico. La mayoría de las estructuras del flagelo desaparecen después de su incorporación. En este punto el ovocito es una célula binucleada. Comienza el ciclo de división celular normal. replicación del ADN los pronúcleos se acercan Va a empezar la primera división celular del cigoto. cromosomas se individualizan singamia los cromosomas homólogos se organizan en el centro del huso mitótico.

16 Se ha puesto fin al proceso de la fecundación que tan sólo demora 12 horas desde el primer contacto físico entre el ovocito y los EZ.

17 La fecundación humana es un proceso complicado que requiere la interacción precisa de numerosos sistemas del organismo. La eficacia es muy baja comparada con la reproducción de otras especies de mamíferos. 100 parejas Nuestra aparente ineficiencia reproductiva se debe a una alta tasa de pérdidas ocultas.

18 La infertilidad se define como la incapacidad de concebir luego de un año de relaciones sexuales sin protección. Es un problema que afecta aproximadamente al 20% de las parejas. Inciden directamente en la fertilidad el ritmo de vida actual el retraso por parte de la mujer en la edad a la que decide tener descendencia. También afectan factores biológicos como el descenso en la concentración y calidad de los espermatozoides el estrés, la contaminación, el alcohol y el tabaco, etc.

19 Hombre (40%) Mixtas (20%) Mujer (40%) Falta de EZ Baja calidad Impotencia Eyaculación prematura Eyaculación retrograda Etc. Incompatibilidad Problemas en relaciones sexuales Falta de ovulación Irregularidad Bloqueo de las trompas Endometriosis Problemas en el útero (fibromas) Etc.

20 Si después de un año o más manteniendo relaciones sexuales sin protección no se consigue un embarazo, se debe acudir al especialista. Al comienzo del estudio, se realizan pruebas a los dos miembros de la pareja. Los avances científicos que se han producido en los últimos tiempos permiten solucionar actualmente muchos problemas relacionados con la infertilidad.

21 FECUNDIDAD ASISTIDA Por fecundación asistida se entiende todo proceso tecnocientífico en el que, no de manera natural y en relación directa con el uso de la ciencia y la tecnología, se logra obtener resultados de reproducción de seres vivos de manera artificial. Consiste en auxiliar, transformar o sustituir manipulación externa Procesos destinados a ocurrir espontáneamente en el aparato genital femenino

22 Técnicas de baja complejidad Técnicas de alta complejidad

23 Son técnicas sencillas que favorecen la fecundación natural cuando ésta es posible. Dentro de estas técnicas se encuentran: Relaciones sexuales programadas Estimulación ovárica Inseminación artificial (cervical o intrauterina)

24 Consiste en el depósito de los espermatozoides capacitados dentro del útero en forma sincrónica con la ovulación. UN POCO DE HISTORIA 1785 Hunter realizó la primera inseminación artificial humana se realizó la primera inseminación con donante de semen se publica el primer trabajo realizado con semen congelado.

25 Incapacidad de depositar correctamente el semen en la vagina Alteraciones en los parámetros seminales: Oligozoospermia (recuento <40 millones) Astenozoospermia (<50% móviles o <25% con buena progresión rectilínea) Teratozoospermia (alteraciones morfológicas >85%) Disfunción ovulatoria Factor cervical Endometriosis leve Factor inmunológico Esterilidad sin causa aparente (ESCA)

26 Recuento de EZ < con buena progresión después de haber capacitado la muestra de semen. Respuesta ovárica exagerada a la estimulación de la ovulación. Pacientes mayores de 38 años, con un elevado tiempo de esterilidad. Pacientes con disfunción ovárica que generan muchos ovocitos de baja calidad. Tasa muy elevada de anticuerpos anti-espermatozoides.

27 MOMENTO DE REALIZAR LA INSEMINACION PREPARACION DEL SEMEN INSEMINACION

28 Se debe controlar el desarrollo de los folículos y calcular exactamente el momento de la ovulación. La estimulación ovárica mejora las posibilidades de gestación permite controlar el ciclo hace que el endometrio sea más receptivo hay más posibilidades de que alguno de los ovocitos sea fecundado.

29 Dos horas antes de hacer la inseminación se realiza la capacitación artificial. Produce una serie de cambios en los EZ sin los cuales no serían capaces de fecundar. Se realiza una incubación en medios específicos para: mejorar la movilidad separar y seleccionar los mejores EZ del resto.

30 Existen diferentes métodos de capacitación espermática, siendo los más utilizados Swim up: los EZ móviles nadan y se separan del resto. Gradientes de densidad: sólo los EZ móviles son capaces de atravesar un medio progresivamente más denso. Filtrado en fibra de vidrio: sólo los móviles, pueden pasar a través de las fibras. Con estos procedimientos se consigue una selección de los mejores EZ. En cada caso concreto el método es individualizado.

31 Se lleva a cabo dos días antes de la ovulación. Se concentran los mejores EZ en un volumen muy pequeño de medio de cultivo con ATB. Se carga con una finísima cánula, para ser depositado en la cavidad uterina. La cánula se introduce, a través del cérvix, hasta el fondo del útero y se depositan los espermatozoides.

32 Después de dos semanas de realizada la inseminación, se programa la realización de una prueba de embarazo. Los resultados con ésta técnica, son de aproximadamente un 20% de gestaciones por ciclo. Existe una tasa acumulada de éxito.

33 Si después de haberse llevado a cabo cuatro ciclos de tratamiento no se ha conseguido la gestación, debe pensarse en un problema a nivel de la fecundación. Es posible que, los EZ no lleguen hasta el óvulo. lleguen pero no fecunden. fecunden pero los embriones generados no se desarrollen correctamente. se produzcan embriones normales, pero que exista un problema en la implantación.

34 Reemplazan a la fecundación natural por una fecundación in vitro, es decir que se realiza en un laboratorio de embriología altamente equipado. Son dos las técnicas más utilizadas: Fecundación in vitro (FIV) Inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI)

35 Consiste en poner en contacto los espermatozoides con los ovocitos en un medio de cultivo para que el espermatozoide penetre el ovocito y lo fertilice. UN POCO DE HISTORIA 1944 Rock y Menkin intentaron la primera fecundación in vitro Robert Edwards consiguió fecundar in vitro ovocitos de mujeres, pero no logró la división celular al ser óvulos inmaduros Patrick Steptoe y Robert Edwards: el primer nacimiento mediante fecundación in vitro: Louisa Brown, (Reino Unido) 1984 nació la primera niña procedente de un embrión congelado (Australia)

36 Esterilidad femenina por patología tubárica bilateral. Esterilidad por factor masculino. Disfunción ovárica. Endometriosis. Anticuerpos anti-espermatozoides en la mujer o en el hombre. Fallo de Inseminación. Esterilidad sin causa aparente (ESCA)

37 Infertilidad por factor masculino muy severo. escasos o ningún espermatozoide con buena progresión rectilínea porcentaje muy bajo de EZ (< 4%) morfológicamente normales. Presencia de anticuerpos anti-espermatozoides que afecte a una cantidad muy importante de éstos, o el tipo de inmunoglobulina haga sospechar que no podrán fecundar correctamente. Alteraciones moleculares tanto a nivel de receptores del espermatozoide o del ovocito.

38 ESTIMULACION OVARICA OBTENCION DE LOS OVOCITOS PREPARACION DEL SEMEN INSEMINACION CULTIVO DE EMBRIONES TRANSFERENCIA EMBRIONARIA

39 Se debe contar con un número adecuado de embriones de buena calidad para ser transferidos. Los ovocitos deben superar distintas etapas a lo largo del desarrollo embrionario. Estimulación del ovario Aumentar el número de ovocitos que alcancen la madurez El tratamiento está basado en la acción hormonal de las proteínas que intervienen de forma natural en el control del ciclo ovárico.

40 Modificando los niveles que se encuentran de forma fisiológica, es posible estimular los ovarios aumentar el número de ovocitos que maduran en un mismo ciclo Análogo de la hormona hipotalámica GnRH: inhibición de la hipófisis. Control del ciclo Gonadotropinas (FSH): estimula el crecimiento de los folículos hcg: induce la ovulación Progesterona: prepara al endometrio para la implantación. GnRH hcg Progesterona FSH Ovulación

41 Se aspira el líquido de los folículos mediante una finísima aguja. La aspiración folicular se programa para ser realizada a las 36 horas de haber sido administrada la hormona hcg. Es el momento previo a la ovulación cuando la mayoría de los ovocitos estarán maduros. El número de ovocitos maduros recuperados habitualmente oscila entre 8 y 12.

42 Se indica al varón que obtenga la muestra de semen mientras se realiza la aspiración folicular a la mujer. En el laboratorio se imita de forma artificial la capacitación. Se seleccionan los EZ de mejor movilidad Se concentran en un número adecuado para realizar la inseminación de los ovocitos. El número mínimo de EZ para conseguir una buena tasa de fecundación es un dato que debe conocer cada laboratorio >1,5 millones de EZ con buena progresión tras capacitar el semen y la morfología inicial superior al 4% de EZ normales

43 Con este término se designa al hecho de poner en contacto los EZ con los ovocitos. Los ovocitos son lavados y depositados individualmente en pequeñísimas gotas de un medio de cultivo basado en el fluido tubárico humano (HTF). Los EZ se introducen en estas microgotas que contienen a los ovocitos. Las plaquitas donde se encuentran las microgotas, se introducen en incubadores que mantiene un ambiente perfecto de temperatura (37º), proporción y pureza de gases humedad Los ovocitos fecundados se cambian a otro medio de cultivo para eliminar los EZ.

44 Se controlan y optimizan los parámetros necesarios para conseguir el desarrollo normal de los embriones. Objetivo: Supervisar Evaluar Seleccionar Aquellos embriones que por sus características morfológicas ofrezcan una mayor garantía de implantación en el útero materno. Los embriones son cultivados en diferentes medios secuenciales que aportan los nutrientes necesarios en cada estadio del desarrollo embrionario.

45 Los embriones cultivados y seleccionados en el laboratorio, se transfieren al útero materno para que implanten y prosigan su desarrollo.

46 IMPLANTACION Es la fase más complicada. (10%) Se suelen transferir al útero dos o tres embriones. Las razones por las que casi el 90% de las implantaciones fracasa suele ser: aberraciones cromosómicas de los embriones por falta de selección indisposición del endometrio para la implantación Determinación de β-hcg a las dos semanas.

47 Los resultados con FIV se acercan al 40% de pruebas de embarazo positivas por ciclo. Cuando se realizan hasta 4 intentos, la tasa de embarazo es superior al 90% por paciente. El pronóstico de embarazo dependerá de cada caso concreto y por ello el tratamiento se modifica, individualizándolo para cada pareja en cuanto al tratamiento médico que recibirá la mujer los procedimientos en el laboratorio el número de embriones que se transferirán Así, el riesgo de embarazo múltiple se reduce y la tasa de gestación de trillizos es inferior al 1%.

48 Factores de infertilidad en la mujer, como son la edad número muy escaso de ovocitos ovocitos de mala calidad y consecuentemente embriones con peor potencial de implantación. endometriosis severa Alteraciones anatómicas y genéticas

49 Fundamentalmente la técnica consiste en la inyección de un sólo espermatozoide dentro del ovocito con la ayuda de un micromanipulador. UN POCO DE HISTORIA 1981 se prueba ICSI en humanos primer ser humano nacido mediante esta técnica la microinyección da la oportunidad a varones estériles de tener descendencia se logra el primer embarazo con parto en el país.

50 Si no se adhieren suficiente cantidad de EZ, ninguno de ellos podrá fecundar. Esta falta de adhesión, podrá ser debida a: la presencia de un número muy escaso de EZ la ausencia de receptores una incapacidad de fecundar por parte de los EZ El ICSI permite que si ningún espermatozoide puede penetrar por sí mismo dentro del óvulo Introducirlo con ayuda de microcapilares haciendo que fecunde.

51 Factor masculino severo. Los espermatozoides pueden obtenerse: eyaculado epidídimo (azoospérmico obstructivo) testículo (azoospérmico secretor) orina (retroeyaculación) mediante métodos de electroestimulación (aneyaculadores) Fallas de fertilizaciones previas

52 Hay ocasiones en las que es imposible encontrar espermatozoides ni en el semen eyaculado ni tampoco en el interior de los testículos. Existen dos técnicas: ELSI Consisten en microinyectar dentro del ROSI ovocito espermátides en lugar de EZ. Las espermátides difieren de los EZ: morfología conformación y actividad del material del núcleo, Todavía son necesarios años de experimentación para: constatar la viabilidad del método evaluar los riesgos que éste podría suponer para la salud del embrión.

53 ESTIMULACION OVARICA OBTENCION DE LOS OVOCITOS PREPARACION DE LO OVOCITOS PREPARACION DEL SEMEN MICROINYECCION CULTIVO DE EMBRIONES TRANSFERENCIA EMBRIONARIA

54 Los ovocitos deben ser despojados de todas las células que lo rodean, ejecutar correctamente la micromanipulación comprobar el estado madurativo de los mismos Para separar las células del cúmulus y de la corona, se emplean procedimientos tanto mecánicos como enzimáticos. se realizan una serie de lavados solución tamponada de hialuronidasa los ovocitos son aspirados y expulsados a través de una fina pipeta

55 Consideraciones especiales: Oligozoospermia severa: se buscan los EZ directamente del pelet del lavado. Movilidad muy disminuida: adición de un activador del metabolismo celular. Inmóviles: se coloca a los EZ en un medio hipoosmótico.

56 Se realiza sobre un microscopio invertido, al cual se le han adaptado unos micromanipuladores. La platina del microscopio está atemperada. Al medio de cultivo se le añaden substancias tampón que evitan alteraciones. El proceso en sí, no es más que microinyectar un espermatozoide dentro de un ovocito.

57 Se colocan unas microgotas para los ovocitos y otras para los EZ. Los ovocitos, se colocan en las microgotas de medio de cultivo. Las de los EZ corresponden a una solución más densa que enlentece el movimiento de los mismos. Para inmovilizarlos, 1. se sitúa el capilar sobre la cola 2. luego se baja, aplastando la cola del espermatozoide contra la base de la placa 3. se desplaza horizontalmente el capilar, fracturando la cola. Modificación en la membrana que le permite fecundar

58 Las membranas del ovocito son muy elásticas, Se punciona Se aspira para asegurarse que la membrana se ha roto Un cambio de velocidad en la aspiración, indica la ruptura de la membrana. Seguidamente se libera el espermatozoide en el interior del ovoplasma.

59 Una vez microinyectados, todos los ovocitos son cuidadosamente lavados, pasándolos por medios de cultivo basados en el fluido tubárico (HTF) Son incubados durante aproximadamente horas, hasta que se comprueba, si se ha producido una fecundación normal o no.

60 ESTIMULACION OVARICA OBTENCION DE LO OVOCITOS PREPARACION DE LO OVOCITOS PREPARACION DEL SEMEN MICROINYECCION CULTIVO DE EMBRIONES TRANSFERENCIA EMBRIONARIA

61 No se consigue una mejor tasa de embarazo cuando se hace ICSI respecto a cuando se hace FIV. Sólo se recurre a la microinyección, cuando hubo un fallo previo de fecundación in vitro las características de los EZ no permitan otra opción Los estudios realizados desde los primeros años de su aplicación Indican que no presentan una mayor tasa de anomalías genéticas

62 Esta maniobra de microinyección sustituye los pasos descriptos de interacción entre gametos Selección de los EZ Determinación del lugar de microinyección Activación ovocitaria Introducción del espermatozoide íntegro (acrosoma intacto, teca perinuclear) Retraso en los eventos de activación Retención de gránulos corticales Retraso en la síntesis de ADN

63 La fecundación humana constituye un proceso complejo, perfectamente coordinado de múltiples pasos. La técnicas de fecundación asistida consisten en auxiliar o sustituir procesos destinados a ocurrir espontáneamente en el aparato genital femenino, por medio de la manipulación externa. Considerar al ICSI como una técnica con indicaciones precisas, acerca de la cual queda mucho por descubrir.

64 Para muchos este avance de la ciencia es un milagro y para otros es una deshonra, sin embargo el hecho de que una pareja no pueda concebir de forma natural a su hijo y que la ciencia haya podido brindarle esa oportunidad es todo un logro para la humanidad.

65 Fecundación in vitro Aguijarro