HEPATITIS VIRAL DEL PATO

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1 CAPÍTULO HEPATITIS VIRAL DEL PATO RESUMEN La hepatitis en los patos puede ser causada por al menos tres virus diferentes. El más común y extendido internacionalmente es el virus de la hepatitis del pato (DHV) de tipo I, actualmente designado como un picornavirus no clasificado, que ocasiona una infección aguda muy contagiosa y letal en patitos menores de 6 semanas de edad y, frecuentemente, menores de 3 semanas de edad. No se encuentra en aves más viejas. Esta infección se denomina a menudo simplemente como hepatitis vírica del pato. El DHV de tipo II ha sido descrito únicamente en el Reino Unido. Apareció en patitos de entre 10 días y 6 semanas de edad, y causó cambios patológicos similares a los del DHV de tipo I. A partir de estudios de microscopía electrónica y moleculares, se considera que es un astrovirus. El DHV de tipo III ha sido descrito solamente en los Estados Unidos de América. Causa lesiones hepáticas parecidas en patitos jóvenes, pero es menos virulento que el DHV de tipo I. Se cree que es un picornavirus, no relacionado serológicamente con el virus de tipo I. El diagnóstico de la hepatitis en los patitos se basa en el patrón característico de la enfermedad en la bandada, cambios patológicos globales, la recuperación del virus a partir de los patitos muertos, y la reproducción de la enfermedad en patitos susceptibles. Identificación del agente: No es posible distinguir entre los DHV de tipo I, II y III en base a los hallazgos clínicos y a la patología, aunque se pueden realizar distinciones a partir de las respuestas frente a los virus aislados de los patitos, huevos embrionados y cultivos celulares. De forma alternativa, el ARN del DHV de tipo I puede detectarse por la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa de un solo paso a partir de hígado de patitos y también del líquido alantoideo y el hígado de embrión de huevos de pato inoculados. Pruebas serológicas: Los ensayos serológicos tienen poco valor en el diagnóstico de las infecciones agudas causadas por los DHV tipos I, II y III. Se han utilizado pruebas de neutralización de suero in ovo con los tres virus y se han desarrollado ensayos in-vitro para el DHV de tipo I. Estas pruebas han sido utilizadas para la identificación del virus, el ensayo de las respuestas inmunes frente a la vacunación y estudios epidemiológicos. Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Las infecciones por el DHV de tipo I se pueden controlar mediante el uso de vacunas víricas vivas atenuadas y una vacuna vírica inactivada. Se administran a patos reproductores para conferir inmunidad pasiva en los patitos. Las vacunas de virus vivos atenuados también pueden inmunizar activamente a patitos de un día de edad susceptibles al DHV de tipo I. Los patitos susceptibles al DHV de tipo I pueden protegerse pasivamente con una preparación de anticuerpo en yema de huevo. Las infecciones por DHV de tipo III se pueden controlar mediante el uso de una vacuna vírica viva atenuada administrada a los patos reproductores para conferir inmunidad pasiva a los patitos. A. INTRODUCCIÓN La hepatitis del pato está causada por al menos tres virus diferentes, concretamente los virus de la hepatitis del pato (DHV) de los tipos I, II y III. El más común es el DHV de tipo I, que se designa como un picornavirus no clasificado y puede requerir la asignación a un nuevo género dentro de los Picornaviridae (4, 10, 15). El DHV de Manual de la OIE sobre animales terrestres

2 tipo II se considera un astrovirus, y el DHV de tipo III se considera un picornavirus no relacionado serológicamente con DHV de tipo I. Se ha informado de que un nuevo serotipo de DHV denominado N-DHV puede causar una elevada mortalidad con lesiones típicas en el hígado (16). Este virus, recuperado de patitos híbridos y gansos pequeños, no está relacionado antigénicamente con el DHV de tipo I, y, aunque es filogenéticamente distinto, aún así está estrechamente relacionado con el DHV de tipo I. Hasta el presente, al DHV de tipo I se le ha considerado sólo como causante de la enfermedad en ánades y patitos de Pekín, pero actualmente se le ha descrito como causa de pancreatitis y encefalitis en patos de Moscovia (6). Estos virus que causan infecciones agudas no deberían confundirse con el virus de la hepatitis B del pato, un hepadnavirus clasificado en el mismo grupo que los virus de la hepatitis B de los mamíferos. No se comprende del todo la relevancia de esta infección en el pato. 1. Identificación del agente a) DHV de tipo I B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO El DHV de tipo I causa una infección muy contagiosa en los patos. Se desconoce su relevancia para la salud pública. La enfermedad consiste en una infección vírica aguda, a menudo fatal, de propagación rápida en patitos jóvenes. Normalmente afecta a patitos menores de 6 semanas y a menudo más jóvenes. la enfermedad clínica se caracteriza por el letargo y la ataxia. Los patitos pierden su estabilidad, caen sobre sus costados y patean espasmódicamente antes de la muerte. Durante la muerte la cabeza se coloca hacia atrás en posición de opistotono. La secuencia completa de la enfermedad es rápida y puede durar no más de 1-2 horas. La mortalidad completa en una bandada se producirá prácticamente en 3 4 días, con la mayoría de las muertes en el segundo día. Los cambios patológicos patentes aparecen sobre todo en el hígado, el cual se encuentra agrandado y muestra hemorragias definidas puntuales y equimóticas. También puede presentarse un aumento del tamaño del bazo e hinchazón de los riñones, junto con la congestión de los vasos sanguíneos renales. Los cambios microscópicos en el hígado se caracterizan por la extensa necrosis de los hepatocitos y la hiperplasia del conducto biliar, junto con diversos grados de respuesta de inflamación celular y hemorragia. Las observaciones clínicas y patológicas son muy indicativas de una infección por el DHV de tipo I. El virus puede recuperarse fácilmente a partir del tejido hepático mediante homogeneización como una suspensión al 20% (p/v) en tampón salino. Se clarifica la suspensión y además puede tratarse (si se desea) con cloroformo al 5% (v/v) durante minutos a temperatura ambiente. El DHV de tipo I es resistente a este tratamiento. La presencia de DHV de tipo I se confirma generalmente mediante uno o varios de los procedimientos siguientes: i) Mediante inoculación subcutánea o intramuscular del aislamiento en patitos de entre 1 y 7 días de edad que son susceptibles al DHV de tipo I. Continuaría la enfermedad clínica característica, ocurriendo las muertes entre las horas después de la inoculación, y a menudo antes de las 24 horas. Los patitos deberían mostrar la patología evidente atribuible al DHV de tipo I. El virus debería ser reaislado a partir de hígados. ii) Mediante inoculación de diluciones seriadas del homogeneizado de hígado en el saco alantoideo de huevos embrionados de pato (10 14 días) o de pollo (8 10 días). Los embriones de pato mueren entre 24 y 72 horas más tarde, mientras que los embriones de pollo son más variables y erráticos en su respuesta, y usualmente tardan 5 8 días en morir. Los cambios patológicos evidentes en los embriones incluyen atrofia y hemorragias subcutáneas en todo el cuerpo, especialmente con edema en la región abdominal y extremidades posteriores. Los hígados de los embriones pueden estar rojos, amarillentos e inflamados, y mostrar algunos focos necróticos. En los embriones que tardan más tiempo en morir, es más pronunciado el color verdoso del alantoide, y se hacen más evidentes las lesiones hepáticas y la atrofia. iii) Mediante inoculación en cultivos primarios de células de hígado de embrión de pato (DEL), los cuales son particularmente sensibles (17). Las diluciones del homogeneizado de hígado que contienen el DHV de tipo I causan un efecto citopático (ECP) que se caracteriza por el redondeo celular y la 2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

3 necrosis. Cuando se cubre con un medio de mantenimiento que contiene un 1% de agarosa, el ECP da lugar a placas de un diámetro de aproximadamente 1 mm. Ensayos inmunológicos Estas pruebas no se han utilizado extensivamente para la identificación rutinaria de la infección por el DHV de tipo I. Se han descrito varios ensayos de neutralización vírica (NV), que pueden tener una mayor importancia si llegan a generalizarse las infecciones por los DHV de tipo II y III. Las pruebas que se han descrito (2, 17 19) incluyen: i) La inmunización pasiva subcutánea de patitos de 1 7 días de edad susceptibles frente al DHV de tipo I con 1 2 ml de suero específico hiperinmune, o anticuerpos específicos de la yema del huevo. Estos patitos se estimulan intramuscularmente o subcutáneamente 24 horas más tarde con al menos LD 50 (50% de la dosis letal) del aislamiento vírico. De manera similar se estimula un grupo de patitos no inoculados. La identificación de la infección se basa en la supervivencia de un % de los patitos inmunes pasivamente y el % de mortalidad en los controles. ii) Se descargan intramuscularmente o subcutáneamente patitos de 1 7 días de edad, susceptibles al DHV-I e inmunes por vía materna al DHV de tipo I, con al menos LD 50 del aislamiento vírico. La identificación se basa en las pérdidas del % de los patitos susceptibles y la supervivencia del % de los patitos inmunes por vía materna. iii) Se mezclan diluciones seriadas decimales del aislamiento vírico con volúmenes iguales de suero hiperinmune específico frente a DHV de tipo I y diluidos 1/5 y 1/10. Las muestras se dejan reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora, y entonces se inoculan (0,2 ml) subcutáneamente en patitos susceptibles, y también en la cavidad alantoidea (0,2 ml) de huevos de pato embrionados, y en cultivos primarios de monocapas de células DEL. En cada caso los controles consisten en el aislamiento vírico mezclado con el suero control. Existe escasa evidencia de variación antigénica entre los aislamientos del DHV de tipo I. Sin embargo, una variante, el DHV de tipo Ia, aislado en los Estados Unidos de América, solamente reacciona parcialmente con el virus clásico de tipo I en pruebas cruzadas de neutralización de suero (12, 20). Se han descrito otras variantes en la India y en Egipto, pero no se conoce más sobre ellas. Informes recientes sobre la enfermedad en patos de Moscovia procedentes de Francia (6), y un N-DHV procedente de Taipei, China (16), han planteado nuevas preguntas sobre la hepatitis viral del pato. Métodos de reconocimiento de ácido nucleico Aunque algunas publicaciones recientes revelan la estructura molecular del DHV de tipo I (4, 10, 15), sólo una de ellas ha descrito la reacción en cadena de la polimerasa de trascripción inversa de un solo paso para detectar el DHV de tipo I (9). Este es el método que se esboza a continuación. Reacción en cadena de la polimerasa Este método se ha tomado del estudio (9). Está basado en cebadores específicos para amplificar una región del gen 3D. Detección del DHV-I de los órganos del embrión de patos y pollos. Se recogen y filtran los sobrenadantes preparados a partir del hígados de patitos infectados con DHV de tipo I (0,2 µm). Se inoculan con 0,2 ml de sobrenadante vírico cada una de las cavidades alantoideas de cinco huevos embrionados de patos de 11 días y de pollos de 9 días. El fluido alantoideo y las muestras de hígado se recogen de los embriones inoculados con dos cepas de referencia y se homogeneiza cada muestra de hígado en un homogeneizador de tejidos y se añade tampón fosfato salino para hacer suspensiones al 10%. Se centrifugan las suspensiones de muestras de hígado y el líquido alantoide a g durante 30 minutos; los sobrenadantes se tratan con el kit de extracción de ADN/ARN vírico Viral Genespin, y se utilizan los ácidos nucleicos para la RT-PCR de un paso. Extracción del ácido nucleico Las extracciones del ARN vírico se realizan utilizando el kit de extracción de ADN/ARN vírico Viral Genespin (intron Biotechnology, Seongnam, Korea). Se mezcla un total de 150 µl del la muestra para extracción con 250 µl de tampón de lisis. Para las pruebas de sensibilidad por RT-PCR, se añaden 50 µl de agua destilada tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) a 100 µl de dilución decimal del virus de las muestras antes de mezclarla con tampón de lisis. Se añade una alícuota de 350-µl de tampón de unión y se tritura; el total de 750 µl se coloca en una mini-columna que se hace girar en una microcentrífuga a rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se descarta el flujo directo y se realizan dos ciclos de lavadogiro-flujo directo utilizando tampones de lavado A y B (500 µl de cada uno), seguidos de un giro final de Manual de la OIE sobre animales terrestres

4 1 minuto para secar la membrana. Se trasfiere la columna a un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml y se eluye el ARN añadiendo 40 µl de tampón de elución y centrifugando durante 1 minuto a rpm. Después de medir las concentraciones de ARN utilizando el NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, DE), se almacenan las muestras a 20 C. RT-PCR de un solo paso La RT-PCR de un solo paso se realiza utilizando el kit Maxime RT-PCR PreMix (intron Biotechnology). Los 20-µl de mezclas de reacción contienen 1 U de transcriptasa inversa OptiScript, 2,5 mm de dntp, 2,5 U de Taq ADN polimerasa i-star y tampón de reacción RT-PCR (50 mm de Tris/HCl y 75 mm de KCl). Además se incluirán en la reacción los siguientes componentes: 4 µl (50 ng) de ARN o ADN molde, 1 µl (10 pmoles/µl) de cada cebador específico (DHV-1 ComF y DHV-1 ComR), y dh2o tratado con DEPC hasta un volumen total de reacción de 20 µl. Se utiliza un termociclador de gradiente T (Biometra, Gottingen, Germany) para la RT-PCR de un solo paso. La trascripción inversa se lleva a cabo a 45 C durante 30 minutos, y a continuación se inactiva el enzima a 94 C durante 5 minutos. La amplificación por PCR se realiza utilizando una desnaturalización inicial de 20 segundos a 94 C; a continuación, 40 ciclos de templado durante 30 segundos a 52 C, una extensión durante 30 segundos a 72 C, y una desnaturalización durante 20 segundos a 94 C; y una extensión final durante 5 minutos a 72 C. Las reacciones se guardan a 4 C. Detección de productos mediante la RT-PCR de un solo paso Los productos de la PCR (10 µl) se separan por electroforesis (100 V) en geles horizontales de agarosa al 1,5% (intron Biotechnology) y tampón Tris-acetato (40 mm de Tris-acetato, 1 mm de ácido etiléndiamino tetraacético). Los geles se tiñen con bromuro de etidio (0,5 ug/ml), se observan con luz ultravioleta y se fotografían. Interpretación de los resultados Se amplifica un fragmento de ADN de 467 pb mediante una RT-PCR de un solo paso utilizando ARN extraído de los hígados de los patitos infectados con cepas de referencia del DHV de tipo I. El control negativo de ARN se obtiene de un hígado de patito no infectado y no se amplifica en las mismas condiciones. b) DHV de tipo II La infección de los patos por el DHV de tipo II solamente se ha descrito en el Reino Unido (1, 5). Se trata de una infección aguda y fatal de los patitos que produce unos signos clínicos y patológicos similares a los del DHV de tipo I. Las aves afectadas pueden mostrar signos de polidipsia y normalmente mueren entre 1 2 horas después de mostrarse enfermos. Los cambios patológicos generales incluyen hemorragias múltiples, bandas puntuales y confluentes en el hígado, riñones pálidos e hinchados con vasos sanguíneos congestionados, y bazos hipertrofiados. A menudo el tracto alimenticio se encuentra vacío, aunque el intestino delgado puede contener moco, y ocasionalmente se observan zonas hemorrágicas. A veces se observan hemorragias petequiales en el corazón. Histológicamente, los cambios en el hígado son parecidos a los observados en infecciones por el DHV de tipo I; el alcance de la hiperplasia del conducto biliar puede ser mayor que con el DHV de tipo I, pero esto es relativo. El DHV de tipo II tiene una morfología parecida a la del astrovirus y los viriones tienen un diámetro de nm. Se le clasifica como perteneciente a la familia Astroviridae como astrovirus I del pato (DAstV-I) (5, 11). El virus se puede recuperar en suspensiones homogeneizadas de hígado al 20 % (p/v) en tampón salino. Se puede utilizar para inocular: i) Patitos susceptibles, en los que la respuesta puede ser variable. Puede aparecer un porcentaje de mortalidad de hasta un 20% en un periodo de 2 4 días. La patología general es similar a la observada en casos de campo (5). Esto contrasta con las características de la infección por el DHV de tipo I, que es más virulenta y rápida en sus efectos. ii) Huevos de pollo o pato embrionados, bien por vía de la cavidad amniótica o en el saco de la yema. Pueden responder de manera imprevisible después de cuatro pases, pero pueden no observarse muertes durante los pases más tempranos. Los embriones tardan 6 10 días en mostrar los síntomas de la infección; cuando esto ocurre existe atrofia con hígados verdes necróticos. 4 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

5 Ensayos inmunológicos Los ensayos inmunológicos no se han empleado rutinariamente, ya que la respuesta serológica en los patitos y en los embriones de pato frente a la infección es escasa. Sin embargo se ha aplicado un ensayo de neutralización (5) para la identificación del virus inoculando embriones de pollo en la cavidad amniótica con mezclas de suero constante/virus variable. Se han llevado a cabo pruebas de protección cruzada en patitos de 2 4 días de edad (5); se inoculan con antisuero frente a los tipos I o II y se estimulan 3 días más tarde con el aislamiento vírico. Esta técnica puede distinguir el DHV de tipo II de los tipos I y III. c) DHV de tipo III El DHV de tipo III ha sido descrito solamente en EE.UU. Aparecen pérdidas de hasta el 20% en patitos inmunes al DHV de tipo I (7, 13). El DHV de tipo III causa una infección aguda en patitos jóvenes con signos clínicos similares a los observados en las infecciones de tipo I. La patología general es también parecida a la infección de de tipo I. La superficie del hígado es pálida y veteada con muchas bandas rojas y algunas hemorragias petequiales. El bazo está más pálido, aunque no notoriamente hinchado, y los riñones pueden mostrar una congestión desigual. El virus se puede recuperar a partir de suspensiones homogeneizadas de hígado y es resistente al tratamiento con cloroformo al 5%. El virus se puede aislar: i) Inoculando intramuscularmente el aislamiento en patitos susceptibles. El porcentaje de mortalidad puede alcanzar un 20%, con un 60% de morbilidad. No aparecen muertes durante las primeras 24 horas y todas las pérdidas siguen entre el día 2 y 4 después de la inoculación. La inoculación intravenosa es más efectiva; la infección de tipo III es menos virulenta que la de tipo I. ii) Inoculando el aislamiento en la membrana corioalantoidea (CAM) de huevos embrionados de pato de 10 días de edad. La respuesta es imprevisible, pero siempre se dan algunas muertes del embrión a los 7 10 días. Las membranas adoptan un aspecto seco y crujiente, por debajo de ellas se encuaentran edematosas. Los embriones pueden encontrarse atrofiados y edematosos con hemorragias en la piel. El hígado, riñones y bazo están hinchados. Los intentos para cultivar el virus en huevos de gallina no han tenido éxito. Los intentos con el virus para inducir un ECP en cultivos de tejidos no han tenido éxito, pero el virus ha sido detectado mediante inmunofluorescencia indirecta en cultivos en monocapa de células DEL y riñón de embrión de pato (DEK) infectadas experimentalmente (7). 2. Pruebas serológicas Estas pruebas no se emplean para el diagnóstico ya que la enfermedad clínica es demasiado aguda. Los tres tipos de DHV se han utilizado en ensayos de neutralización de virus in ovo, pero su éxito depende de la expresión del virus en el sistema de ensayo utilizado; con los virus de tipo II y III esto puede ser un problema. Se han desarrollado pruebas in-vitro para el DHV de tipo I; incluyen un ensayo de reducción de placa y una prueba de microtitulación (17, 18). El ensayo de reducción de placa se puede realizar utilizando bien células DEK o DEL. Se preparan cultivos monocapa de células primarias en medio mínimo esencial de Eagle (MEM) que contenga suero bovino fetal (FCS) al 5 10%, glutamina 2mM, 0.17% de bicarbonato sódico y gentamicina. Las células tripsinizadas se siembran en placas de Petri de 5 cm de diámetro, y se incuban a 37 C en una atmósfera de CO 2 al 5%. Las monocapas deberían estar casi confluentes a las horas post-siembra. Las monocapas se lavan dos veces con MEM libre de suero o solución balanceada salina de Hank para eliminar todo residuo de FCS antes de infectar con el DHV de tipo I. Se mezclan volúmenes iguales de DHV de tipo I resuspendido en MEM libre de suero y ajustado a 200 unidades formadoras de placa (PFU) por 0,1 ml con volúmenes iguales de suero de pato diluido seriadamente (diluciones dobles en MEM). Las muestras de suero deberían inactivarse a 56 C durante 30 minutos antes de probarse. Las mezclas virus/suero se incuban a 37 C durante 1 hora, y entonces se añaden aliquotas de 0.1 ml a las monocapas celulares confluentes, a tres placas por dilución. Las placas se dejan durante 30 minutos a temperatura ambiente (20 22 C), y entonces se recubren con medio de mantenimiento con agarosa (MEM que contiene suero de pollo al 2% y 0,1 0,2% de FCS al que se ha añadido agarosa hasta una concentración final del 1% p/v ). las placas se colocan entonces a 37 C en una atmósfera de CO 2 al 5%. Se registra el numero de placas producidas después de una incubación de 48 horas. Las placas pueden observarse utilizando una fuente de luz indirecta, o alternativamente las monocapas se pueden fijar con tampón salino con formol al 10% y ser teñidas con cristal violeta al 1%. Los títulos séricos del anticuerpo se expresan como el inverso de la dilución más alta de suero que reduce el contaje de placas en un 50%. Manual de la OIE sobre animales terrestres

6 Se puede llevar a cabo un ensayo de neutralización por microtitulación empleando células primarias DEK. Se preparan diluciones seriadas dobles de cada muestra de suero (inactivado por calor) en 50 µl de medio basal de Eagle (BME) libre de suero en placas de microtitulación. Se añaden a cada pocillo aproximadamente DICC 50 (50% de la dosis infectiva de cultivo celular) unidades de DHV de tipo I en 50 µl de BME, y se deja que reaccionen las mezclas a 37 C durante 1 hora. Se resuspenden las células primarias DEK en BME suplementado con caldo de triptona fosfato al 10%, 2mM glutamina, 0.17% de bicarbonato sódico y 2 4% de suero de pollo, y se ajustan para contener células/ml. Se añaden las células a las placas a 100 µl por pocillo, y las placas se incuban hasta 96 horas a 37 C en una atmósfera humidificada con CO 2 al 5%. Después de la incubación, se fijan las células con tampón salino con formol al 10% y se tiñen con cristal violeta al 1%. Entonces se leen las placas macroscópicamente. El título de la actividad neutralizante del virus se expresa como el inverso de la dilución más alta de suero a la que creció una monocapa, es decir, no existe evidencia de ECP y, por tanto, ha tenido lugar la neutralización completa del virus. Un título menor de log 2 4 se considera negativo. Estas pruebas de neutralización se han usado para probar las respuestas inmunes humorales frente a la vacunación y para encuestas epidemiológicas, así como para la identificación del virus. C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO El DHV de tipo I puede controlarse mediante el uso de una vacuna vírica viva atenuada. Se administra a los patos reproductores de manera que la inmunidad se transmite a través de la yema a las aves recién salidas del huevo. La vacuna vírica viva también puede utilizarse para inmunizar activamente patitos recién salidos del huevo susceptibles al DHV de tipo I (3). También es efectiva una vacuna inactivada de DHV de tipo I cuando se administra a patos reproductores que han sido sensibilizados con la vacuna viva o expuestos previamente en el ambiente al DHV de tipo I; la progenie de estos reproductores recibe inmunidad por vía materna (18). Los patos también pueden ser protegidos pasivamente mediante la inoculación de los anticuerpos de la yema de huevo de pollo. Se ha utilizado una vacuna viva de virus DHV de tipo II para proteger a los patitos unicamente bajo condiciones experimentales (5). Las infecciones por DHV de tipo III han sido controladas mediante el uso de vacunas de virus vivos atenuados administradas a patos reproductores, de forma que la inmunidad se transfiere a través de la yema a los patitos eclosionados. Las guías para la producción de vacunas veterinarias se dan en el capítulo Principios de producción de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aquí y en el capítulo están destinadas a ser de naturaleza general y pueden ser complementadas por requisitos nacionales o regionales. 1. Control del inóculo a) Características del inóculo La vacuna del virus de tipo I más comúnmente utilizada en Europa está derivada de un aislamiento pasado en huevos embrionados de pollo veces; el de EE.UU. para vacunas vivas e inactivadas se ha pasado veces. El inóculo del virus de tipo II se originó a partir de un aislamiento atenuado mediante 25 pases seriados en huevos embrionados de pollo (1), y ha sido utilizado experimentalmente sólo bajo condiciones de campo (R.E. Gough, comunicación personal). El inóculo de la vacuna de tipo III ha sido atenuado mediante 30 pases seriados en huevos de pato embrionados inoculados vía CAM. b) Método de cultivo Los inóculos de los virus de los tipos I y II se manejan de manera similar. Deberían prepararse en huevos embrionados de pollo específicamente libres de patógenos (SPF) de 9 10 días de edad por vía alantoidea, e incubados a 37 C. Se pueden almacenar como homogeneizados de embrión en tampón salino a 70 C o a una temperatura menor durante varios años. El virus de tipo III se prepara en embriones de pato de 10 días de edad, inoculados en la CAM, e incubados durante 6 10 días a 37 C. Se puede almacenar como un homogeneizado de la CAM y los embriones a ki 70 C o a menor temperatura. 6 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

7 c) Validación como vacuna Todos los inóculos de los virus deberían encontrarse libres de virus externos que son patógenos para los patos, pollos o pavos. Los inóculos deberían encontrarse libres de toda contaminación microbiológica y fúngica. En el caso de patitos recién eclosionados, el DHV de tipo I vivo atenuado se replica rápidamente y resulta en inmunidad entre las horas de la vacunación. Esta inmunidad persiste durante el tiempo de vida susceptible (3). Sin embargo, en patitos protegidos mediante vacunación de sus padres, el nivel de inmunidad derivada a través de la madre disminuye durante las 2 primeras semanas de vida, aunque dichos patitos pueden ser reinmunizados activamente con virus atenuado administrado subcutáneamente u oralmente alrededor de los 7 10 días de edad (8, 14). Alternativamente, la inmunidad se puede mejorar mediante la administración de suero específico hiperinmune o de los anticuerpos de la yema de huevo preparados a partir de huevos puestos por pollos inmunizados activamente frente al DHV de tipo I. Los patos reproductores estimulados con el DHV de tipo I vivo y administrados intramuscularmente con una dosis única de vacuna de tipo I inactivada produjeron una progenie inmune vía materna a través de un ciclo completo de puesta (18). 2. Método de fabricación Los virus de DHV de los tipos I y II se manejan de forma similar. La vacuna se produce en huevos embrionados de pollo SPF de 9 10 días de edad inoculados a través de la vía alantoidea e incubados a 37 C. Las mayoría de las muertes de los embriones ocurren entre los 2 y3 días en el caso del DHV de tipo I, pero con el de tipo II las muertes no ocurren hasta 6 10 días después de la inoculación, aunque se recogen a los 3 5 días para obtener un máximo rendimiento de virus. Los concentrados de embriones se homogeneizan en tampón salino y se clarifican mediante una centrifugación a baja velocidad. La preparación se diluye apropiadamente y se distribuye en viales que preferiblemente se congelan rápidamente a 70 C o a menor temperatura. Posteriormente se pueden almacenar de manera satisfactoria entre 20 y 40 C. La vacuna atenuada de DHV de tipo I también se encuentra disponible como una preparación liofilizada que puede almacenarse a 2 8 C. La vacuna reconstituida se puede utilizar con o sin la incorporación de hidróxido de aluminio en el diluyente. En el caso de la vacuna inactivada de DHV de tipo I, los concentrados de embriones se homogeneizan y clarifican mediante centrifugación a baja velocidad y posteriormente se purifican mediante tratamiento con cloroformo (concentración final del 10% v/v ). Entonces esta preparación se inactiva con etilenimina binaria (BEI) recién preparada. El virus inactivado se mezcla con un adyuvante como el LSE-STM 1 ; y como conservante se añade un 0,2% (v/v) de formol (18). La vacuna de tipo III se prepara en huevos de pato SPF de 10 días de edad inoculados a través de la CAM con DHV de tipo III atenuado, e incubados a 37 C. La mayoría de las muertes de los embriones ocurren entre 6 y 10 días. Los huevos que contienen los embriones muertos junto con sus CAMs se concentran y homogeneizan en tampón salino y se clarifican mediante centrifugación a baja velocidad. La preparación se diluye adecuadamente y se dispensa en viales que preferiblemente se congelan rápidamente a 70 C o a menor temperatura. Anticuerpo de yema de huevo El DHV de tipo I virulento preparado a partir de hígados de patitos o el virus atenuado se puede utilizar para hiperinmunizar pollos SPF con vistas a la producción de anticuerpo en yema de huevo. Se recogen los huevos a partir de aves hiperinmunizadas y se almacenan a 4 C hasta el momento de la producción. Se separan las yemas, se juntan y se mezclan con un agente antiespumante. La mezcla se diluye con tampón salino que contenga no más de un 0,2% (v/v) de formol como conservante. El producto dispensado se almacena a 4 C y tiene una vida media de 1 año. Las pruebas de esterilidad se llevan a cabo de forma habitual para garantizar la ausencia de contaminantes. 3. Control interno Todo embrión muerto dentro de las 24 horas de la inoculación debe ser descartado por muerte inespecífica. La identidad del tipo de virus debe ser confirmada mediante prueba de NV realizada con antisuero específico mediante método de suero constante y virus variante. En el caso de los Tipos de virus I y II, la prueba se realiza 1 Una preparación de Salmonella typhimurium (STM), un mitógeno de células B, en un sistema de emulsion lípido (LES). Disponible en Ribi Inmunochem Research, Hamilton, Montana 59840, USA. Manual de la OIE sobre animales terrestres

8 en huevos embrionados de pollo; con virus de Tipo III, la prueba se realiza con huevos embrionados de pato. El antisuero debe reducir el título de virus específico en por lo menos ELD 50 (50% dosis letal de embrión). 4. Control de lotes a) Esterilidad Las pruebas para comprobar la esterilidad y la ausencia de contaminación de los productos biológicos biológicos se puede encontrar en el capítulo b) Inocuidad Se debería inocular a un grupo de patitos de 1 3 días de edad susceptibles al virus de que se trate subcutáneamente o intramuscularmente (en el caso de los tipos I y II), o subcutáneamente (en el caso del tipo III), con la vacuna atenuada a diez veces la dosis recomendada, y a continuación se deberían manterner en observación por si apareciese alguna reacción adversa a los días. Las vacunas vivas atenuadas deberían ser estables y no revertir a virulentas en pases repetidos en patitos susceptibles. Se realiza una prueba de inocuidad con la vacuna inactivada de DHV de tipo I inoculando la dosis recomendada (0,5 ml) intramuscularmente en un grupo de patitos de un día de edad; no deberían observarse efectos adversos durante el periodo de prueba. Las pruebas de inocuidad con los anticuerpos de yema de huevo se realizan inoculando subcutáneamente 1 ml en cada uno de los patitos de un grupo, los cuales se mantienen bajo observación de los síntomas de los efectos adversos durante 3 días. c) Potencia Para los virus DHV de los tipos I y II, el título vírico de la vacuna debería determinarse en huevos embrionados de pollo de 9 10 días de edad inoculados en la cavidad alantoidea e incubados a 37 C. La inmunogenicidad de la vacuna para los patitos susceptibles a los virus de tipo I o II se puede valorar inoculando subcutáneamente un mínimo de LD 50 de virus DHV virulento de tipo I o II por patito (3). Al menos deberían sobrevivir un 80% de las aves vacunadas y, en el caso del de tipo I, deberían morir al menos un 80% de los controles; en el caso del de tipo II, es más realista una mortalidad del 20% de los controles. La inmunogenicidad de la vacuna inactivada se considera satisfactoria si se puede demostrar un incremento de cuatro o más veces en el título de neutralización del anticuerpo después de la administración a patitos que han sido previamente sensibilizados con el DHV de tipo I vivo y atenuado. Para el virus de tipo III, el título de la vacuna debería determinarse en huevos embrionados de pato de 10 días de edad inoculados en la CAM. La pruebas de inmunogenicidad en patitos han mostrado ser difíciles debido a la patogenicidad variable del virus administrado en los patitos. Los ensayos de potencia con anticuerpos de yema de huevo se realizan determinando el índice de neutralización (IN) para el producto en huevos embrionados de gallina utilizando el método yema de huevo constante/ virus variable. Se considera satisfactorio un IN mínimo de La eficacia del producto se determina inoculando un grupo de patitos susceptibles con la dosis recomendada de anticuerpo de yema de huevo. Se deja un segundo grupo sin tratar. Después de 24 horas, se inocula cada grupo con virus DHV de tipo I virulento. El producto se declara eficaz si al menos sobreviven un 80 % de los patitos tratados y mueren al menos un 80% de los controles. d) Duración de la inmunidad Los patos reproductores inoculados con una vacuna viva atenuada de DHV de tipo I dos o tres veces a las 12, 8 y 4 semanas antes de entrar en la puesta, y los patos reproductores inoculados con una vacuna viva atenuada del DHV de tipo III dos veces en las semanas 12 y 4 antes de entrar en la puesta, deberían producir una progenie inmunizada pasivamente a los largo de una temporada de cría. Sin embargo, por lo general, se recomienda revacunar cada tres meses con la vacuna DHV de tipo I y cada 6 meses con la vacuna DHV de tipo III después del comienzo de la puesta. La vacuna atenuada de DHV de tipo I también puede suministrarse como una preparación liofilizada que, justo antes de la administración, se mezcla con un diluyente que contiene hidróxido de aluminio. Esta se administra a las 7 semanas de edad, siguiendo una segunda dosis 2 semanas antes del comienzo de la puesta. Este método debería proporcionar la 8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008

9 inmunidad maternal a la progenie a lo largo de un ciclo completo de puesta. No existe información disponible sobre el uso de la vacuna de DHV de tipo II en los patos reproductores. La vacuna viva atenuada de DHV de tipo I o de tipo II administrada subcutáneamente o intramuscularmente a patitos de 1 día de edad protege frente a la enfermedad durante la duración de su susceptibilidad. No existe información disponible sobre el uso de la vacuna de DHV de tipo III para inmunizar activamente patitos de 1 día de edad. Los patos sensibilizados con vacuna viva de DHV de tipo I, y administrados con una sola dosis intramuscular de vacuna inactivada de DHV de tipo I, deberían producir una progenie inmunizada maternalmente durante un ciclo completo de puesta (18). El anticuerpo de yema de huevo ofrece inmunización pasiva en el inicio de un brote. La duración de su eficacia es efímera. e) Estabilidad Las preparaciones acuosas de las vacunas vivas atenuadas de DHV de tipo I, II y III deberían permanecer estables durante al menos 1 año cuando se almacenan congeladas a 70 C o a menor temperatura. Una vez descongeladas, estas vacunas deberían mantenerse a 4 C y usarse en una semana. Las vacunas vivas liofilizadas pueden almacenarse a 2 8 C y deberían retener su potencia durante al menos 1 año. La vacuna inactivada de DHV de tipo I se mezcla con un adyuvante y puede almacenarse a 4 C durante al menos 20 meses sin pérdida de inmunogenicidad. El anticuerpo de yema de huevo puede almacenarse durante 1 año a 4 C. f) Conservantes No se añaden conservantes a las vacunas vivas atenuadas del DHV de tipo I, II y III. Se añade formol (hasta un 0,2% v/v ) a la vacuna inactivada del DHV de tipo I y a la preparación de anticuerpos en yema de huevo. g) Precauciones (riesgos) La vacuna inactivada de DHV de tipo I debería agitarse bien para asegurar que está completamente mezclada antes de usarse. 5. Pruebas en el producto final Las vacunas vivas atenuadas del DHV de tipo I y III se emiten como viales de vacuna concentrada liofilizados o congelados junto con botellas de diluyente estéril en los que se han realizado las pruebas estándar de esterilidad (véase la sección C.4.a.). La vacuna viva atenuada de DHV de tipo II solamente se ha fabricado de forma experimental. a) Inocuidad No se realizan pruebas adicionales después del ensayo del lote en ninguno de los productos. b) Potencia No se realizan pruebas adicionales después del ensayo del lote en ninguno de los productos. REFERENCIAS 1. ASPLIN F.D. (1965). Duck hepatitis. Vaccination against two serological types. Vet. Rec., 77, CHALMERS W.S.K. & WOOLCOCK P.R. (1984). The effect of animal sera on duck hepatitis virus. Avian Pathol., 13, CRIGHTON G.W. & WOOLCOCK P.R. (1978). Active immunisation of ducklings against duck virus hepatitis. Vet. Rec., 102, Manual de la OIE sobre animales terrestres

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