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- Alfredo López Maldonado
- hace 8 años
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17 CERTIFICACIONES...5 AGRADECIMIENTOS...11 ÍNDICE DE CONTENIDO...15 LISTADOS...21 LISTADO DE TABLAS...23 LISTADO DE FIGURAS...23 ABREVIATURAS...27 RESUMEN...33 RESUMEN...35 SUMMARY...36 INTRODUCCIÓN...39 EPIDEMIOLOGÍA DEL CÁNCER COLO-RECTAL...42 GENÉTICA DEL CÁNCER COLO-RECTAL HUMANO...44 Modos de presentación del cáncer colo-rectal humano...44 Taxonomía de los tumores...45 Genómica del cáncer colo-rectal...46 Vías de la carcinogénesis...47 Diferencias clínico-patológicas de las vías de la carcinogénesis...50 SUPERFAMILIA RAS...51 FAMILIA RAS...51 Estructura, biología y relación con el cáncer de los genes RAS...52 GEN KRAS...53 Nomenclatura...53 Estructura...53 Biología...54 KRAS y el cáncer colo-rectal...55 KRAS como factor pronóstico en cáncer colo-rectal...57 KRAS y células troncales...58 Genome-wide screening...59 Nuevas vías de investigación sobre KRAS - Regulación del KRAS mediante micro ARN (miarn)...60 TEORÍAS SOBRE EL ORIGEN DE LAS METÁSTASIS...60 Cascada metastásica seed and soil...62 TEORÍA DE LA GENOMETÁSTASIS...65 Ácidos nucleicos libres en plasma (CNAPS)...65 Base de la hipótesis...66 GENÉTICA APLICADA AL TRATAMIENTO DEL CÁNCER...68 Test genético COLOPRINT...68 Dianas terapéuticas...68 COSTES DE LA DETERMINACIÓN DE MUTACIÓN EN EL GEN KRAS...70 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS...71 HIPÓTESIS...73 OBJETIVOS...74 MATERIAL Y MÉTODOS...75 POBLACIÓN DIANA...77 CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN...77
18 PACIENTES...77 TRATAMIENTO Y SEGUIMIENTO...80 MUESTRAS HUMANAS...81 EXTRACCIÓN DE ADN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS HUMANAS...82 DETECCIÓN DE MUTACIONES DE KRAS HUMANO...82 Detección de mutaciones de KRAS mediante PCR en tiempo real...82 Pruebas de sensibilidad...86 Detección en muestras de plasma...86 Detección de mutaciones de KRAS en tumor mediante secuenciación...86 RECOGIDA DE DATOS...88 Variables principales y su codificación...89 MÉTODO ESTADÍSTICO...95 GRUPOS DE ANÁLISIS...96 CONSIDERACIONES ÉTICAS...97 Protección de datos...97 Consentimiento informado...97 RESULTADOS...99 RESULTADOS DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Resultados de la cuantificación por espectrofotometría en muestras de tumores y plasmas..101 Resultados de la prueba de sensibilidad de la técnica PCR en tiempo real Puesta a punto de la técnica PCR en tiempo real Resultados de la detección de mutación en tumores mediante secuenciación Resultados de la mutacion en el plasma mediante PCR en tiempo real EVOLUCIÓN CLÍNICA DE LOS PACIENTES RESULTADOS DIRIGIDOS A CONOCER CÓMO INFLUYE LA MUTACIÓN DEL GEN KRAS SOBRE LA EVOLUCIÓN CLÍNICA DEL CÁNCER COLO-RECTAL (OBJETIVO 1) Estudio sobre la población total Estudio sobre pacientes con estadios avanzados (IIb, IIIa, IIIb, IV) Estudio sobre pacientes con estadios iniciales (0, I,IIa) RESULTADOS DIRIGIDOS A CONOCER COMO INFLUYE EL ADN TUMORAL LIBRE EN PLASMA SOBRE LA EVOLUCIÓN CLÍNICA DEL CÁNCER COLO-RECTAL (OBJETIVO 2) Estudio sobre la población total Estudio sobre pacientes con estadios avanzados (IIb, IIIa, IIIb, IV) Estudio sobre pacientes con estadios iniciales (0, I, IIa) Estudio sobre los pacientes que presentaron mutación en el tumor RESULTADOS DIRIGIDOS A CONOCER CÓMO INFLUYE EL ADN TUMORAL LIBRE EN PLASMA SOBRE LA EVOLUCIÓN CLÍNICA DEL CÁNCER COLO-RECTAL, DURANTE EL SEGUIMIENTO DE LOS PACIENTES YA OPERADOS (OBJETIVO 3) DISCUSIÓN DISCUSIÓN SOBRE LOS MÉTODOS Tipo de estudio Elección de la población de pacientes con cáncer colo-rectal Pacientes Tratamiento con Cetuximab Elección de la mutación KRAS Elección de la PCR en tiempo real como técnica de detección del gen KRAS mutado en
19 plasma Agrupaciones de pacientes para el cálculo estadístico DISCUSIÓN SOBRE LOS RESULTADOS DIRIGIDOS A CONOCER CÓMO INFLUYE LA MUTACIÓN DEL GEN KRAS SOBRE LA EVOLUCIÓN CLÍNICA DEL CÁNCER COLO- RECTAL (OBJETIVO 1) Población general - secuenciación (AGRUPACIÓN 1) Población general - secuenciación (AGRUPACIÓN 2) Población general CODÓN Pacientes con estadios avanzados (IIb, IIIa, IIIb y IV) Pacientes con estadios iniciales (0, I y IIa) DISCUSIÓN SOBRE RESULTADOS DIRIGIDOS A CONOCER CÓMO INFLUYE EL ADN TUMORAL LIBRE EN PLASMA SOBRE LA EVOLUCIÓN CLÍNICA DEL CÁNCER COLO-RECTAL (OBJETIVO 2) DISCUSIÓN SOBRE RESULTADOS DIRIGIDOS A CONOCER CÓMO INFLUYE EL ADN TUMORAL LIBRE EN PLASMA SOBRE LA EVOLUCIÓN CLÍNICA DEL CÁNCER COLO-RECTAL, DURANTE EL SEGUIMIENTO DE LOS PACIENTES YA OPERADOS (OBJETIVO 3) CONCLUSIONES CONCLUSIONES CONCLUSIONS BIBLIOGRAFÍA PUBLICACIONES...176
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23 Tabla 1. Porcentaje de pacientes con posibilidad de desarrollar metástasis en función del estadio...43 Tabla 2. Porcentaje de pacientes portadores de metástasis hepáticas por CCR que sobreviven 1 y 5 años...43 Tabla 3. Características genéticas de las diferentes vías de la carcinogénesis...49 Tabla 4. Secuencias de los cebadores, sondas FRET y sonda PNA utilizados en los análisis por PCR en tiempo real. Flu: fluorescencia; LC-Red 705: fluoróforo denominado LightCycler-Red 705; P: grupo fosfato; PNA: Peptide Nucleic Acid...84 Tabla 5. Secuencias de los cebadores utilizados en los análisis de secuenciación del ADN de tumores primarios de pacientes con CCR...87 Tabla 6. Codificación de las variables principales. Resultados de técnicas de biología molecular...89 Tabla 7. Variables recogidas en FASE 1: Demográficas y resultados diagnósticos hasta el postoperatorio inmediato. Codificación de las mismas...93 Tabla 8. Variables recogidas en FASE 2: Evolución del pacientes. Codificación de las variables...94 Tabla 9. Tiempos analizados para estudio del pronóstico en términos de supervivencia...94 Tabla 10. Datos demográficos; resultados de los test genéticos; y datos diagnósticos de los 8 pacientes a los que se les analizó la presencia de mutación del gen KRAS en plasma en una segunda extracción de sangre al menos 1 año después de la intervención quirúrgica Tabla 11. Datos de la evolución de los 8 pacientes a quienes se les analizó el gen KRAS en plasma en una segunda extracción de sangre al menos 1 año después de la intervención quirúrgica Tabla 12. Datos de la histología del tumor primario de los 8 pacientes a los que se les analizó el gen KRAS en plasma en una segunda extracción de sangre, al menos 1 año después de la intervención quirúrgica Tabla 13. Comparación de la distribución por estadios con respecto a O Connell. (O Connell, Maggard, y Ko 2004) Figura 1. Tendencia de la mortalidad por cáncer en España. (Cabanes et al. 2010)...42 Figura 2. Factores hereditarios que contribuyen a la aparición de cáncer colo-rectal. (Power, Gloglowski, y Lipkin 2010)...45 Figura 3. Carcinogenética Vía de la inestabilidad cromosómica...48 Figura 4. Localización citogenética del gen KRAS. Tomado de Genetics Home Reference. (Anón. 2012)...54 Figura 5. Las proteínas RAS activan numerosas cascadas de señalización. En su modo activo (GTP) se une directamente a RalGDS, fosfoinositida 3-quinasa o Raf. Estos eventos disparan las cascadas de señales, provocando efectos en numerosos aspectos del desarrollo celular. (F McCormick 1999)...55 Figura 6. Principales mutaciones y su localización en el gen KRAS. Tomado de...56 Figura 7. Modelos teóricos sobre el origen de las metástasis: a) Sólo subpoblaciones determinadas
24 adquieren capacidad metastásica. b) Todas las células tumorales tienen la capacidad de desarrollar metástasis. c) Heterogeneidad dinámica: la frecuencia de aparición de variantes metastásicas en el tumor primario, determina su potencial metastásico. d) Dominancia clonal: dominancia de un subclon con capacidad metastásica en el tumor. e) Teoría de la genometástasis: transferencia horizontal de oncogenes. (Weigelt, Peterse, y van t Veer 2005)...61 Figura 8. Fases de la cascada metastásica - Teoría seed and soil. (Fidler 2003)...64 Figura 9. Cascadas moleculares del cáncer colo-rectal...69 Figura 10. Grupos de pacientes...78 Figura 11. Distribución pacientes por edad...78 Figura 12. Sistema FRET-PNA para la detección de mutaciones puntuales en el codón 12 del exón I del gen KRAS humano. A: unión de las sondas FRET al ADN con mutación en KRAS. B: bloqueo de la secuencia no mutada de KRAS por la sonda PNA...83 Figura 13. Diagrama de recogida de datos...88 Figura 14. Ejemplo de gráfica de la amplificación por PCR en tiempo real de dos muestras de ADN extraído de tumores, con y sin KRAS mutado, respectivamente. A) PCR en tiempo real realizada sin sonda PNA. B) PCR en tiempo real con sonda PNA. Se utilizó la sonda sensor -TGT en ambos casos Figura 15. Ejemplo de gráfica de la amplificación por PCR en tiempo real de dos muestras de ADN extraído de dos plasmas de pacientes con y sin KRAS mutado. Se empleó sonda PNA y sonda sensor GAT. Se pusieron tres réplicas por muestra. Se detectó ADN mutado en uno de los plasmas Figura 16. Distribución de las mutaciones detectadas entre los 69 pacientes a los que se les estudió el plasma Figura 17. Porcentaje de éxitus por causa Figura 18. Porcentaje de pacientes fallecidos clasificados por causa y su relación con la secuenciación (agrupación 1) Figura 19. Porcentaje de pacientes con KRAS wild type o KRAS mutado (agrupación 1) y su relación con la mortalidad global Figura 20. Porcentaje de pacientes con KRAS wild type o KRAS mutado (agrupación 1) y su relación con la presencia o ausencia de metástasis en cualquier órgano sincrónicas y metacrónicas Figura 21. Porcentaje de pacientes con KRAS wild type o KRAS mutado (agrupación 1) y su relación con la presencia o ausencia de metástasis pulmonares sincrónicas y metacrónicas Figura 22. Porcentaje de pacientes clasificados por el siguiente patrón clínico: 0 corresponde a la ausencia de metástasis y 1a la presencia de metástasis (sincrónicas, metacrónicas, hepáticas y pulmonares) y su relación con la secuenciación (agrupación 1) Figura 23. Supervivencia (tiempo transcurrido entre la intervención y el evento éxitus o final del seguimiento) en función de la secuenciación (agrupación 1) Figura 24. Supervivencia (tiempo transcurrido entre la aparición de la primera metástasis y el evento éxitus o final del seguimiento) en función de la secuenciación (agrupación 1) Figura 25. Supervivencia (tiempo transcurrido entre la intervención quirúrgica y el evento aparición de la primera metástasis o final del seguimiento) en función de la secuenciación (agrupación 1) Figura 26. Porcentaje de pacientes clasificados por la afectación de más o menos de tres órganos afectos y su relación con la secuenciación (agrupación 2) Figura 27. Porcentaje de pacientes clasificados por la presencia o ausencia de metástasis pulmonares metacrónicas y sincrónicas y su relación con la secuenciación (agrupación 2) Figura 28. Porcentaje de pacientes con presencia de metástasis metacrónicas no hepáticas y su relación con la secuenciación (agrupación 2)...117
25 Figura 29. Porcentaje de pacientes clasificados por sexo y su relación con la localización de la mutación (codón 12 o 13) Figura 30. Porcentaje de pacientes clasificados por el tamaño del tumor y su relación con la presencia o ausencia de mutación del gen KRAS en el tumor Figura 31. Porcentaje de pacientes clasificados por la respuesta linfoide en tumor y su relación con la presencia o ausencia de mutación del gen KRAS en el tumor Figura 32. Proporción de pacientes que han recibido tratamiento con cetuximab o no y su relación con la presencia o ausencia de KRAS mutado en el tumor Figura 33. Proporción de pacientes que durante su evolución presentan una recidiva local o no y su relación con la presencia o ausencia de mutación del gen KRAS en el tumor Figura 34. Población estadios avanzados. Proporción de pacientes con más o menos de 5 metástasis y su relación con la secuenciación del tumor Figura 35. Población estadios avanzados. Proporción de pacientes con presencia o ausencia de metástasis hepáticas sincrónicas y su relación con la presencia o ausencia de mutación en el tumor Figura 36. Población estadios avanzados. Proporción de pacientes con presencia o ausencia de metástasis metacrónicas y sincrónicas de cualquier tipo y su relación con la presencia o ausencia de mutación del gen KRAS en el tumor Figura 37. Población estadios avanzados. Supervivencia (tiempo transcurrido desde la la intervención quirúrgica hasta el evento aparición de la primera metástasis o final del seguimiento) y su relación con la presencia o ausencia de mutación en el gen KRAS en el tumor Figura 38. Población estadios iniciales. Proporción de pacientes clasificados por el grado de diferenciación del tumor y su relación con la presencia o ausencia de mutación del gen KRAS en el tumor Figura 39. Proporción de pacientes clasificados por sexo y su relación con la presencia o ausencia de mutación KRAS en el plasma Figura 40. Proporción de pacientes que han recibido o no tratamiento con bevacizumab y su relación con la presencia o ausencia de mutación del gen KRAS en plasma Figura 41. Población estadios iniciales. Proporción de pacientes clasificados por la histología del tumor y su relación con la presencia o ausencia de mutación del gen KRAS en el plasma Figura 42. Supervivencia (tiempo transcurrido desde la intervención quirúrgica hasta la aparición de la primera metástasis) y su relación con la presencia o ausencia de mutación del gen KRAS en el plasma Figura 43. Población pacientes con tumor mutado. Supervivencia (tiempo transcurrido entre la intervención quirúrgica hasta el fallecimiento o final del seguimiento) y su relación con la presencia o ausencia de KRAS mutado en el plasma tumor mutado...132
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48 KRAS KRAS
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78 OBJETIVO 1: Correlación evolución con KRAS mutado en tumor (SECUENCIACIÓN) OBJETIVO 2: Correlación evolución con KRAS mutado en plasma (PCR en tiempo real) OBJETIVO 3: Correlación evolución con KRAS mutado en plasma en una segunda extracción realizada durante el seguimiento de los pacientes ya operados (PCR en tiempo real) KRAS
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83 KRAS MUTADO KRAS NO MUTADO BLOQUEADO
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88 SECUENCIACIÓN de exón 1 del gen KRAS: Se analizaron tumores de 244 pacientes PCR en tiempo real de 164 pb del exón 1 del gen KRAS (análisis específico codón 12): Se analizaron plasmas de 69 pacientes
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102 Tumor con KRAS mutado (mutación Gly12Cys) Tumor con KRAS mutado (mutación Gly12Cys) Tumor sin KRAS mutado Control negativo (agua) Tumor sin KRAS mutado y control negativo (agua)
103 Tumor con KRAS mutado (mutación Gly12Asp) Plasma de paciente con mutación en KRAS KRAS,
104 36 pacientes con KRAS mutado en tumor 19 con KRAS mutado en plasma (una de ellas diferente al tumor 11 con KRAS no mutados y 6 indeterminados (por mutación GAC en codón 13) en plasma 33 pacientes con KRAS no mutado en tumor 33 con KRAS no mutado en plasma
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107 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Causas de fallecimiento Postoperatorias Otras CCR No 20% 10% 0% GGT GTT, AGT, TGT GCT, CGT GAC, GAT Secuenciación (Agrupación 1)
108 100% 90% 80% 70% Mortalidad Global 60% 50% 40% 30% Sí No 20% 10% 0% GGT GTT, AGT, TGT GCT, CGT GAC, GAT Secuenciación (Agrupación 1)
109 100% 90% 80% Metástasis en cualquier órgano sincrónicas y metacrónicas 70% 60% 50% 40% Sí No 30% 20% 10% 0% GGT GTT, AGT, TGT GCT, CGT GAC, GAT Secuenciación (Agrupación 1)
110 100% 90% 80% 70% Metástasis pulmonares sincrónicas y metacrónicas 60% 50% 40% Sí No 30% 20% 10% 0% GGT GTT, AGT, TGT GCT, CGT GAC, GAT Secuenciación (Agrupación 1)
111 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% GAT, GAC GCT, CGT GTT, AGT, TGT GGT 30% 20% 10% 0% #0000 #0100 #0101 #0110 #0111 #1000 #1001 #1010 #1011 #1110 #1111 Secuenciación (Agrupación 1)
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115 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% Tres o más órganos con metástasis Menos de tres órganos con metástasis 30% 20% 10% 0% GGT GAT OTROS Secuenciación (Agrupación 2)
116 100% 90% 80% 70% Metástasis pulmonares sincrónicas y metacrónicas 60% 50% 40% Sí No 30% 20% 10% 0% GGT GAT OTROS Secuenciación (Agrupación 2)
117 100% 90% 80% 70% 60% Metástasis metacrónicas no hepáticas 50% 40% Otras Carcinomatosis Pulmonares 30% 20% 10% 0% GGT GAT OTROS Secuenciación (Agrupación 2)
118 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% Mujer Hombre 30% 20% 10% 0% Codón 12 Codón 13
119 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% Tamaño del tumor T2, T3, T4 T0, Tis. T1 30% 20% 10% 0% No Mutación KRAS Tumor Sí
120 100% 95% 90% Respuesta Linfoide Respuesta moderada o alta 85% Respuesta escasa 80% 75% No Sí Mutación KRAS del Tumor
121 100% 98% 96% Cetuximab 94% 92% 90% Sí No 88% 86% 84% No Sí Mutación KRAS del Tumor
122 100% 98% 96% 94% Aparición de recidiva local 92% 90% 88% Sí No 86% 84% 82% 80% No Sí Mutación KRAS del Tumor
123 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% Número de Metástasis Ninguna Menos de 5 Más de 5 20% 10% 0% AGT CGT GAC GAT GCT GGT GTT TGT Secuenciación del Tumor
124 100% 90% 80% 70% Metástasis hepáticas sincrónicas 60% 50% 40% 30% GAT GGT 20% 10% 0% No Sí Mutación KRAS en el Tumor
125 100% 95% 90% Grado de diferenciación del tumor Poco diferenciado 85% Bien o moderadamente diferenciado 80% 75% T2, T3, T4 T0, Tis, T1 Mutación KRAS en el Tumor
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128 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% No Mutación KRAS PLASMA Sí Mujeres Varones
129 100% 90% 80% 70% 60% BEVACIZUMAB Sí No 50% 40% 30% 20% 10% 0% No Mutación KRAS PLASMA Sí
130 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% Histología del tumor Mucinosos No Mucinosos 30% 20% 10% 0% No Sí Mutación KRAS en el PLASMA
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