MINISTERIO DE EDUCACIÓN Y CIENCIA

Transcripción

1 Referencia: PTR OP MINISTERIO DE EDUCACIÓN Y CIENCIA DIRECCIÓN GENERAL DE INVESTIGACIÓN PETRI INFORME FINAL Investigador Principal Título del Proyecto: Dr. D.Juan Muñoz Blanco Aplicación de bioensayos basados en QRT-PCR para la determinación de la capacidad elicitora de respuestas de defensa de plantas por compuestos derivados de algas y de interés agronómico. PTR OP Organismo: UNIVERSIDAD DE CORDOBA Centro: Departamento: Bioquímica y Biología Molecular Empresa Cofinanciadora: Fecha de Inicio: 15 de Octubre del 2005 Fecha de Finalización: 15 de Octubre del 2007 Fecha: 8 de Enero de 2008 Ilmo. Sr. Subdirector General de Proyectos de Investigación C/ALBACETE MADRID

2 PROCEDIMIENTO PARA RELLENAR ESTE INFORME: El informe científico-técnico aportado por el investigador y el informe de la OTRI, cuando esta haya gestionado la solicitud, sino no es necesario, deben incluirse en la aplicación informática como un único documento. El IP realizará el informe científico técnico de acuerdo a este modelo y lo remitirá a la OTRI para que lo complete. El informe final debe introducirse en la aplicación informática junto con la justificación del gasto. A. MEMORIA. Resumen de las actividades realizadas y de los resultados del proyecto en relación con los objetivos propuestos Destaque su relevancia científico-técnica y el grado de consecución de los objetivos fijados. En el caso de haber obtenido resultados no previstos inicialmente, indique su relevancia para el proyecto. En caso de resultados fallidos, indíquense las causas. Los objetivos del grupo de la Universidad de Córdoba (UCO) previstos en el proyecto e eran: Bioensayos moleculares por QRT-PCR que permitan determinar la capacidad que poseen los extractos obtenidos a partir de algas marinas y que se producirán en las diferentes actividades de este proyecto, para inducir los mecanismos moleculares que subyacen a las respuestas de defensa de las plantas (fresa y olivo) Determinar cuales son las vías involucradas en los mecanismos de defensa de la planta que son activadas por los extractos obtenidos (vías dependientes de ácido salicílico, ácido jasmónico, etileno y vías independientes de estas tres respuestas señales) Determinar los efectos sinérgicos y antagónicos de los compuestos analizados Optimizar dosis y tiempos de aplicación Hacer una valoración de los compuestos producidos por las empresas participantes, determinar las posibles sinergias entre los mismos, asistir a las formulaciones de los compuestos que las empresas desarrollen de manera que se puedan obtener formulaciones de manera dirigida y que sean más adecuadas y compatibles medioambientalmente. Para realizar estos objetivos se solicitó una financiación euros, la cantidad concedida fué de euros. El grupo de la UCO recibió por parte del grupo de investigación de la Universidad de Las Palmas, las siguientes muestras: Microalga Código Forma de procesar la muestra M=molido; T=triturada;P= politroneada H.musciformis M2 M H.musciformis M3 P H.spinella M4 G.cornea M6 M G.chilensis M7 T G.chilensis M9 P U.rigida M11 M G.sesquipedale M13 M A.nodosum M14 T Durviella máxima M21 M C.abies marina M22 T

3 C.abies marina M25 P Eklonia maxima M43 M Sargasum muticum M44 T Por otra parte de recibieron las siguientes muestras de los procesados del grupo de la Universidad de Alcalá de Henares (UAH). Muestra (Estreptomicetos) Algas BM1 Sustrato 24 BM2 Sustrato 24 BM3 Sustrato 713 BM4 Sustrato 713 BM5 Sustrato 1444 BM6 Sustrato 1444 CBM 1-2 Sustrato 24 CBM 3-4 Sustrato 713 CBM 5-6 Sustrato 1444 Muestra (Hongos) Algas HM1 Sustrato 24 HM2 Sustrato 24 HM3 Sustrato 713 HM4 Sustrato 713 HM5 Sustrato 1444 HM6 Sustrato 1444 CMH 1-2 Sustrato 24 CMH 3-4 Sustrato 713 CMH 5-6 Sustrato 1444 Sustrato 24, está constituido por mezclas de algas carregenofitas (M2+M4). Sustrato 713, está constituido por mezclas de algas agarofitas (M7+M13). Sustrato 1444, está constituido por mezclas de algas pardas (M14+M44). M2: Hypnea musciformis (Rodophyta) M4: Hypnea spinella (Rodophyta) M7: Gracilaria chilensis (Rodophyta) M13: Graciliaria sesquipedale (Rodophyta) M14: Ascophyllum nodosum (Phaeophyta) M44: Sargasum muticum (Paheophyta). Con el objetivo de determinar la capacidad inductora de los extractos recibidos de inducir los mecanismos de defensa de las plantas, se utilizó un bioensayo por QRT-PCR y utilizando inicialmente como biomarcador de inducción, los aumentos de las cantidades de transcrito del gen FaCAD1. Este gen codifica una cinnamil alcohol deshidrogenasa implicada en biosíntesis de ligninas defensivas. En estudios anteriores realizados por nuestro grupo de investigación ( ), hemos demostrado que la expresión de este gen induce su expresión de manera significativa, por las moléculas inductoras de los mecanismos de defensa de las plantas, ácido salicílico (SA) y metil jasmonato (MeJ). En estudios previos hemos contrastado que el gen FaCAD1 se induce por interacción de la planta de fresa con el patógeno fúngico Colletotrichum acutatum. Como sistema biológico hemos utilizado cultivos celulares de fresa, por ser un sistema de evaluación rápido y de manejo muy flexible. La operatividad de este sistema se ha optimizado previamente a lo largo del desarrollo de un proyecto Petri, en el que se ha observado una correlación positiva entre el aumento de los niveles de inducción del gen FaCAD1 por tratamiento de cultivos celulares de fresa con compuestos biológicos y el grado de protección contra hongos patógenos que se observa cuando plantas de fresa se tratan con los citados compuestos y posteriormente se inoculan con hongos patógenos. Metodología utilizada 2

4 Para determinar los cambios de transcrito correspondientes al gen FaCAD1 tras el tratamiento con compuestos elicitores, se utilizó la técnica de QRT-PCR, utilizando cebadores deducidos del extremo 3 -UTR del gen FaCAD1. Como gen control se utilizó un gen de expresión constitutiva y que codifica un interespaciador 5S-16 S (F413). Previamente, habíamos seleccionado Brevemente, tras el tratamiento de los cultivos celulares con los compuestos de interés y a las dosis de interés, se procedió a recoger las células tratadas y las controles (no tratadas con el compuesto inductor) a los tiempos de tratamiento indicados. Posteriormente se extrajo de las mismas el ARN y con el objetivo de eliminar contaminación de ADN genómico, el ARN con DNasaI. Posteriormente se tomaron 2 µg de ARN y se retrotranscribió utilizando el kit iscript de la casa BIO-RAD. Posteriormente se utilizaron 2 µl de la reacción de RT para cada una de las reacciones de PCR. Como fluoróforo se utilizó SYBER-Green. Cada muestra se analizó por triplicado. Para cada reacción problema se realizó en paralelo una reacción control de normalización con el gen de expresión constitutiva. Experimentos realizados para cada uno de los compuestos enviados por la Universidad de las Palmas. 1.- Experimentos de gradiente de concentración: En estos experimentos, se procedió a aplicar las muestras enviadas a diferentes concentraciones del compuesto (0.5%, 1%, 2%,3% y 4%). Los cultivos celulares tratados se muestrearon a las 2, 4, 6 y 8 horas. Como control, se muestrearon muestras de cultivos celulares de fresa sin tratar a los mismos tiempos. Como control positivo de los experimentos de utilizaron muestras de cultivos celulares de fresa tratadas con ácido salicílico (SA) y muestreadas a los mismos tiempos. Todos los experimentos fueron repetidos 3 veces. Ninguno de los productos aplicados motivó un aumento de la cantidad de transcrito correspondiente al gen marcador (FaCAD1). Fig.1.- Efecto del tratamiento de cultivos celulares de fresa con el sustrato M14 Ascophyllum nodosum (Phaeophyta) al 4% (p/v), sobre los perfiles de expresión del gen marcador FaCAD1 (medido por QRT-PCR). Los resultados se representan en relación a la muestra que presentó un menor nivel de expresión, a la que se le dió, arbitrariamente, un valor de expresión equivalente a la unidad. Como los resultados obtenidos fueron negativos, y considerando que sin embargo el SA si produjo el aumento esperado de la expresión del gen biomarcador, procedimos a repetir los experimentos anteriores pero incrementando la concentración de bioproducto (10,15 y 20%). Como en el caso anterior no se observó un aumento de los niveles de expresión del gen biomarcador. Estos resultados nos indican que los bioextractos experimentales que nos enviaron desde la Universidad de las Palmas y que se corresponden con hidrolizados de algas, no poseen capacidad inductora de los mecanismos de defensa de las plantas. Ello, puede ser debido o bien a que el sistema de hidrólisis empleado ha degradado completamente las biomoléculas inductoras de los mecanismos de defensa de las plantas o bien debido a la inexistencia en las especies de algas seleccionada de estructuras moleculares que son capaces de motivar este tipo de inducciones. Estudios realizados con los compuestos enviados por la empresa NBT y enviados por la empresa Seaweed Canarias. Se procedió a realizar experimentos similares con aquellos compuestos enviados por la empresas participantes en el proyecto. 3

5 Empresa NBT Se recibe de la empresa NewBiotechnic los siguientes extractos derivados de algas: Algas 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Por indicaciones de la empresa, se procedió a realizar ensayos de inducción. En este caso se utilizó una concentración de la mezcla inductora sugerida por la empresa y que fué del 5%.Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Cada datos de cada replica también se llevó a cabo por triplicado. Los resultados obtenidos con el gen marcador FaCAD1 indicaron que prácticamente todas las mezclas aplicadas (con la excepción de algas 4) motivaron un aumento significativo de los niveles de transcrito del gen marcador. En este experimento de utilizaron como controles cultivos celulares tratados con salicilato (SA), así como cultivos celulares tratados con Acadian (un extracto procedente de algas marrones, Ascophyllum nodosum) y que se comercializa como un extracto biológico inductor de los mecanismos de defensa de las plantas. La potencia de inducción de la expresión del biomarcador fué en sentido decreciente Algas 8>Algas 5 = Algas 7= SA> Algas 3= Algas 1>Algas 6= Algas 9= Algas 10= Algas 12 = Algas 1= Algas 11= Acadian. CAD Valores relativos de expresión Acadian SA Algas 1 Algas 2 Algas 3 Algas 4 Algas 5 Algas 6 Algas 7 Algas 8 Algas 9 Algas 10 Algas 11 Algas 12 Tratamientos Fig.2.- Perfiles de expresión del gen marcador FaCAD1,determinados por QRT-PCR,en respuesta al tratamiento de cultivos celulares de fresa con extractos de algas de la empresa NBT. Las células se recogieron a las 6 horas de tratamiento. Los compuestos derivados de algas se aplicaron a los cultivos celulares despues de 4 dias de recuperación de los mismos después de su subcultivo. Los resultados se representan en relación a la muestra que mostró menor nivel de expresión del gen FaCAD1, a la que se le dió, arbitrariamente, el valor de la unidad. También se recibieron de la empresa NBT una serie de extractos nomenclados como, HCH y Q8, y que según comunicación de la empresa eran extractos vegetales. Se procedió a analizar el efecto inductor de estos compuestos, utilizándo el biomarcador FaCAD1. La concentración utilizada en estos ensayos fué también la recomendada por la empresa y fué del 1% (p/v). Los resultados a esas concentraciones nos indicó que solamente el extracto HCH fué capaz de inducir el gen biomarcador de manera significativa. Si embargo, no se observaron inducciones de expresión del gen biomarcador con el compuesto Q8. Por ello, se procedió ha llevar a cabo estudios con el compuesto Q8 a concentraciones crecientes (desde 1-10%, p/v). En ningún caso se consiguieron valores de inducción significativos de la expresión del gen biomarcador por lo que se descartó que tuviera capacidad inductora de los mecanismos de defensa de plantas. 4

6 Elicitor Q8 (NBT) Valor relativo expresión génica 1 5,0-5,0-1 -3,7-2,7 C 4h Q8 4h C 8h Q8 8h Tiempo (horas) NPR1 ELICITOR Q8 (NBT) Valor relativo expresión génica 5,0-5, ,0-2 -1,2 Q8 0,1% -2,8 Q8 0,2% -1,4 Q8 0,4% -3,1 Q8 0,6% -2,0-1,5 Q8 0,8% Q8 1% CONCENTRACIÓN (p/v) CAD Fig.3.- Perfiles de expresión del gen marcador FaCAD1,determinados por QRT-PCR,en respuesta al tratamiento de cultivos celulares de fresa con extractos vegetales suministrados por la empresa NBT (Q8). Las células se recogieron a las 6 horas de tratamiento. Los compuestos derivados de algas se aplicaron a los cultivos celulares despues de 4 dias de recuperación de los mismos después de su subcultivo. Los resultados se representan en relación a la muestra que mostró menor nivel de expresión del gen FaCAD1, a la que se le dió, arbitrariamente, el valor de la unidad. Asimismo, se ha procedido a realizar experimentos de gradiente de concentración con el compuesto inductor HCH. Los rangos de concentración analizados fueron: 0.1%, ; 0.2 %; 0.4%; 0.6%; 0.8%; 1%; 2%; 4%. Se observó que a una concentración del 1% p/v se consiguieron los máximos niveles de inducción de los niveles de transcrito del gen biomarcador. Estos niveles máximos de inducción de la expresión no aumentaron a concentraciones superiores al 1%. Ello indica que la concentración óptima de aplicación fué del 1% p/v. No obstante dependiendo de las diferentes extracciones en la que potencialmente puede variar la concentración del compuesto activo estas concentraciones óptimas habría que determinarlas mediante análisis de inducción utilizando el biomarcador FaCAD1. 5

7 Elicitor HCH (NBT) Valor relativo expresión génica ,5 23,7 C 4h HCH 4h C 8h HCH 8h Tiempo (horas) CAD Elicitor HTCH (NBT) Valor relativo expresión génica 2 15,0 1 5,0 13,1 10,3 C 4h HTCH 4h C 8h HTCH 8h Tiempo (horas) CAD Fig.4.- Perfiles de expresión del gen marcador FaCAD1,determinados por QRT-PCR,en respuesta al tratamiento de cultivos celulares de fresa con extractos vegetales suministrados por la empresa NBT (HCH). Las células se recogieron a las 4 ny 8 horas de tratamiento. Los compuestos derivados de algas se aplicaron a los cultivos celulares despues de 4 dias de recuperación de los mismos después de su subcultivo. Los resultados se representan en relación a la muestra que mostró menor nivel de expresión del gen FaCAD1, a la que se le dió, arbitrariamente, el valor de la unidad. ELICITOR HCH (NBT) Valor relativo expresión génica 16,0 14,0 12,0 1 8,0 6,0 4,0 2,0 2,3 1,1 5,2 10,3 9,6 14,9 HCH 0,1% HCH 0,2% HCH 0,4% HCH 0,6% HCH 0,8% HCH 1% CONCENTRACIÓN (p/v) CAD 6

8 Fig.5.- Perfiles de expresión del gen marcador FaCAD1,determinados por QRT-PCR,en respuesta al tratamiento de cultivos celulares de fresa con diferentes concentraciones de extractos vegetales suministrados por la empresa NBT (HCH). Las células se recogieron a las 8 horas de tratamiento. Los compuestos derivados de algas se aplicaron a los cultivos celulares despues de 4 dias de recuperación de los mismos después de su subcultivo. Los resultados se representan en relación a la muestra que mostró menor nivel de expresión del gen FaCAD1, a la que se le dió, arbitrariamente, el valor de la unidad. Empresa Seaweed Canarias Los únicos productos recibidos de la empresa Seaweed Canarias fueron los compuestos que comercializan y denominados Algacan Premium, Algacan Base y Algacan Plus. A pesar de solicitarle más productos para ser estudiados no se nos enviaron productos adicionales. Las características de estos productos son: ALGACAN PREMIUM es un extracto concentrado 100% natural a base de una selección de algas pardas, algas rojas y espirulina. Es un producto totalmente biodegradable y no tóxico, apto para su uso en agricultura convencional, integrada o ecológica. Se aplica por vía foliar o radicular. Se supone que el mecanismo de acción, se debe a la sinergia de los diversos compuestos bioactivos extraídos de las algas. Posee un elevado contenido en fitohormonas (citoquininas y auxinas), en oligosacáridos y en aminoácidos que estimulan el desarrollo de la planta y activan su sistema de defensa. ALGACAN PLUS es un extracto concentrado 100% natural a base de una selección de algas pardas y algas rojas. Es un producto totalmente biodegradable y no tóxico, apto para su uso en agricultura convencional,integrada o ecológica.puede aplicarse por cualquier sistema de riego. La acción de ALGACAN PLUS se debe a la sinergia de los diversos compuestos bioactivos extraídos de las algas marinas. Tiene un elevado contenido en fitohormonas (citoquininas y auxinas) y en oligosacáridos que estimulan el desarrollo de la planta y activan su sistema de defensa. ALGACAN BASE es un extracto concentrado 100% natural a base de una selección de algas pardas. Es un producto totalmente biodegradable y no tóxico, apto para su uso en agricultura convencional, integrada o ecológica.. Puede aplicarse por cualquier sistema de riego. La acción de ALGACAN BASE se debe a la sinergia de los diversos compuestos bioactivos extraídos de las algas marinas. Tiene un elevado contenido en fitohormonas (citoquininas y auxinas) y en oligosacáridos que estimulan el desarrollo de la planta y activan su sistema de defensa. Por ello, procedimos a analizar los compuestos anteriormente citados. Incialmente se analizó el efecto de los bioinductores a las concentraciones de uso que indica la empresa suministradora que fué al 1% v/v. CAD Valores relativos de expresión Acadian SA Algas Premium Algas base Algas Plus Tratamientos 7

9 Fig.6.- Perfiles de expresión del gen marcador FaCAD1,determinados por QRT-PCR,en respuesta al tratamiento de cultivos celulares de fresa con extractos de algas de la empresa Seaweed Canarias (ALGACAN PREMIUM, ALGACAN PLUS, ALGACAN BASE). Las células se recogieron a las 6 horas de tratamiento. Los compuestos derivados de algas se aplicaron a los cultivos celulares despues de 4 dias de recuperación de los mismos después de su subcultivo y a una concentración del 1% (v/v). Los resultados se representan en relación a la muestra que mostró menor nivel de expresión del gen FaCAD1, a la que se le dió, arbitrariamente, el valor de la unidad. Los resultados obtenidos con estos productos indicaron que inducen de manera muy potente la expresión del biomarcador. La capacidad de inducción observada en intensidad decreciente fué: Algacan Premiun >Algacan Plus> Algacan Base Los resultados indican la existencia de una acción sinérgica entre los extractos de algas pardas, algas rojas y espirulina. No obstante, resaltar que los extractos de algas pardas de la compañía Seaweed Canarias produjeron un aumento de los mecanismos de defensa de la planta (medidos por los niveles de expresión del gen biomarcador) que fué superior cuantitativamente a los observados tanto para los extractos comerciales ACADIAN como al observado por adición de SA. Búsqueda de nuevos genes marcadores para cuantificar la capacidad de inducción de los mecanismos de defensa en plantas de fresa por compuestos biológicos elicitores. Con el objetivo de determinar la capacidad que puedan poseer otros genes para ser utilizados como marcadores de capacidad de inducción de los mecanismos de defensa contra patógenos en fresa, seleccionamos otros dos genes. El gen FaWKRY, que codifica un factor de transcripción envuelto en la regulación de mecanismos de defensa de plantas y el gen FaβGlu que codifica una endoβ-glucanasa de fresa. En nuestro laboratorio hemos contrastado que ambos genes inducen su expresión claramente en la interacción entre Colletotrichum acutatumfresa. Por ello, hemos procedido a contrastar si ambos genes inducen su expresión por los mismos compuestos que inducen la expresión del gen biomarcador FaCAD1. En nuestras condiciones experimentales, ambos genes aumentaron de manera significativa su expresión por aquellos extractos bioinductores que motivaron un aumento de la expresión del gen FaCAD1, lo que demuestra que ambos genes pueden tambien utilizarse como bioindicadores de la capacidad inductora de los mecanismos de defensa de plantas de extractos biológicos. 8

10 WRKY Valores relatios de expresión Acadian SA Algas 1 Algas 2 Algas 3 Algas 4 Algas 5 Tratamientos Algas 6 Algas 7 Algas 8 Algas 9 Algas 10 Algas 11 Algas 12 WRKY Valores relaivos de expresión Acadian SA Algas Premium Algas base Algas Plus Tratamientos B-Glucanasa Valores relativos de expresión Acadian SA Algas 1 Algas 2 Algas 3 Algas 4 Algas 5 Algas 6 Algas 7 Tratamientos Algas 8 Algas 9 Algas 10 Algas 11 Algas 12 9

11 B-Glucanasa Valores relativos de expresión Acadian SA Algas Premium Algas base Algas Plus Tratamientos Fig.7.- Perfiles de expresión de los genes FaWKRY y FaβGlu,determinados por QRT-PCR,en respuesta al tratamiento de cultivos celulares de fresa con extractos de algas procedentes de la empresa NBT y de la empresa Seaweed Canarias (ALGACAN PREMIUM, ALGACAN PLUS, ALGACAN BASE). Las células se recogieron a las 6 horas de tratamiento. Los compuestos derivados de algas se aplicaron a los cultivos celulares despues de 4 dias de recuperación de los mismos después de su subcultivo y a una concentración del 1% (v/v). Los resultados se representan en relación a la muestra que mostró menor nivel de expresión del de los genes motivo de estudio(fawkry y FaβGlu), a la que se le dió, arbitrariamente, el valor de la unidad. B. RESULTADOS MÁS RELEVANTES TRANSFERIDOS A LA EMPRESA Resuma brevemente el grado de transferencia de los resultados a la empresa y el grado de aplicación. Número de informes entregados. Relevancia de los resultados transmitidos, etc. El encargado de transmitir los resultados a las empresas colaboradoras es el coordinador general del Proyecto. No obstante los resultados obtenidos en el presente proyecto han permitido transferir a las empresas la tecnología de qrt-pcr con genes marcadores de inducción de mecanismos de defensa, lo que permite tanto una selección adecuada de compuestos inductores de mecanismos de defensa en plantas, utilizando los biomarcadores estudiados, como una cuantificación adecuada de las dosis y mezclas de los mismos para desarrollar formulaciones adecuadas susceptibles de ser comercializadas. 10

12 C. OTROS RESULTADOS DEL PROYECTO Indicar si los resultados alcanzados en el proyecto ha dado lugar a la solicitud de alguna patente u otro título de propiedad. O se han hecho públicos a través de artículos en revistas de alto índice de impacto, comunicaciones a congresos, publicaciones sectoriales, etc. Parte de los resultados se han presentado al XIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Fitopatología, celebrado en Murcia en También, se han presentado en el VI International Strawberry Symposium ISHS. Huelva Spain March No es interés de las compañías que participan en este Petri el realizar una patente de la metodología desarrollada, sino el mantenerlal como know-how de las empresas. Por lo mismo, estamos en negociación con las empresas para determinar si los resultados de las investigaciones realizadas son o no suceptibles de ser patentadas de acuerdo a los intereses empresariales. Patentes y otros títulos de propiedad ( ) registrados ( ) en explotación ( ) España ( ) extranjero Artículos científicos en revistas ( ) nacionales ( ) internacionales Artículos de divulgación en revistas ( ) nacionales ( ) internacionales Artículos de revisión en revistas ( ) nacionales ( ) internacionales Libros, capítulos de libros y monografías ( ) nacionales ( ) internacionales Conferencias en congresos (por invitación) ( ) nacionales ( ) internacionales D. PROYECTOS COORDINADOS Describa las actuaciones de coordinación entre subproyectos, y los resultados de dicha coordinación en relación a los objetivos globales del proyecto. Corresponde al Coordinador General. E. RESUMA BREVEMENTE SU GRADO DE SATISFACCIÓN CON LA COLABORACIÓN EMPRESARIAL Indique el grado de participación de la empresa en el proyecto. La posibilidad de continuar colaborando en este programa o en otros de similares características. El grado de colaboración y satisfacción con la empresas ha sido óptimo. En este sentido hay que resaltar que como continuación de este proyecto se ha solicitado otro Proyecto Petri con las mismas empresas más la empresa NBT. Este proyecto ha sido concedido (PET2007_0224_01) y está dirigido como IP por el Dr José Luis Caballero Repullo, miembro del equipo investigador de este subproyecto. 11

13 F. GASTOS REALIZADOS Nota: Debe cumplimentarse este apartado independientemente de la justificación económica enviada por el organismo. 1.- Indique el total de gasto realizado en el proyecto: Ver certificado económico 2.- Comente brevemente si ha habido algún tipo de incidencia en este apartado que desee reseñar. 12