TP1: Diluciones. Objetivos. Introducción. Introducción a la Biología Celular y Molecular

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1 TP1: Diluciones Objetivos Familiarizarse con las unidades mas utilizadas en biología molecular y ser capaces de intercambiar ágilmente las distintas unidades. Familiarizarse con el material de uso corriente en el laboratorio, la preparación de soluciones y el empleo de diluciones a partir de soluciones concentradas. Introducción Cuando una solución es de uso corriente en un laboratorio, se suele preparar una solución madre o stock, que se encuentra en una concentración mayor de la que se utiliza. A partir de ésta, se realiza una dilución para preparar la solución a la concentración de uso. Se dice que una solución es N X (N por) cuando esta concentrada N veces respecto de la de uso corriente. Ej.: PBS 5X es una solución stock de PBS 5 veces más concentrada que el PBS de uso normal (ó 1X ). Puede prepararse PBS 1X haciendo una dilución 1/5 de la solución stock (para 500 ml: 100 ml PBS stock ml H 2 O bidestilada) A veces es necesario diluir mucho una solución concentrada (Ej: 1/10 4, 1/10 6 ). En estos casos se suelen hacer diluciones sucesivas o diluciones seriadas para disminuir los errores de medición al pipetear volúmenes muy pequeños. Ej.: Preparar 1 ml de una solución de un anticuerpo que contenga 0.1 µg/ml, a partir de una solución stock de 1 mg/ml. Debería realizarse una dilución 1/10000 (1/10 4 ) es decir pipetear 0.1 µl stock µl buffer de dilución. Conviene entonces hacer diluciones sucesivas que, con menor error de pipeteo, permitan alcanzar la concentración buscada. Ej. 4 diluciones sucesivas: 1/10 x 1/10 x 1/10 x 1/10 = 1/ Tener en cuenta: Las soluciones diluidas se expresan a menudo en "mili...", "micro...", "nano...", "pico...", "fento...". Ej: 10 µm, 1 pg/ml, etc. Recordar: 1 mmol (milimol) = 10-3 moles (aplicable a otras unidades: gramo, etc.) 1 µmol (micromol) = 10-6 moles 1 nmol (nanomol) = 10-9 moles 1 pmol (picomol) = moles 1 fmol (fentomol) = moles Formas de expresar concentraciones La masa de sustancia que corresponde a un mol de moléculas de esa sustancia es lo que conocemos como masa molar M (se utiliza también el término peso molecular PM) y se expresa en gramos. Ej: la masa molar del oxígeno O 2 es de 32 g/mol y del agua 18 g/mol. Pero OJO! no confundir con la masa molecular relativa Mr, que aunque coincide numericamente con M no lleva unidades de masa, sino que, justamente es relativa y nos -1-

2 dice cuantas veces más pesada es una molécula de una sustancia respecto de la unidad de masa atómica (u.m.a.), ó de 1 Dalton (Da), que corresponde al átomo hidrógeno. Así, la Mr del agua es 18 u.m.a. o 18 Da, o bien, 18 veces más pesada que un átomo de hidrógeno. Unidades de concentración % p/p: Porcentaje masa en masa, g de soluto por cada 100 g de solución (SN) (soluto + solvente). % p/v: Porcentaje masa en volumen, g de soluto por cada 100 cm 3 o 100 ml de SN. % v/v: Porcentaje volumen en volumen, ml de soluto por cada 100 ml de SN. M: Molaridad, Nº de moles de soluto por cada 1 litro o 1000 cm 3 de SN. m: Molalidad, Nº de moles de soluto por cada 1 Kg de solvente. N: Normalidad, Nº de equivalentes de un ácido o de una base por cada 1 litro de SN. De acuerdo a lo que vimos antes: Una solución 2 M de HCl es lo mismo que una solución 2 N, mientras que una solución 4 M de ácido sulfúrico será lo mismo que una solución 8 N para este ácido. PRECAUCIONES PARA EL USO DE LAS MICROPIPETAS 1) Las micropipetas tienen en la parte superior del émbolo su identificación: P20, P200, P1000, etc. La pipeta P20 sólo puede ser utilizada para medir volúmenes comprendidos entre 1 y 20 ul. La pipeta P200 para los volúmenes comprendidos entre 20 y 200 ul. La pipeta P1000 para volúmenes entre 200 y 1000 ul. 2) Para ajustar el volumen que se desea utilizar, debe girarse la rueda que se encuentra detrás del visor que indica el volumen. La rueda debe ser girada suavemente, NUNCA FORZARLA. NUNCA EXCEDER LOS VALORES ESTABLECIDOS EN EL PUNTO 1, YA QUE SE DESCALIBRA O SE ROMPE. El valor de estas pipetas es aproximadamente u$s 250 Dependiendo la marca y el modelo, los volúmenes se indican de distinta manera, pero en general: a. Para la pipeta P20 los dos superiores indican la decena y la unidad (en microlitros µl ), el tercer número (que está en otro color) indica la primer cifra después de la coma. b. Para la P200 los tres números indican centena, decena y unidad (en µl) respectivamente. c. Para la P1000 que solo tienen tres cifras en el visor, el primer número (en otro color) corresponde a la unidad de mil µl, los otros dos la centena y la decena. Otros modelos tiene los cuatro dígitos correspondientes al millar, centena, decena y unidad. -2-

3 Desarrollo Se partirá de una solución stock de colorante azul de toluidina de concentración conocida (0,16 p/v PM=305,83) Importante: Repasar las diferentes formas de expresar la concentración de una solución y cómo interconvertirlas (molaridad, normalidad, % p/v, % p/p y la ley de Lambert-Beer). Construcción de la curva de calibración Cada grupo recibirá 1 ml de solución stock y realizará por triplicado diluciones seriadas al medio hasta la desaparición del color de la solución (aproximadamente 9 diluciones) Dilución incógnita: Cada grupo recibirá 1 ml de una solución de concentración desconocida. Deberá averiguar la concentración de la misma, por extrapolación en la curva realizada con las diluciones seriadas a partir de la solución stock (preparada en el punto anterior) Para esto deberán colocar 100 µl de las diluciones de la curva y de la muestra incógnita en cada pocillo de una placa de 96 wells y leer la absorbancia en un lector de microplaca a 595 nm. Gráfico de la curva de calibración: Con el promedio (para cada punto) de los valores de absorbancia se graficará Absorbancia (Y) vs. concentración en mm (X) en el programa Excel (o similar). Descartarán los puntos que no formen parte de la porción lineal de la curva (por qué?), y se aplicará una regresión lineal. A partir de la ecuación de la recta de regresión se extrapolará el valor de la muestra incógnita. Ejemplo: -3-

4 En las opciones de línea de tendencia se selecciona presentar ecuación y R 2 en el gráfico. El gráfico será algo así: Absorbancia 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Título del gráfico y = 0,2x + 1E-16 R 2 = 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Concentración (mm) La ecuación relaciona Y (absorbancia) con X (la concentración de la solución en cada caso). Con esta ecuación puede obtenerse el valor de concentración de la muestra incógnita que es directamente proporcional a su absorbancia. El valor de R 2 da una idea de qué tan bien se ajusta la recta de regresión a los puntos graficados. Cuanto9 mayor sea este valor (más cercano a 1) más alineados están los puntos. -4-

5 Problemas de Diluciones 1) Cuantos µl representan los siguientes volúmenes? a) 0,05 l b) 0,234 ml c) 2,5 x10 4 ml d) 98,5000 l 2) Exprese cada uno de los siguientes valores de concentración en µg/ml, ng/ml, ng/ul, ug/ul: a) 234,20 mg/ml b) 48,56 mg/l c) 6,243 x10 6 g/ml d) 8,2 x10-8 pg/ml 3) Si se toman 50 ml de una solución NaCl 0,4M y se llevan a un volumen final de 1l Cuál es la concentración final? 4) Qué volumen de HCl 6M debe usarse para preparar 500 ml de una solución de HCl 5 mm? 5) Cuál sería la concentración final de una solución preparada al diluir 45,0 ml de KOH 4,2 M en un volumen final de 300 ml? 6) Si se cuenta con una solución 2,2 M de NaCl, Cuántas diluciones seriadas 1/10 deben realizarse para llegar a una solución de concentración 22 µm? Indique que volúmenes utilizaría si las diluciones se realizan en tubos eppendorfs con Vfinal=1,5ml. 7) Su jefe le entrega 10 ml de un cultivo de E. coli (bacterias) con 8.4 x 10 7 células/ml y le pide que prepare una 100 ml de una suspensión que contenga APROXIMADAMENTE 100 células/ml (84 células es aproximadamente 100!), Qué diluciones seriadas puede realizar para llegar al resultado? (hay más de una opción correcta!) 8) Usted posee un tubo con 1 ml de una solución 4.3 x 10 4 células y debe producir una solución que contenga aproximadamente 50 cel/ml. Qué diluciones seriadas haría si en los tubos sólo puede llegar a un Vfinal=1ml y tuviese que pasar de cada solución a la siguiente no menos de 5 µl? 9) Usted posee una sustancia coloreada y desea realizar una curva de calibración con al menos 4 puntos para el rango de concentraciones 0,1 mm a 0,2 M. Si ud. posee una solución 2,5 M y sabe que la e490 = 50 M -1 cm -1 a) Indique qué diluciones seriadas haría para obtener esos puntos. b) Cuál será la Absorbancia a 490nm de cada uno de los puntos que ud. eligió? 10) Las ß-lactamasas son una familia de proteínas generadas por algunos microorganismos, que les confieren resistencia a los antibióticos ß-lactámicos. Una de ellas en particular tiene un peso molecular (MW) de g/mol y e280=24750 M- -5-

6 1cm-1. Al medir absorbancia en una cubeta estándar (1 cm de camino óptico) a 280nm se obtiene un valor de 0,500. a) Calcule la concentración en µg/ml de la solución de proteínas. Ayuda: Para resolver este problema deben recordarse los conceptos de ecuación de la ecuación de Lambert-Beer y que la longitud de onda a la que se miden las proteínas es 280 nm b) Si cuenta con 1 ml de esta solución, Cómo prepararía 500 µl de una solución 400 µg/ml? c) Qué valor de absorbancia presentará dicha solución? 11) Partiendo de una solución stock de PBS (buffer fosfato salino) 10X, a) Cómo prepararía 50 ml de una solución de buffer 5X? b) y 120 ml de buffer 2X? 12) Ud debe preparar 20 µl de una muestra de ADN que contiene: Sybr Green 1X, loading buffer 1X, 1 µl de su muestra de ADN, y H 2 O para completar el volumen. a) Cuántos µl de cada componente debe agregar si el Syber green se encuentra 10X y el loading buffer se encuentra 5X? b) Qué concentración final tiene la muestra de ADN que acaba de preparar, si el stock inicial estaba 1 µg/µl -6-

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