Que es la microbiología industrial?

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1 Que es la microbiología industrial? La microbiología industrial es la microbiología que estudia la aplicación de la biotecnología de los microorganismos en la industria. Esto implica la utilización de sistemas biológicos en diferentes procesos industriales. En general puede abarcar diferentes ámbitos: - Fabricación de diferentes compuestos orgánicos. - Transformación de productos, hecho que cada día tiene más importancia, puesto que las reacciones mediadas por los seres vivos ocurren en condiciones de presión, temperatura,... normales. Por lo tanto puede ser más barato el uso de seres vivos, ya que no se requieren condiciones especiales. Además, en muchos casos serán reacciones más eficaces que las químicas. Se ha de tener en cuenta siempre que la industria buscará la mayor eficiencia posible y la reducción de costes, ya que lo que interesa es tener beneficios. - Reacciones con compuestos inorgánicos, como puede ser el caso de la lixiviación de metales. - Producción de biomasa, con diferentes finalidades. A menudo el producto final de las reacciones son los propios microorganismos, por su valor en alimentación humana, como Saccharomyces,... o animal, como las SCP. - Degradación de sustancias, como puede ser la depuración de aguas, el tratamiento de residuos,... - Biosensores, determinación de la presencia de sustancias, mediante sistemas biológicos. También puede servir en los controles de calidad. Está adquiriendo una gran importancia en los últimos años, ya que es una muy importante herramienta de análisis. Microbiología Industrial Microbiología Alimentaria Considera la parte positiva de los microorganismos, sus posibles aplicaciones. La microbiología industrial va encaminada a 3 grandes áreas: - Servicios, como eliminación de residuos - Producción de sustancias de interés económico - Análisis, en el desarrollo de biosensores La microbiología industrial se centra en los posibles beneficios que se pueden obtener del uso de microorganismos en procesos industriales. Considera la parte negativa de los microorganismos. La microbiología alimentaria aborda principalmente 2 problemas. - Los alimentos no pueden causar enfermedades al ser ingeridos. Es básica en un alimento su inocuidad, que no provoquen perjuicios al ser humano, por la presencia de organismos patógenos en ellos. - Los alimentos han de poder conservarse durante un cierto tiempo, no se pueden estropear por la acción de organismos en ellos, o como mínimo retrasar la degradación. La microbiología alimentaria se preocupa por la alteración de los alimentos por la acción de los microorganismos desde el punto de vista sanitario y organoléptico. Biotecnología Ambos tipos de microbiología abarcan diferentes aplicaciones de la biotecnología. La idea de la biotecnología surge en los años 20, ligada a la producción de alimentos. Tuvo su auge en los años 50, centrada en la producción de plásticos e hidrocarburos. La biotecnología será por lo tanto el uso integrado de la bioquímica, la biología y la ingeniería química para conseguir aplicaciones tecnológicas de los sistemas biológicos y los cultivos celulares. Una nueva definición de biotecnología actualmente dice que la biotecnología es el conjunto de procesos industriales donde se utilizan organismos obtenidos mediante DNA recombinante y otras técnicas genéticas. 1

2 Existen diferentes definiciones de biotecnología: Biotecnología Manipulación de organismos vivos, sobre todo a escala genética, para obtener productos útiles. Según esta definición, parece que la microbiología industrial no sería biotecnología. Combinación de procesos industriales donde se usan sistemas biológicos obtenidos mediante DNA recombinante u otras técnicas de manipulación genética. Se aproxima más a la microbiología industrial, pero no es adecuada aun. Uso integrado de la bioquímica, microbiología y de la ingeniería química con el fin de obtener productos útiles y aplicaciones tecnológicas de los microorganismos, cultivos celulares y otros sistemas biológicos. Esta es la definición más adecuada a los contenidos de la microbiología industrial y alimentaria. De hecho distinguimos 2 clases de biotecnología. Biotecnología tradicional o clásica (Industrial) Es la rama de la biotecnología que obtiene producción a gran escala, con costes reducidos. Sus principales productos son alimentos o ingredientes saborizantes, alcohol industrial, antibióticos y ácido cítrico. Se trata de producción en toneladas y se valora en aproximadamente $ anuales Nueva biotecnología o biotecnología fina Se concentra en la fabricación de productos al detalle. Producción de tan solo kilogramos al año, pero son productos de un gran valor añadido, como pueden ser insulina, interferón, enzimas,... Se requiere el uso de técnicas más nuevas de ingeniería genética y de la fusión de células para obtener organismos capaces de generar los productos deseados. Hacia 1989 la biotecnología fina generaba aproximadamente 10 9 $ al año, pero cada vez representa una mayor fracción de la industria total. Esta división no quiere decir que la biotecnología clásica no utilice las más modernas técnicas de ingeniería genética, ya que si son necesarias, se usan. Ni tampoco quiere decir que en la biotecnología fina no se usen los conocimientos adquiridos tras tantos años de trabajo en la biotecnología tradicional. En realidad, el ser humano aprovecha las reacciones mediadas por los microorganismos desde hace siglos: Año Producto, proceso o descubrimiento ac Bebidas alcohólicas por fermentación de diferentes zumos de frutas en pueblos primitivos 6000 ac Cerveza y pan en Mesopotamia, Egipto y China Cultivo de viña en el sur del Cáucaso 3000 ac Leches fermentadas y quesos en oriente medio Tecnologías de vinos y cervezas en Egipto y Sumeria Vinagre a partir de zumos fermentados 2600 ac Tecnología del vino fermentado en Egipto 1800 ac Vino: Noé, babilonio Upnapishtim 1100 ac Cerveza en el Segrià 79 dc Quesos azules 1070 Queso Roquefort 1133 Cerveza con lúpulo: Santa Hildegarda 1150 Espíritu del vino Arnau de Vilanova: alcohol 1300 Vinagre industrial en Orleáns 1650 Cultivo de champiñones en Francia 2

3 1680 Leeuwenhoek: visión de células de levaduras 1700 Primeras cervecerías industriales S. XIX Nacimiento de la microbiología con Pasteur S. XX ª Guerra Mundial. Los alemanes ponen a punto la tecnología necesaria para la fermentaciones a escala industrial, para la producción de disolventes orgánicos ª Guerra Mundial. Fleming descubre la penicilina. Se hacen importantes descubrimientos en ingeniería, como técnicas de esterilización y se perfeccionan las técnicas de mejora de cepas El producto estrella de la biotecnología son los antibióticos. También se desarrolla la transformación de los esteroides y se perfeccionan los cultivos de células animales para el desarrollo de vacunas víricas En Japón se desarrolla la tecnología para la producción de aminoácidos y 5 nucleósidos, estimulantes del sabor. Se perfecciona la producción de enzimas, así como las técnicas de inmovilización de células y enzimas. Se mejoran las fermentaciones en continuo, para la producción de SCP Aparición de la tecnología del DNA recombinante. Producción de insulina humana en E. coli. Aplicaciones de los microorganismos en la industria Producción de metabolitos primarios y de productos relacionados Bebidas alcohólicas Vinos Saccharomyces Cervezas Etanol Etanol industrial Ácido láctico Lactobacillus Productos lácticos Leches fermentadas Bacterias lácticas Quesos Embutidos Vegetales fermentados: col ácida,... Ácido acético Vinagre Acetobacter Ácido cítrico Aspergillus Ácido propiónico Quesos Emmental Propionibacterium Alimentos orientales fermentados Salsa de soja, miso, kimchi, sutu, Floriduras y bacterias tempeh,... lácticas Aminoácidos L Glutámico Corynebacterium L Lisina Producción de metabolitos secundarios Antibióticos β lactámicos Tetraciclinas Peptídicos Aminoglicósidos Penicilium Streptomyces Bacillus Streptomyces Alcaloides Ergotamina Claviceps Pigmentos Astaxantina Phaffia Producción de otros componentes biológicos Polisacáridos Dextrano Xantano Leuconostoc Xanthomonas Bioplásticos Polihidroxialcanatos Alcaligenes Vitaminas B 12 Riboflavina Pseudomonas Ashbya Transformación de esteroides Floriduras Streptomyces 3

4 Aplicaciones ambientales Depuración de aguas residuales Fangos activos Bacterias aerobias Protozoos Depuración de materia orgánica semisólida Biodigestión anaerobia Bacterias anaeróbicas Arqueas Metanógenes Biodegradación de xenobióticos Biodegradación de hidrocarburos Pseudomonas Aplicaciones analíticas Biosensores Análisis de glucosa Aspergillus Bioensayos Tests de Toxicidad ambiental Photobacterium Tests mutagénicos Test de Ames Salmonela Producción de biomasa microbiana Microorganismos unicelulares Levadura de panificación Saccharomyces Proteína unicelular bacteriana Methylophilus Proteína unicelular de levaduras Candida Microalgas Chlorella Scenedesmus Spirulina Esporas bacteriana Bioinsecticidas Bacillus Biomasa fúngica Proteína unicelular fúngica Paecilomyces Cultivo de setas Morchella Producción de enzimas y otras proteínas Enzimas Amilasas Aspergillus Proteasas Bacillus Hormonas Insulina humana Escherichia Otras proteínas Interferón humano Escherichia Sistemas biológicos usados en la microbiología industrial Un biocatalizador es un agente biológico que se utiliza en la obtención de un producto o servicio de interés biotecnológico. En la microbiología industrial se usan diferentes tipos de agentes biológicos. Microorganismos: Son los sistemas biológicos más usados en la microbiológica industrial. Se trata de bacterias, hongos, protozoos y virus. Esporas: En ocasiones el sistema biológico de interés para producir el producto o el servicio son las esporas, como en el caso de los bioinsecticidas. Obtendremos las esporas a partir de cultivos celulares. Enzimas y otras proteínas. Cultivos celulares. Podemos usar cultivos celulares vegetales o animales para la fabricación de productos o la obtención de servicios, como por ejemplo el uso de hibridomas para la obtención de anticuerpos monoclonales. En ocasiones se pueden usar solo algunos orgánulos. Los microorganismos presentan una serie de ventajas sobre los otros posibles sistemas biológicos. - Tienen una elevada diversidad metabólica y una gran plasticidad. Siempre existirá algún microorganismo que pueda hacer la reacción que se desea en un determinado momento. El único problema es que se ha de encontrar el microorganismo más adecuado. Se cree que se conocen tan solo 1 / 3 de los microorganismos existentes en el mundo. - Son extremadamente fáciles y baratos de cultivar. o Crecen sobre sustratos baratos. En ocasiones pueden crecer sobre residuos de otras empresas, como papeleras, cárnicas,... 4

5 o Las condiciones de cultivo son baratas de obtener y mantener, en comparación con las que se necesitaría para las transformaciones químicas. No es necesario normalmente incrementar la temperatura ni la presión. En muchos casos son los propios organismos los que provocarán un cambio de la temperatura. En ocasiones será incluso necesario refrigerar. Productos y servicios que puede ofrecer la microbiología industrial 1. Producción de células, como por ejemplo levaduras o algas con diferentes finalidades. La levadura será necesaria para la producción de pan. Las células se usan generalmente para la alimentación, tanto humana, como en el caso de hongos o algas, como animales, como es el caso de la SCP, para formar parte del pienso, o para ser directamente el pienso. Otras veces se producirán células, pero sólo se aprovechará una parte, como puede ser el caso de las esporas para los bioinsecticidas. 2. Enzimas y otras proteínas de elevado valor añadido. Existen muchos enzimas que pueden entrañar interés para su producción industrial, y con diferentes usos posibles. Incluso otros tipos de proteínas pueden ser útiles, como la insulina, el interferón, Metabolitos primarios y secundarios. Tanto un tipo como el otro pueden tener interés aplicado. Los metabolitos primarios son componentes relacionados con la síntesis de células microbianas, con su crecimiento. Aumentan en paralelo al crecimiento celular, o incluso de manera solapada. Son por ejemplo los productos finales de las fermentaciones como el etanol o los ácidos orgánicos. Los metabolitos secundarios suelen acumularse en la fase que sigue a la fase de crecimiento activo, la trofofase, que es la que se denomina idiofase. Las sustancias que se producen en la idiofase no tienen relación directa con la síntesis de materiales celulares, ni con el crecimiento. Son sustancias que no son básicas para el crecimiento. La trofofase y la idiofase no son fases del crecimiento bacteriano, sino que son solo fases de la producción de metabolitos, pueden coincidir con las fases de crecimiento, pero no son lo mismo. 4. Otros productos. Los anteriores son los productos de mayor importancia, pero existen otros productos, como: - polisacáridos, que tienen muchos usos, como por ejemplo aditivos alimentarios. - Bioplásticos - Ciertas vitaminas - Transformación de microorganismos. Se obtienen un producto, pero el microorganismo no lo ha sintetizado todo, sino que tan solo ha realizado un par de reacciones sobre él. Es el caso de los esteroides, ácidos grasos,... Pueden tener un gran valor añadido. 5. Depuración de residuos. Los ecosistemas tienen inercia y plasticidad. Cuando sufren alteraciones tienden a recuperarse. La actividad humana altera los ecosistemas, mediante la industria, por ejemplo. La industria que se instala al lado de un río y usa el agua de este como refrigerante está produciendo en el río una contaminación física, ya que está alterando un factor básico, como es la temperatura del río. El río continuará fluyendo y pasados unos kilómetros, habrá vuelto a la temperatura que tenía antes de pasar por la fábrica, ha conseguido restaurar el factor temperatura. Los ecosistemas tienen capacidades de regeneración y recuperación, pero la actividad humana actualmente ha superado con creces esta capacidad, por lo que los ecosistemas estarán permanentemente contaminados. Todo esto ha llevado al desarrollo de tecnologías de depuración, que tratan de reducir el impacto de la actividad humana sobre los ecosistemas. Estas nuevas técnicas se basan en la mimetización de los procesos que tienen lugar en el río, pero aumentando la concentración o la intensidad, como en el caso de las plantas de lodos activos. - Aguas residuales. En los países desarrollados hay una elevada producción de aguas residuales, ya sean de origen doméstico o industrial. Un elevado porcentaje de esta agua será tratado biológicamente. El objetivo de estos procesos es la eliminación de la materia orgánica del agua, que no eliminarla directamente. Actualmente las aguas residuales se tratan siguiendo una serie de procesos aeróbicos clásicos, como son: o Lodos activos o Lechos bacterianos o Lagunas facultativas o Reactores de células inmovilizadas 5

6 Estos procesos hacen que la materia orgánica en suspensión en el agua se elimine por procesos de sedimentación. Esto genera lodos, lo que implica que las plantas de depuración de aguas eliminan residuos líquidos, pero los producen sólidos, que deberán ser tratados como otros residuos sólidos. - Residuos sólidos. Son otro gran problema de los países desarrollados. Estos residuos pueden ir desde la simple basura del hogar, hasta los lodos resultantes de la depuración de aguas, pasando por residuos agrícolas e industriales. Los residuos sólidos se someten normalmente a procesos de digestión anaerobia. Este tipo de digestión reduce el volumen de los residuos. En condiciones de anaerobiosis, una buena parte del sustrato a partir del cual crecen las bacterias deberá ser dedicado a la obtención de energía, de manera que el crecimiento de bacterias a partir del sustrato es bajo. Los residuos orgánicos pasan a ser casi totalmente CH 4 y CO 2, lo que se conoce como biogas. El metano producido puede ser un combustible, por lo que puede ser usado como fuente de energía, pero puesto que el principal objetivo es la reducción del volumen de residuos y su estabilización, la producción de metano no está optimizada, aunque se debe aprovechar el que se produzca. - Xenobióticos. Además de los residuos cotidianos, eventualmente se producen vertidos puntuales de xenobióticos. Se trata de productos producidos químicamente por el hombre, no producidos por ningún ser vivo, y que no pueden ser degradados por ningún ser vivo. También pueden darse vertidos de sustancias recalcitrantes, que son de difícil y lenta degradación. Se han descubierto una serie de organismos capaces de degradarlos, que son inoculados cuando se produce un vertido. El problema de los xenobióticos se está haciendo desgraciadamente cada día más común. Un problema que se encuentra también es que para recalificar el suelo industrial a urbanizable, mucho más rentable, este debe estar limpio de productos xenobióticos. 6. Aplicaciones analíticas. Existe la posibilidad de usar microorganismos como biosensores. Se pueden usar tanto los microorganismos vivos, como sus enzimas u orgánulos unidos a electrodos de manera que las reacciones biológicas devengan corrientes eléctricas. Esto permite medir concentraciones de compuestos específicos en diferentes entornos, detectando contaminantes, aditivos en alimentos,... Los biosensores han despertado un gran interés, pero aún se están poniendo a punto. Otro uso analítico de los microorganismos son los bioensayos, que consisten en la determinación de una sustancia biológicamente activa, ya sea conocida o no, sobre material vivo. No todos los bioensayos implican el uso de microorganismos. Antes de producir una sustancia a escala industrial, deberemos realizar con ella una serie de bioensayos, que mida una serie de factores de dicha sustancia. - Biodegradabilidad. Toda sustancia que sea producida a gran escala industrialmente, en cantidades de toneladas, ha de ser biodegradable, porque si no lo fuese se acumularía muy rápidamente en los ecosistemas. Se han de hacer una serie de ensayos en el laboratorio que demuestren dicha biodegradabilidad. En términos legales, cuando hablamos de biodegradable, en realidad nos referimos a que el 70% del producto es biodegradable, pasando a ser tan solo agua y dióxido de carbono. El 30% restante no se degradará y su composición permanecerá desconocida. Esto es lo que estipula la ley. - No toxicidad al medio. Las sustancias que van al medio no han de alterar la salud del ecosistema. Existen dos tipos diferentes de ensayos de toxicidad. o Agudos: Se expone al ser vivo al producto en cuestión a una concentración muy elevada, durante un período breve de tiempo de su vida, por ejemplo, si calculamos una vida de 40 años, el período breve serían 5 minutos o Crónicos: Se expone al individuo a concentraciones bajas del producto durante un largo período de su vida, pudiendo incluso llegar a tratar a sus descendientes para ver el efecto en estos. Se han de hacer pruebas para evaluar el efecto de un producto sobre el ecosistema. En teoría debería haber una serie de tests que permitiesen evaluar la toxicidad sobre todos los niveles del ecosistema, hasta llegar al hombre. Pero no sale rentable, por lo que se realizan muchos 6

7 tests sobre bacterias, de manera que si es tóxico para la bacteria no se comercializará. Pero pese a no ser tóxico para la bacteria podría ser tóxico para otros organismos. - Mutagenicidad. Es un factor que se ha de tener muy en cuenta. El problema que presenta la mutagenicidad es que los efectos se pueden producir muy adelante, incluso en la descendencia, por lo que los ensayos que comprueban esto son muy largos y complejos. El test más empleado actualmente es el que se conoce como test de Ames. Ames obtuvo mutantes His - de S. typhimurium. Este mutante tiene una tasa de reversión elevada de aproximadamente 10-4, que Ames tenía muy bien medida. Esta bacteria se ponía en contacto con la sustancia a comprobar. Si aumentaba la tasa de reversión, se trataba de un producto mutagénico, en caso de no aumentar era no mutagénico. El problema radica en que muchas sustancias son premutágenos, que en su forma inicial no son mutagénicas, pero que al llegar al hígado se activan y pasan a ser mutágenos. Para comprobar que la sustancia no es un premutágeno se le administraba a una rata. Después se sacrificaba, se extraía el hígado y se sometía a éste a una centrifugación diferencial. Aíslas entonces las fracción microsomal, que contendrá premutágenos activados y la compruebas con S. typhimurium. 7. Lixiviación. Podemos usar los microorganismos para la recuperación de metales a partir de minerales y restos de minas, con contenidos de metales demasiado bajos para la fundición, el método tradicional. La biolixiviación la realiza Thiobacillus ferrooxidans. Breve historia de la biotecnología Podemos dividir la historia de la humanidad en tres períodos, considerando la manera de conseguir los alimentos. En una primera etapa de cazadores recolectores, el hombre debía perseguir y buscar los alimentos. En una segunda etapa de agricultores ganaderos, el hombre cultiva los alimentos, lo que implica un aumento de la población, así como de la esperanza de vida, pero a la vez genera un problema, puesto que habrá épocas del año en las que no se podrá recolectar alimento, por lo que el que se recoja en tiempos de disponibilidad deberá durar todo el año. Se empezaron a desarrollar métodos de conservación rudimentarios. Además, debido a la acción microbiológica, se desarrollaron otras técnicas de conservación, como pueden ser el queso, el yogurt, los embutidos,... En lo que respecta al vino y a la cerveza, se ha de tener en cuenta que hasta hace poco eran la forma más sana de beber agua, ya que había una gran posibilidad de que estuviese contaminada. Actualmente estamos en una tercera etapa, en la que somos ya gourmets, ya que en la alimentación humana el problema no lo representa ya la disponibilidad de alimentos, sino que actualmente los alimentos han de ser saludables y sabrosos. Indicadores de desarrollo y calidad de vida Típicamente, un indicador del desarrollo de un país y de su calidad de vida suele ser la renta per cápita, el PIB,... pero la producción de basuras por habitante y día puede ser un indicador tan bueno como cualquier otro. Una producción de basura superior a 1Kg al día indica una buena situación económica, mientras que valores inferiores indican una situación económica peor. Otro valor que puede ser de interés es el consumo de agua diario. Un ser humano necesita estrictamente 1,5 l de agua al día, que es la que ha de beber, pero en la práctica, el consumo de agua por individuo al día es muy superior, sobre todo en países desarrollados. En países en vías de desarrollo el consumo diario oscila entre los 20 y los 40 litros diarios por persona. En países más desarrollados se alcanzan valores más elevados. En Barcelona se oscila entre los litros al día por habitante, pero considerando la totalidad de España se alcanzarán valores cercanos a los 300, ya que se considerarán también todos los campos de cultivo. Los países más desarrollados tienen un consumo diario aproximado de 350 litros por habitante. Cada vez se usa más agua, por lo que nos enfrentamos a un problema, ya que la precipitación anual en Barcelona es de mm. Básicamente se siguen dos técnicas para poder tener el agua necesaria. En primer lugar el agua se reutiliza, y en segundo lugar puede ser necesario traer agua de otras cuencas más ricas. 7

8 Fermentaciones Industriales I En los temas siguientes veremos todas las etapas que componen una fermentación industrial. En la tabla las vemos todas resumidas. Etapa Curso de la fermentación I Preservación del inóculo II Multiplicación del inóculo a. Cultivo en matraces agitados b. Formación de esporas en medio sólido III Cultivo de prefermentación 1 3 cultivos de prefermentación IV Fermentación de producción a. Fermentación discontinua b. Fermentación continua Conservación del inóculo El problema de trabajar con microorganismos es su bajo tiempo de vida, ya que para poder trabajar con ellos son necesarias sucesivas generaciones del organismo que se mantengan idénticas entre sí. Esto puede presentar una serie de problemas. La conservación de cepas de producción a lo largo de un período largo de tiempo es un requerimiento básico para la fermentación industrial. El objetivo no será solo la supervivencia del organismo, sino que este mantenga sus capacidades de producción después de la conservación. El objetivo de la conservación es mantener las cepas sin cambios celulares tanto tiempo como sea posible. Ha de encontrarse el método más adecuado para cada cepa. 1. Subcultivos. Es el método más fácil. Los microorganismos se mantienen como cultivo por picadura en agar o en cultivo líquido en nevera, pero presenta dos incovenientes: - Tiene elevados costes. - Peligroso: Existe un elevado riesgo de contaminación y de mutación, ya que se producirá una mutación cada 8 16 semanas, o alguna al año. Incluso pueden morir todas las células al haber tardado en hacer un nuevo subcultivo. En estos casos los cultivos se mantienen a bajas temperaturas, entre 2º y 6º C, para que las sucesivas resiembras estén espaciadas en el tiempo, hasta semanas, pero se han de hacer en un momento u otro. Una variante de este método es el uso de medios pobres, ya sean medios mínimos o tan solo agua y agar. Al tener a los microorganismos en medios tan pobres, el crecimiento se verá ralentizado mucho, pudiendo llegar a alargar el tiempo entre las siembras a meses, entre 3 y 5, pero los riesgos son los mismos que se han dicho. 2. Esporulación. Solo se puede usar en microorganismos esporulantes. En estos organismos habrá suficiente con inducir la esporulación Las esporas se almacenan entonces en un medio mineral, estéril y seco, para que no germinen. Esto permite mantener los microorganismos viables durante mucho más tiempo, incluso décadas. Los esporuladores son los únicos organismos que no dan problemas de conservación. 3. Almacenamiento por congelación. Un descenso de la temperatura de 10º C supone un descenso de la velocidad metabólica del 50%. A temperaturas de ultracongelación el metabolismo estará totalmente frenado, incluso la actividad química. Existen diferentes temperaturas de congelación. - Suave: -18º C, congelador doméstico - Fuerte: -80º C, congelador de 2 compresores - Ultracongelación: -196º C, congelación en N líquido. 8

9 La congelación en nitrógeno líquido permite conservar incluso microorganismos delicados más de 15 años. Se ha de tener en cuenta, antes de usar este medio, que es caro, ya que se necesita electricidad para mantenerlo y que el nitrógeno líquido se va perdiendo, por lo que se deberá ir renovando. En N liquido el organismo no se alterará, pero se ha de considerar si no existe un medio más económico de conservación, acorde con el valor del cultivo. La congelación ha de ser rápida pero gradual, para lo que se han de tener en cuenta las siguientes consideraciones. a. Los microorganismos deben estar en un medio rico y líquido, donde crecerán en la fase exponencial hasta llegar a su N max, justo antes de llegar a la fase estacionaria. b. La concentración de microorganismos ha de ser elevada, para lo que se eliminará el medio por filtración y se repartirá el cultivo en viales. c. Adición del crioprotector que evitará la formación de cristales en el interior de la célula, que puede ser glicerol o DMSO, ya que son los más usados. La concentración de estos crioprotectores ha de estar entre el 5 y el 20%, ya que concentraciones más elevadas darían problemas de toxicidad al descongelar. d. Se congela lo más rápidamente posible. e. Al cabo de días, una vez se haya estabilizado la congelación, se deberán coger 4 o 5 viales al azar, que se cultivarán. Esto es el control de calidad o control de viables y es básico, ya que así podremos conocer el número aproximado de viables que habrá en cada vial, ya que al congelar se habrá reducido este número. El número de viables no ha de ser menor del 70 80% del número de viables original. Si se recuperan menos, significará que algo no habrá ido bien. f. Si el control de viables da los resultados deseados, se reparten los viales restantes en 2 congeladores, por seguridad. 4. Liofilización. Es el mejor método de conservación existente. Conserva tan bien como la congelación, pero presenta la ventaja de que no es necesaria la conservación a bajas temperaturas, con lo que resulta más barato y seguro. En la liofilización o desecación por congelación trabajamos sobre el punto triple del agua, para pasar del estado sólido al gaseoso sin pasar por el líquido, en un proceso de sublimación. En primer lugar se congela y después se pasa al vacío provocando la sublimación del agua. El protocolo de liofilización es básicamente idéntico al de congelación, hasta el apartado c, aunque en la liofilización no se usan ni glicerol ni DMSO como crioprotectores, debido a su toxicidad, ya que al eliminar el agua su concentración sería tóxica para el microorganismo. En lugar de estos crioprotectores se usan azúcares o leche. Entonces congelamos las muestras, nunca a temperaturas superiores a 50º C, y si son inferiores mejor. Eliminamos entonces el agua congelada al crear el vacío en la muestra. Para mantener la muestra liofilizada es básico impedir que se pueda rehidratar, ya que sin agua no hay metabolismo. Una vez se ha deshidratado se ha de sellar herméticamente la botella. La temperatura óptima de almacenamiento está entre 0º y 18º C, pero nunca menor, ya que no se ha de congelar, y siempre en oscuridad. Una vez liofilizado se ha de hacer un control de calidad, como en el caso de la congelación. La liofilización es el método que se emplea en la conservación de las grandes colecciones tipo, porque cuando se puede hacer, hay algunos organismos que no la toleran, es el método óptimo. Permite mantener la viabilidad a largo plazo, con costes reducidos, y menos trabajo que la congelación en N líquido, el segundo método con mayor viabilidad a largo plazo. 9

10 Medios de cultivo Los medios de cultivo usados para hacer crecer los microorganismos han de tener todos los elementos necesarios en la forma y las proporciones adecuadas para la síntesis de material celular y la producción de metabolitos. En un laboratorio se pueden usar productos químicos, de composición conocida, para la obtención de medios de cultivo, que son medios sintéticos, pero en las fermentaciones industriales los medios han de ser lo más baratos posibles. En microbiología industrial raramente se usan medios óptimos, equilibrados o definidos, sino que en muchos casos los medios usados están formados a partir de subproductos de otras industrias. Serán medios muy variados en su composición, nunca óptimos ni equilibrados, ni mucho menos definidos. Esto presenta una serie de consecuencias sobre el desarrollo de los organismos y sobre el control de la fermentación. I. Un medio de cultivo óptimo y más o menos equilibrado es obligatorio para conseguir la máxima producción. Es necesario por lo tanto optimizar los medios industriales, lo que no es tarea fácil, teniendo en cuenta los ingredientes de los que se parte, muy complejos y variables. Los medios de cultivo industriales pueden optimizarse usando métodos estadísticos, mediante programas diseñados con ordenador. En caso de ser necesario pueden añadirse suplementos de elementos críticos ausentes o insuficientes en el medio. II. III. Control de calidad. Los medios se diseñan para conseguir la máxima producción. En todos los casos, los nuevos sustratos han de ser evaluados precisamente antes de iniciar la producción industrial, mediante fermentaciones prueba. Represión por el catabolito. Consiste en la represión de la síntesis de determinadas proteínas como consecuencia de la presencia de una determinada fuente de carbono y energía, como puede ser la glucosa. La existencia de una fuente de carbono y energía óptima en el medio puede provocar que algunas proteínas no se expresen, lo que puede reducir la eficacia de ciertas reacciones de interés industrial, o incluso impedirlas. La represión por el catabolito o por el producto puede eliminarse optimizando los nutrientes en el medio, de manera que no haya glucosa, por ejemplo, o por gestión adecuada del fermentador, de manera que se añada la glucosa poco a poco al medio. Si no funcionase esta aproximación, deberían usarse cepas mutantes desreguladas para la producción. Sustratos usados como fuente de Carbono y de Nitrógeno Los carbohidratos son las fuentes de energía por excelencia en la industria de la fermentación. Por razones económicas, la glucosa o la sacarosa son usadas muy raramente como única fuente de C, excepto en procesos que requieran un control muy preciso de la fermentación. Los sustratos usados más abundantemente en las fermentaciones son: - Melazas. Subproducto de la industria azucarera, son los restos del refinado del azúcar. Son una de las fuentes más baratas de carbohidratos. Además de una elevada cantidad de azúcares contienen sustancias nitrogenadas, vitaminas y elementos traza. En cualquier caso, su composición varía en función de la materia prima usada para la obtención del azúcar, las condiciones climáticas, la localidad y el proceso usado en la industria azucarera. - Extracto de malta. Es el extracto acuoso de la cebada malteada. Se trata de un sustrato excelente para muchos hongos, levaduras y actinomicetes. El extracto seco de malta contienen entre un 90 y un 92 % de carbohidratos, concretamente hexosas, que son glucosa y fructosa, disacáridos como la maltosa y la sacarosa, e incluso trisacáridos como la maltotriosa. Las sustancias nitrogenadas en el extracto de malta incluyen péptidos, proteínas, aminoácidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. La composición de aminoácidos varía en función del grano usado, pero la prolina siempre constituye más de un 50%. Uno de los problemas que presentan los sustratos ricos en azúcares es lo que se conoce como reacción de Maillard, que se da a bajo ph y elevadas concentraciones de azúcares reductores. Los grupos NH 2 de las aminas, aminoácidos y proteínas reaccionan con los grupos CHO de los azúcares reductores, lo que resulta en la formación de productos de condensación de color tostado, empeorando el aspecto del producto y que no pueden ser usados por los microorganismos, restando así nutrientes. 10

11 - Almidón y dextrinas. Pueden ser metabolizados directamente por los organismos productores de amilasas. El almidón ha adquirido importancia en la producción de etanol. - Líquidos sulfíticos de las papeleras. Se trata de productos residuales que contienen azúcar de la industria del papel. Los líquidos sulfíticos de coníferas contiene entre el 2 y 3 % de azúcares, de los cuales el 80 % son hexosas y el resto pentosas. En el caso de los árboles de hoja caduca, el contenido es principalmente de pentosas. - Celulosa. Debido a su gran disponibilidad y bajo coste, la celulosa está siendo utilizada como sustrato de fermentación. Proviene de la paja, restos de mazorcas, turba, papel,... A menudo no puede ser utilizada directamente como fuente de carbono, por lo que se deberá hidrolizar en primer lugar, ya sea química o enzimáticamente, dando el jarabe de glucosa, que se usa en la producción de etanol, butanol, acetona e isopropanol. Fuentes de Carbono y energía diferentes de los carbohidratos - Aceites vegetales, como aceite de soja, de algodón o de palmera. Son usados como ingredientes secundarios, cuando se usa ya una fuente de carbohidratos como principal aporte de energía. - Etanol. Es el producto de la fermentación del almidón sacarificado o de la celulosa y puede ser usado como única fuente de carbono o como fuente complementaria para muchos organismos. - Alcanos. Alcanos de 12 a 18 C son rápidamente metabolizados por muchos microorganismos. Estos alcanos son residuos del refinado del petróleo y su uso como alternativa a los carbohidratos depende de su precio. En lo que respecta a los sustratos usados como fuentes de nitrógeno, en muchos procesos industriales se usan los siguientes. - NH 4 +, sales, urea o NH 4 + gaseoso. - Líquido de maceración del maíz. Se trata de un subproducto de la producción de almidón a partir del maíz. El extracto concentrado tiene un 4% de N y numerosos aminoácidos, como son: Ala, Arg, Glu, Ile, Tre, Val, Fenil Alanina, Met y Cis. - Extracto de levaduras. Es un sustrato excelente para muchos microorganismos. Se produce a partir de levaduras de panificación, induciendo su autólisis a 50 55º C o por plasmólisis en alta concentración de NaCl. Contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. El glucógeno y la triohalosa se hidrolizan a glucosa durante la producción del extracto. - Peptonas. Se trata de hidrolizados de proteínas, de manera que contendrá aminoácidos y péptidos. Pueden ser usadas por muchos microorganismos, pero son bastante caras para la producción industrial, aunque pese a este su uso está muy extendido. Las peptonas pueden tener dos orígenes. o Proteínas animales. Caseína, gelatina, queratina. o Proteínas vegetales. Semillas de cacahuete, harina de soja, semillas de algodón y girasol. Todo esto aún retiene mucho nitrógeno, aun siendo subproductos de otras industrias. La composición de aminoácidos y de péptidos variará según el origen. Por ejemplo, la gelatina es rica en prolina e hidroxiprolina, pero casi no contiene aminoácidos con azufre. En cambio los péptidos de la queratina tienen una elevada concentración en prolina y cisteína, pero carecen de lisina. La composición del producto final está determinada también por el tipo de hidrólisis a que se someta, que puede ser ácida o enzimática. Especialmente afectado se ve el contenido en triptófano, ya que la hidrólisis ácida reduce su nivel mucho. 11

12 Para poder conocer los componentes que tenemos disponibles para confeccionar nuestro medio, existe lo que se conoce como la bolsa de residuos, que es un órgano público, donde las empresas deben declarar sus residuos. Los objetivos de la bolsa son: - Censar los residuos que se producen, para saber donde se producen exactamente y en qué cantidad los diferentes tipos de residuos. - Solucionar el transporte y la reutilización cuando se pueda. Muchos residuos de los que se producen pueden no tener utilidad para la empresa, pero sí tenerla para otras empresas, lo que pueden implicar el reaprovechamiento. Prospección y mejora En el momento de fabricar un producto o proporcionar un servicio, se ha de encontrar un microorganismo que permita realizar este proceso. A excepción de algunos productos de la industria alimentaria, donde se usan cepas silvestres, en la mayoría de los casos, es necesario buscar microorganismos y después mejorarlos. El protocolo clásico que se ha de seguir para realizar la mejora deseada consta de 3 pasos: prospección, selección y mejora. Características generales Como resulta evidente, el principal factor implicado en el éxito o fracaso de un proceso de fermentación es el microorganismo. Una cepa económicamente rentable deberá cumplir una serie de atributos generales, independientemente del proceso en que esté implicada. 1. Tiene que estar disponible en cultivo puro, libre de otros organismos. 2. Tiene que ser capaz de producir fácilmente células vegetativas y / o esporas u otras unidades de propagación, para aumentar su valor. 3. Tiene que crecer vigorosamente una vez introducida en el fermentador, ya que no todos los organismos crecen adecuadamente en volúmenes grandes, y usar sustratos baratos. 4. Tiene que formar un producto conveniente, preferiblemente uno solo, fácilmente recuperable y, si es posible, en ausencia de productos colaterales tóxicos. 5. Tiene que producir la sustancia deseada en un tiempo corto, a ser posible menor a 3 días. 6. Es mejor si tiene protección contra posibles contaminaciones, ya sea por crecer a ph ácido, o a elevadas temperaturas, Tiene que ser modificable, mejorable mediante agentes mutagénicos, pero ha de ser genéticamente estable en ausencia de éstos. 8. Tiene que ser fácilmente conservable en períodos largos de tiempo. Prospección Los microorganismos pueden aislarse a partir de: - Colecciones tipo o similares. Las colecciones de cultivos actúan como fuentes de cepas de referencia o como lugares de depósito de cultivos. Los cultivos de interés industrial se conservan permanentemente. Los cultivo de investigación acabados de descubrir se guardan hasta descubrir aplicaciones futuras. - De la naturaleza. Si no se encuentra nada en las colecciones tipo, se puede pasar a buscar en la naturaleza. Siempre es necesario buscar con criterio. Para encontrar organismos poco corrientes, es necesario buscar en nichos ecológicos poco corrientes. Las fuentes más comunes de los microorganismos industriales son suelos, lodos, lagos y ríos. La búsqueda de fuentes de microorganismos es tan solo un primer paso del proceso de prospección. Al buscar se encuentran cepas salvajes, de las cuales alguna puede tener interés, mientras que otras no lo tendrán. Una vez se tienen algunas muestras, se han de seleccionar las que tengan interés. Se han de realizar en primer lugar una serie de métodos de enriquecimiento para aislar los microorganismos más infrecuentes y débiles, y potencialmente útiles. Se realiza entonces un proceso de selección primaria, que es únicamente un test cualitativo, para saber si cumple la función deseada. Generalmente se hace en medio sólido. 12

13 Existen una serie de recomendaciones que se han de seguir. Selección - Usar medios selectivos para el tipo de organismo deseado - Usar desde el principio, o lo antes posible, el medio que se usará para la fermentación, de manera que podemos ver si se adapta. - Cultivar en unas determinadas condiciones ambientales - Detección de productos o actividades específicas. La muestra deberá ser plaqueada en medios diseñados específicamente para detectar la actividad deseada. La detección ha de ser rápida, para poder hacer el mayor número de tests posibles en el menor tiempo. Algunos de los tests que se han diseñado son: o Producción de productos antimicrobianos mediante la técnica de la placa superpoblada. o Producción de enzimas extracelulares. o Producción de inhibidores enzimáticos. o Producción de productos específicos detectables porque provocan cambios en el medio. o Producción de metabolitos primarios, como aminoácidos, vitaminas,... por la técnica de la doble capa. Una vez realizada la prospección tendremos cientos de cepas, de las cuales solo mantendremos unas decenas después de la selección primaria. La selección primaria está diseñada para aislar organismos potencialmente interesantes. La selección primara ideal debe cumplir una serie de requisitos. Predictiva Barata Sensible Adaptable a un número elevado de muestras Rápida Específica para las actividades deseadas La selección primaria en placa permite detectar rápidamente microorganismos potencialmente interesantes, pero tiene como limitación el hecho de que se hace en medio sólido, mientras que para el crecimiento usaremos medio líquido. Deberemos hacer por lo tanto una selección secundaria, donde se valorará la producción deseada, a nivel cuantitativo. Generalmente se hace en medio líquido, con las condiciones que habrá en el fermentador, para determinar la cepa que producirá mas, no la que producirá más rápido. También permitirá ver la que crecerá mejor en el fermentador y la facilidad de separación del producto. Diversos métodos de selección primaria de cepas productoras Producto buscado Método en placas de agar con: Detección de colonias productoras por: Antibióticos Microorganismos sensible a Halos de inhibición del crecimiento del antibiótico microorganismo sensible. Proteasas Caseína Halos claros sobre placas turbias. Amilasas Almidón Halos no teñidos al añadir yoduro. Lipasas Emulsión de aceite Precipitación de ácidos grasos libres con Calcio. Fosfatasas Fenolftaleína difosfato e indicador de Cambio de color. color Aminoácidos Microorganismo auxótrofo del Halos de crecimiento del auxótrofo. aminoácido en medio mínimo 13

14 Optimización del producto y del biocatalizador Una vez tenemos el organismo que forma el producto de interés en elevada cantidad, es necesario conseguir que sea capaz de producirlo a nivel industrial. Se ha de incrementar la productividad de la cepa seleccionada, lo que puede conseguirse de dos maneras: - Modificando el medio y las condiciones de cultivo - Modificando el genoma del microorganismo. El aumento de productividad de una cepa se ve limitado por su genoma, por lo que modificamos el genoma. Podemos realizar 3 tipos básicos de manipulaciones genéticas en el organismo. - Mutagénesis al azar - Fusión de protoplastos - Técnica del DNA recombinante Hasta los años 80 90, lo que se hacía principalmente, debido a la falta de conocimientos genéticos adecuados, era la mutagénesis al azar. Esta técnica, al igual que la fusión de protoplastos implica selección posterior, debido al fuerte componente aleatorio. En cambio, las técnicas que implican DNA recombinante son dirigidas, por lo que no requieren selección posterior. Mutagénesis al azar Se trata de mutaciones en el material genético no producidas por recombinación. Son mutaciones que se dan de manera natural pero en una frecuencia muy baja. Se calcula que de manera natural se produciría una mutación de interés industrial cada años. No es nada práctico, por lo que es necesario inducirlas, para que se produzcan más mutaciones en general, de las que podamos extraer las mutaciones prácticas. Distinguimos diferentes tipos de mutaciones. Tipo de mutación Cambios Efectos Mutaciones puntuales Substituciones: Depende del codón: de una sola base Transiciones A G T C Diferente AA Proteína no funcional Transversiones A T G C Stop (mutación non-sense) Proteína incompleta Mismo AA (mutación silenciosa) Proteína normal. Mutaciones de muchas bases Microinserciones ATG GCT GTC... ATG AGC TGT C... Mutación de corrimiento de la pauta de lectura (Frameshift) Microdeleciones ATG GCT GTC... ATG CTG TC... Deleciones Pérdida de muchas Pérdida de función de los genes bases Inserciones Transposones Diversos efectos Inversiones Cambio de sentido de Pérdida de función de los genes un fragmento Translocaciones Cambio de lugar de un Diversos efectos fragmento 14

15 Podremos aumentar la frecuencia de mutaciones mediante el uso de agentes mutágenos, que pueden ser o bien químicos o bien físicos, cuya presencia daña, altera o interfiere en la reparación del DNA. Se pueden emplear diferentes tipos de agentes mutagénicos: Agente mutágeno Forma como actúa Tipo de mutación Radiaciones Ultravioleta Formación de dímeros de pirimidina La reparación puede causar sustituciones o microdeleciones Radiaciones ionizantes (X, γ) Rotura de cadenas del DNA Análogos de bases 5 bromouracilo Incorporado en lugar de T 2 - aminopurina Incorporado en lugar de A Transiciones Agentes alquilantes Monofuncionales: Etilmetanosulfonato Metilación de G Transiciones Bifuncionales: mostazas de nitrógeno, mitomicina, nitrosoguanidina Colorantes intercalantes Acridinas, Bromuro de etidio,... Otros compuestos Ácido nitroso Hidroxilamina Metilaciones, entrecruzamiento de cadenas Inserción entre 2 pares de bases Desamina A y C Reacciona con C Mutaciones puntuales y deleciones Microinserciones y microdeleciones Transiciones Como se ve en la tabla, cada agente mutágeno tiene características y efectos diferentes, por lo que se deberá elegir siempre el que más se ajuste a las necesidades. Después del tratamiento obtendremos 3 tipos de organismos: - Parentales: el tratamiento no les ha afectado, no han sufrido mutación. - Mutantes no viables: organismos a los que la dosis del mutágeno ha causado tantas mutaciones que ya no son viables. - Mutantes viables Los más numerosos suelen ser siempre los no viables, por lo que será necesario ajustar la dosis de mutágeno que se aplica para que quede un porcentaje de viables adecuado. Una vez pasado el tratamiento, se han de hacer crecer las células en medio rico, para incrementar la viabilidad de los mutantes viables, para recuperarlos del tratamiento. Llegados a este punto podemos empezar a aplicar técnicas de enriquecimiento de los mutantes. De todos los mutantes obtenidos se deberá seleccionar el mutante que resulte más ventajoso. 15

16 Se pueden obtener muchos tipos de mutantes: Tipo de mutantes Causa Forma de detección No capsulado Pérdida de la cápsula Colonias pequeñas y rugosas en lugar de grandes y lisas No móvil Pérdida de flagelos Colonias compactas, en lugar de dispersas Despigmentado Pérdida de un enzima en la ruta biosintética Pérdida o cambio de color de las del pigmento colonias Colonias rugosas Pérdida o cambio del lipopolisacárido de la Colonias granulares e irregulares, en pared lugar de lisas Fermentación de Pérdida de un enzima de una ruta metabólica No hay cambio del color del agar azúcares con el azúcar y el indicador de ph Auxótrofo de un Pérdida de un enzima en una ruta No crece en el medio sin el nutriente biosintética de nutrientes correspondiente nutriente Sensible al frío Termosensible Resistente a drogas o análogos Alteración de una proteína esencial, que pasa a ser más sensible a temperaturas más bajas que las óptimas Alteración de una proteína esencial que pasa a ser más termosensible Alteración de la permeabilidad o del enzima diana o detoxificación de la droga No crece a temperaturas frías, a veces no crece ni a 20º C No crece a temperaturas elevadas Crece en presencia de una concentración antes inhibitoria de una droga o análogo Resistente a virus Pérdida del receptor del virus Crece en presencia de una alta concentración del virus De todos estos, los mutantes auxótrofos pueden ser de los más interesantes, mutantes que necesitan la adición de un metabolito al medio, ya que no pueden sintetizarlo. En estos mutantes la vía de síntesis del metabolito se puede ver afectada, lo que puede implicar la acumulación de productos en esa vía. Si deseamos uno de esos productos tenemos una mayor producción. Otra posibilidad es que, debido a que se forma el nutriente, no se forma otra sustancia, que nosotros deseamos. Si cortamos la posibilidad de que se forme el nutriente, la síntesis se desviará hacia el producto deseado. No obstante se ha de tener en cuenta que no todos los auxótrofos para un metabólitos serán de interés, puesto que dependiendo del enzima afectado puede no formarse el producto deseado. La detección de mutantes auxotróficos es sencilla, puesto que las bacterias que crezcan en medio rico, pero no en medio mínimo serán auxotróficas. Hasta aquí bien, pero se ha de tener en cuenta, que una vez tengamos estas bacterias, no sabremos para que nutriente son auxótrofas, por lo que deberemos ir haciendo diferentes pruebas hasta identificar el nutriente en cuestión. Otro punto que se ha de tener en cuenta es que en muchos casos habrá mecanismos de regulación en la bacteria, que no permitirán la acumulación de intermediarios, por lo que lo que nos interesará serán mutantes desregulados, que no tengan regulación, de manera que la acumulación de un producto no interfiera con la síntesis final. El método para aislar mutantes resistentes a análogos consiste en determinar la concentración inhibitoria del análogo, para después plaquear bacterias tratadas con el agente mutágeno, en medios con concentraciones crecientes de inhibidor. De esta manera, las bacterias que crezcan en estas concentraciones mayores, estarán desreguladas. Las causas de la desregulacións pueden ser: - Se produce una mutación en la regulación de un gen, de manera que debido a una menor síntesis, es menos sensible a la incorporación del análogo. - Puede tener una capacidad disminuida de incorporar el análogo Los mutantes resistentes a análogos suelen ser sobreproductores, pero no siempre, porque no están sujetos a regulación por sustrato. Si es auxotrófico puede sobreproducir intermediarios de la vía en lugar del metabolito final. 16

17 Una misma ruta metabólica puede tener regulación de diferente complejidad en diferentes cepas bacterianas, de manera que en el momento de producir una determinada sustancia, trabajaremos con el microorganismo que facilite el trabajo. Al igual que tener el tratamiento mutagénico adecuado, es necesario que tengamos un método preciso para la determinación y aislamiento del mutante. Pero en caso de que no se pueda detectar mediante ninguno de los métodos típicos, de podrán analizar diferentes clones en fermentaciones líquidas para ver cual de ellos sería mejor para la fermentación deseada. Fusión de protoplastos Hasta principios de los años 90, la mutagénesis al azar era el método más empleado, pero a partir de entonces se han introducido nuevos métodos de modificación genética de microorganismos, como el de la fusión de protoplastos, que consiste en una trasferencia génica precedida por la fusión en sí. Requiere también requiere un proceso de selección posterior al tratamiento, ya que la recombinación que se da es al azar. Los protoplastos se generan por el tratamiento de las células con enzimas líticos diversos, que degraden la pared. Será necesaria la presencia de un estabilizador osmótico para evitar la lisis. La fusión es potenciada por la acción del polietilenglicol, PEG, o mediante electrofisión, y la recombinación puede ser potenciada mediante el uso de cepas que tengan mutaciones que favorezcan este proceso. La fusión de protoplastos se usa mucho en la mejora de hongos y levaduras, ya que en muchos casos son organismos asexuales. Otra de las ventajas que presenta la fusión de protoplastos es que se pueden fusionar células de taxones muy alejados, aunque cuanto más alejados, menor la viabilidad del híbrido. Tecnología del DNA recombinante Se conoce como tecnología del DNA recombinante al conjunto de técnicas que permiten la manipulación de los genes como unidades bioquímicas e incluye técnicas como: - Recombinación in vitro - Clonación génica - Manipulación génica - Ingeniería genética Permiten la introducción de secuencias específicas de DNA en organismos procariotas o eucariotas y la posterior replicación y expresión de estas secuencias para llevar a cabo la información codificada en estas secuencias. Seguimos un protocolo, como se ve a continuación: 1. Aislamiento de la secuencia de DNA de interés para su clonación posterior Las endonucleasas de restricción, ER, son enzimas bacterianos que las protegen de la invasión de DNA ajeno. Cortan DNA bicatenario en secuencias específicas, generalmente palindrómicas, de 4 a 11 nucleótidos, generando extremos romos o cohesivos. Cuando no conocemos la secuencia de DNA que queremos clonar, la estrategia consiste en hacer una genoteca, y posteriormente seleccionar con el método adecuado los clones que presenten el carácter deseado. Si conocemos la secuencia de DNA, la podemos usar como una sonda para encontrar el clon que buscamos. 2. Incorporación de la secuencia de DNA aislada en un vector Existe una gran variedad de vectores para la transferencia de DNA. Los más usados son los plásmidos y los fagos, junto con los cósmidos. Los plásmidos son elementos genéticos: o Circulares, por lo que están protegidos contra las endonucleasas. o Pequeños, por lo que pueden ser transferidos fácilmente. o Tienen un origen de replicación, por lo que se pueden replicar en el huésped. o Pueden codificar para numerosas funciones celulares, como resistencias o la capacidad de conjugar con otros organismos. 17

18 Dependiendo de lo que quieras hacer con el DNA aislado, lo insertarás en uno u otro tipo de vector, ya que existen diferentes tipos de vectores, como: o De clonación: son vectores usados para amplificar el DNA en la célula huésped. o De secuenciación: son vectores que contienen un elevado número de lugares de restricción, de manera que al ser cortado se generan fragmentos de tamaño variable para ser secuenciados. o De expresión: además de un lugar de clonación, el polilinker, contienen operadores, promotores, terminadores y un ribosome binding site, RBS, para permitir la expresión del DNA clonado. La introducción del DNA exógeno al plásmido se hace de diferente manera, en función de si al cortar con los enzimas de restricción se generan extremos romos o cohesivos. Si se generan extremos romos, los extremos 5 se digerirán con una exonucleasa, mientras que los 3 se elongarán mediante una transferasa terminal, con ATP o TTP, generando una cola de polia o polit. Se podrán unir entonces y formar el plásmido deseado. En el caso de que se generen extremos cohesivos, cortaremos con dos diferentes enzimas, de manera que el inserto se insertará en la dirección deseada en el plásmido. 3. Incorporación del vector con el DNA insertado en la célula huésped La eficiencia de la incorporación del DNA por la célula huésped es una fase crítica en la manipulación genética. Dentro de las células huésped podemos encontrar tanto microorganismos como células animales o vegetales. Dependiendo de la naturaleza del huésped usaremos uno u otro sistema para introducir el DNA, como pueden ser pistolas génicas, Agrobacterium, Selección de los huéspedes que hayan incorporado el vector Es necesario distinguir los clones que han introducido el DNA exógeno, para lo que podemos examinar diferentes puntos: o La presencia del vector recombinado, mediante el análisis de colonias. Para esto se usa la técnica de la inactivación del marcador, por ejemplo. Se trata de un vector con dos marcadores, pero que uno de ellos contiene la diana para la incorporación del DNA exógeno. De manera que, si da negativo para ambos marcadores, no habrá incorporado ningún vector, si da positivo en ambos, ha incorporado un vector que no tenía el inserto, pero si da positivo en uno y negativo en el otro, habrá incorporado el inserto con el DNA ajeno. o La presencia del DNA exógeno. Se puede hacer mediante la hibridación de las colonias. Se hace una réplica de la placa con un tampón de terciopelo sobre un filtro de nitrocelulosa, provocando la lisis de las colonias sobre el filtro y desnaturalizando el DNA. Se hace un lavado para eliminar el exceso de proteínas y se fija el DNA al filtro calentándolo y se analiza la presencia mediante una sonda para la secuencia específica. o Detección indirecta del DNA por expresión de la proteína, ya sea mediante un Northern, mrna, o un Western, detección de proteínas. 18

19 Aspectos de ingeniería a considerar para una fermentación industrial con éxito Las fermentaciones industriales se definen como procesos industriales, en los que los microorganismos son una parte muy activa del proceso productivo. El microorganismo es lo más importante en las fermentaciones industriales y los aspectos de ingeniería siempre están supeditados al organismo. En base a cual y como sea mi biocatalizador, y que producto quiera que sintetice, tendré que elegir, para diferentes aspectos, las condiciones que sean las más adecuadas para mi biocatalizador. La ingeniería es por lo tanto tan solo una herramienta que facilita el proceso que realiza el biocatalizador, mientras que en otras industrias puede ser la base esencial. Existen una serie de aspectos de ingeniería que se deben considerar. Salto de escala Implica el paso en el cual un procedimiento desarrollado con éxito en el laboratorio, en volúmenes reducidos, es modificado para ser usado en fermentaciones de gran tamaño, manteniendo las mismas condiciones. Implica la modificación de algunas condiciones de fermentación necesarias para mantener la productividad al variar algunas condiciones, como suelen ser dimensionales. Es necesario el salto de escala, el reajuste de algunos parámetros, cuando pasamos de laboratorio a planta industrial, debido al gran incremento en las proporciones. También es necesario un reajuste, cuando implementamos el uso de una nueva cepa con un rendimiento entre un 10 y un 20% superior a la anterior, ya que el cambio en la producción puede implicar cambios en las condiciones. El problema del salto de escalas viene dado por el hecho de que en las primeras fases se ha de comprobar el funcionamiento de la bacteria en el laboratorio, donde los objetivos son diferentes que en la planta. En el laboratorio se intentan optimizar la producción en términos puramente cuantitativos, mientras que en la planta es la optimización del rendimiento, considerando también los costes. Tener éxito en el salto de escala querrá decir conseguir la máxima producción en la planta, en el mínimo de tiempo y con el mínimo de costes. Tipo de proceso según la relación del biocatalizador con el medio y el agua Dependiendo del tipo de biocatalizador que tengamos, y de las condiciones de este, será más rentable usar un tipo u otro de medio y una determinada concentración de agua, así como inmovilizar el biocatalizador. Distinguiremos por lo tanto entre cultivos sumergidos o en superficie, así como también podremos tener el biocatalizador inmovilizado o no. Finalmente, el cultivo podrá ser sólido, semisólido o líquido. Existen numeroso métodos para inmovilizar células, como se ve en la gráfica. 19

20 Tipos de proceso según la cinética del proceso y la entrada de medio Una vez decidido como se hará, es necesario determinar la dinámica en la que realizarás el proceso, lo que depende más del producto que del microorganismo. También depende del tipo de medio que haya elegido que algunas opciones parezcan un poco sin sentido. Considerando la cinética de la entrada de medio podemos clasificar 3 tipos de cultivo: - Discontinuos (o batch) - Discontinuos con alimentación (Fed batch) - Continuos El hecho de decidir uno u otro tipo depende del biocatalizador y del producto que quieras conseguir. Cultivos continuos Es la aplicación del principio del quimiostato a la industria. La solución nutriente se añade continuamente al biorreactor a la vez que se extrae una cantidad equivalente de medio usado con organismos, una vez alcanzado el equilibrio. Se usa, o se intenta usar, porque es de difícil aplicación, cuando el producto de interés se sintetiza en la fase logarítmica del crecimiento. Por lo tanto interesa que las bacterias estén en esa fase cuanto más tiempo mejor, para lo que requieren más medio. Aunque en teoría el funcionamiento podría ser ilimitado, normalmente se consideraría un éxito el pasar de las 200, puesto que conseguir mantener las condiciones en el interior del fermentador es muy difícil. Presenta una serie de ventajas e inconvenientes: Ventajas de los cultivos continuos - Productividad: Si funciona bien, la productividad será máxima el tiempo que funcione. - Rentabilidad constante: El tiempo total es el tiempo entre 2 producciones consecutivas. En batch y fed-batch, aparte del tiempo de cultivo se ha añadir el de prefermentación, por lo que la rentabilidad es menor. - Aumento de beneficios: Se reducen costes, porque está todo automatizado Inconvenientes de los cultivos continuos - Poco versátil: Una vez puesto en marcha no se pueden alterar los parámetros, porque el equilibrio se destruiría. - Tecnología más cara - Duración real limitada: En muchos casos, en el laboratorio operan de 20 a 200h solo, pero para que fuese rentable tendría que funcionar entre 500 y 1000 horas, lo que no sucede. - Composición variable de medios: La entrada de medios es constante, pero la composición de estos medios es variable, por lo que el equilibrio se verá alterado. - Contaminaciones: Mantener condiciones estériles a nivel industrial durante largos períodos de tiempo - Cuando se usan cepas de elevado rendimiento se pueden producir mutantes degenerados que pueden crecer más rápido que las cepas productoras, con lo que te harán perder dinero y medio. Cultivos fed batch Los nutrientes críticos se añaden en baja cantidad al principio, pero continúan añadiéndose en dosis pequeñas a lo largo de todo el crecimiento, de manera escalonada. Este sistema se usa a menudo para la síntesis de metabolitos secundarios, la síntesis de los cuales está sometida a represión por el catabolito, o bien cuando el inóculo es problemático. 20

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