Oncoproteínas y la heterogeneidad del cáncer de mama. VIII Simposio Internacional GEICAM A Coruña 31/03 01/04

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1 Oncoproteínas y la heterogeneidad del cáncer de mama VIII Simposio Internacional GEICAM A Coruña 31/03 01/04

2 Clasificación del cáncer de mama según las características celulares del tumor 1. Tumores de mama hormonodependientes Receptor de estrógenos (RE) Receptor de progesterona (R) 2. Tumores de mama sobreexpresores de ErbB2/HER2 ErbB2/HER2 3. Tumores de mama triple negativos

3 Clasificación del cáncer de mama Receptor de estrógenos (RE) 1. Tumores de mama hormonodependientes Receptor de progesterona (R) E ER ERH roliferación celular resentes en el 70% de los tumores de mama Tratamiento Inhibidores de estrógenos (tamoxifen) Inhibidores de la enzima aromatasa Inhibidores de la enzima aromatasa (Anastrozol, Letrozol...)

4 Clasificación del cáncer de mama 2. Tumores de mama sobreexpresores de ErbB2/HER2 ErbB2/HER2 resentes en el 25-30% de los tumores de mama Mal pronóstico Tratamiento - Anticuerpos monoclonales anti-her2 - Inhibidores tirosina quinasa

5 Clasificación del cáncer de mama 3. Tumores de mama triple negativos resentes en el 15% de los tumores de mama No expresan cantidades detectables RE, R, ErbB2 Tratamiento - ocas opciones terapéuticas (quimioterapia) - Otras proteínas implicadas en tumores triple negativos (Abl, Src, EGFR, TEN, I3k/Akt)

6 2. Tumores de mama sobreexpresores de ErbB2/HER2 Receptores ErbB/HER ErbB1 HER1 EGFR ErbB2 HER2 Neu ErbB3 HER3 ErbB4 HER4

7 Estructura de los receptores ErbB/HER Brazo de dimerización I Ligando II Ectodominio I II IV III III IV Transmembrana Dominio tirosina quinasa Citosol Loop de activación Cola C-terminal conformación cerrada conformación extendida

8 Activación de los receptores ErbB/HER EGFR ErbB2 ErbB4 EGFR ErbB2 ErbB3 ErbB4

9 Fármaco Tipo Diana Estado Anticuerpos monoclonales Trastuzumab (Herceptin ) ertuzumab (Omnitarg ) Humanizado HER2 Aprobado en cáncer de mama Humanizado HER2 Ensayos clínicos para combinarlo en cáncer de mama. Inhibidores de la actividad tirosina quinasa Lapatinib (Tyverb ) TKI reversible EGFR y HER2 Aprobado su uso en cáncer de mama.

10 Búsqueda de nuevos tratamientos en tumores de mama HER2+ 1. Trastuzumab (Herceptin ) No funciona en todos los casos Funciona poco como tratamiento individual HER2 Shc I3K FAK Src Metabolización del MTT (% control) pher2 60 pakt 40 perk1/2 MEK1, AKT - + Trastuzumab ERK1/2 - + Trastuzumab mtor c-jun C-Fos p-p70s6k

11 Búsqueda de nuevos tratamientos en tumores de mama HER2+ HER2 2. Dasatinib (sprycel ) Abl C-Kit 1º DGFR Src 2º FAK Shc I3K FAK Src AKT MEK1,2 ERK1/2 mtor c-jun C-Fos p-p70s6k

12 La combinación Trastuzumab + Dasatinib inhibe la proliferación celular de forma sinérgica A B (% control) BT474 CalcuSyn Metabolizació ón del MTT ( Trastuzumab [10nM] Dasatinib [µm] CI µM 0.25µM 0.5µM 1µM Aditivo Sinérgico Fuerte sinergismo Trastuzumab u ab [10nM] Dasatinib [µm]

13 La combinación reduce la fosforilación de los receptores HER pegfr Control Trastuzumab Dasatinib Trastuzumab + Dasatinib pher2 pher3 BT474 Coordinate RTK Coordinate RTK A1,A2 Control o + D1,D2 Tie-2 A23,A24 Control + D3,D4 TrkA B1,B2 EGFR D5,D6 Trkb B3,B4 Erbb2 D7,D8 Trkc B5,B6 ErbB3 D9,D10 VGEFR1 B7,B8 ErbB4 D11,D12 VGEFR2 B9,B10 FGFR1 D13,D14 VGEFR3 B11,B12 FGFR2a D15,D16 MuSK B13,B14 FGFR3 D17,D18 EphA1 B15,B16 FGFR4 D19,D20 EphA2 B17,B18 Insulin R D21,D22 EphA3 B19,B20 IGF-1R D23,D24 EphA4 B21,B22 Axl E1,E2 EphA6 B23,B24 Dtk E3,E4 EphA7 C1,C2 Mer E5,E6 EphB1 C3,C4 HGFR E7,E8 EphB2 C5,C6 MSR E9,E10 EphB4 C7,C8 DGFRa E11,E12 EphB6 C9,C10 DGFRb E13,E14 M IgG1 C11,C12 SCFR E15,E16 M IgG1 2A C13,C14 Flt-3 E17,E18 M IgG1 2B C15,C16 M-CFSR E19,E20 G IgG C17,C18 c-ret E21,E22 BS C19,C20 ROR1 F1,F2 Y-Control C21,C22 ROR2 F23,F24 Y-Control C23,C24 Tie-1

14 Trastuzumab + Dasatinib bloquea la señalización de los receptores HER HER2 pshc Shc I3K FAK Shc pfak FAK Src AKT MEK1,2 psrc mtor Src perk1 p perk2 Erk1 Erk2 pakt Akt p-p70s6k ERK1/2 c-jun C-Fos p-p70s6k

15 La combinación reprime genes del ciclo celular y reparadores de daño en el ADN A Trastuzumab: 181 genes B Dasatinib: 193 genes Combinación: 263 genes Trastuzumab Dasatinib Reparación/ daño al ADN b 1 b 2 t 1 t 2 Control 1 Control 2 Trastuzumab Trastuzumab Dasatinib 1 Dasatinib 2 Trast + Dasat Trast + Dasat Rad 54B Rad 1 Rad GADD45 Combinación Ciclo celular Cdk2 Ciclina B Ciclina E1 Ciclina E2 p21 Otros 39% Ciclo celular 11% Genes de recombinación/daño ADN 10% Fold-change Genes de membrana plamática 17% Genes de transducción de señales 24%

16 La combinación reprime genes del ciclo celular y reparadores de daño en el ADN Ciclo celular Co ontrol 1 Co ontrol 2 Tra astuzumab 1 Tra astuzumab 2 Da asatinib 1 Da asatinib 2 Tra ast + Dasat 1 Tra ast + Dasat 2 Cdk2 Ciclina B Ciclina E1 Ciclina E2 p21 Cdk 2 Ciclina E1/2 Ciclina B p21 Trastuzumab + Dasatinib C horas Fold-change p Ciclo celular

17 La combinación reprime genes del ciclo celular y reparadores de daño en el ADN Trastuzumab + Dasatinib C horas Rad 1 Reparación/ daño al ADN Control 1 Control 2 Trastuzu Trastuzu mab 1 mab 2 Dasatinib 1 Dasatinib 2 Trast + Dasat 1 Trast + Dasat 2 Rad 54B Rad 1 Rad 51 GADD45 Rad 51 Rad 54B GADD45 Rad 50 Mre11 patm ph2ax GADH Daño en el ADN

18 La combinación reprime genes del ciclo celular y reparadores de daño en el ADN Ensayo cometa - Daño en el ADN A Control Dasatinib eta (µm) * p 0.05 * Trastuzumab Trast + Dasat Tama año del com C T D T+D B + Daño en el ADN ph2ax GADH

19 La combinación induce apoptosis A Ciclo celular ev ventos % Control 98% G0-G1: 84 % S: 11 % G2-M: 5 % % Trastuzumab 97% G0-G1: 83 % S: 14 % G2-M: 3 % Trastuzumab Dasatinib + Dasatinib 6% 56% 94% 44% FL-2 FL-2 FL-2 FL G0-G1: 77 % G0-G1: 68 % S: 14 % 60 S: 30 % G2-M: 9 % 40 G2-M: 2 %

20 La combinación induce apoptosis Fosfatidilserina Mitocondria Mediadores de muerte celular Cell shrinkage, membrane blebbing, fragmentación DNA, cromatina condensada, reparación DNA

21 La combinación induce apoptosis Anexina V Fosfatidilserina AnnexinV+/I- AnnexinV-/I- Control 92.5% 3% Trast 90% 2% Dasat 87.7% 6.2% Trast + Dasat 36.6% 51.4% Mediadores de muerte celular Mitocondria AnnexinV+/I+ 1.2% 0.5% 0.9% 6.4% AnnexinV-/I+ 3.3% 7.5% 3.3% 4.6%

22 La combinación induce apoptosis Daño al DNA otencial ria érdida de po de mitocondr (%) d ** ** p Dasatinib Trastuzumab Mediadores de muerte celular Mitocondria Cell shrinkage, membrane blebbing, fragmentación DNA, cromatina condensada, reparación DNA

23 La combinación induce apoptosis Daño al DNA Mitocondria Caspasas Citocromo C, SMAC, HtrA2 AIF, Endo G Apoptosis Caspasa-dependiente Apoptosis Caspasa-independiente

24 La combinación induce apoptosis Daño al DNA Mitocondria Caspasas Citocromo C, SMAC, HtrA2 AIF, Endo G Apoptosis Caspasa-dependiente Apoptosis Caspasa-independiente

25 La combinación induce apoptosis TRAIL FasL Daño al DNA Apoptosoma Cyt. C AAF Caspasa 9 Mitocondria Caspasa 3 Caspasa-dependiente Citocromo C, SMAC, HtrA2 HtrA2 Smac AIF, Endo G Caspasa-independiente

26 La combinación induce apoptosis TRAIL FasL Daño al DNA Caspasa-dependiente Mitocondria Caspasa 3 Citocromo C, SMAC, HtrA2 AIF, Endo G Actina Fodrina Rock1 Lamin A Gas2 AR Membrane blebbing, cell shrinkage Reparación DNA Caspasa-independiente

27 La combinación induce apoptosis independiente de caspasas A Caspasa 3 Caspasa 8 Caspasa 9 GADH B itivas para anexina V (%) Células posi C AR 1: Control 2: Z-IETD-FMK 3: Z-LEHD-FMK 4: Z-VAD-FMK 5: Trast+Dasat 6: Trast+ Dasat +Z-IETD-FMK 7: Trast+ Dasat + Z-LEHD-FMK 8: Trast+ Dasat + Z-VAD-FMK 9: Trail 10: Trail + Z-VAD-FMK

28 La combinación induce apoptosis Fosfatidilserina Mediadores de muerte celular Mitocondria Bcl2 antiapoptóticos: Bcl2, BclX, Mcl1 Bcl2 proapoptóticos: Bax, Bak, Noxa, uma, Bim, Bid Cell shrinkage, membrane blebbing, fragmentación DNA, cromatina condensada, reparación DNA

29 La combinación inhibe la expresión de proteínas anti-apoptóticas A B Bcl-2 Bcl-x AIF Mcl-1 GADH IA-1 pbad Calnexina Microsomas Citosol Bad

30 La combinación afecta al crecimiento tumoral en modelos animales Ratones inmunodeprimidos A Control Tratadas T+D B * del tumor (c cm 3 ) Volu umen medio Control Trastuzumab Dasatinib Trast + Dasat * < * Volumen medio del tum mor (cm 3 ) Tumor pequeño Tumor grande Tratamiento discontinuo Días de tratamiento 320 Sin tratar Días de tratamiento t t

31 HER2 protege a las células tumorales del daño en el ADN Trastuzumab HER2 Dasatinib Shc I3K FAK Src? Cdk Ciclinas roliferación y supervivencia p lar Ciclo cel celular Rad 1 Rad51 Rad54 Sistemas de reparación del ADN IA Bcl2 Mcl1 Sistemas de reparación del ADN Muerte por daño en el ADN y apoptosis

32 Juan Carlos Montero Samuel Seoane Alberto Ocaña Centro de Investigación del Cáncer Salamanca Hospital Clínico Universitario de Albacete, GEICAM Ministerio de Educación y Ciencia (MICINN) Ministerio de Sanidad y consumo (ISCIII) Spanish Cancer Centers Network rogram

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