INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA, CROMATOGRAFÍA. Curso de Métodos. Romero García Aida Susana

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1 INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA, UNAM CROMATOGRAFÍA Curso de Métodos Romero García Aida Susana Semestre 2/2002

2 Historia de la Cromatografía Way y Thompson: Reconocieron el fenómeno de intercambio iónico en sólidos Runge, Schoenbein, y Goeppelsroeder: Estudiaron el análisis por capilaridad en papel Lemberg: Ilustró la reversibilidad y estequiometría del intercambio iónico en minerales como el silicato de alumino Reed: Separación en columna en tubos de kaolín usados para la separación de FeCI 3 y el CuSO Tswett: Inventó la cromatografía en columna con el uso de solventes puros para desarrollar un cromatograma, usó adsorventes suaves para resolver una mezcla de pigmentos, (ver más detalles abajo) Karrer, Kuhn, y Strain: Usó adsorventes como hidróxido de calcio activado, aluminio y magnesio 1935 Holmes y Adams: Sintetizó resinas orgánicas para intercambio iónico Reichstein: Introdujo la cromatografía líquida o fluida, así extendió las aplicaciones de la cromatografía a sustancias sin color Izmailov y Schraiber: Describieron el uso de la capa fina de alumina extendida sobre un vidrio Brown: Primero que usó la cromatografía circular en papel Martin y Synge: Introdujo la cromatografía por partición en columna Consden, Gordon, y Martin: Primeros que describieron la cromatografía de partición en papel Boyd, Tompkins, Spedding, Rieman, y otros: Cromatografía de intercambio iónico aplicada a varios problemas analíticos M. Lederer y Linstead: Cromatografía en papel aplicada a compuestos inorgánicos Kirchner: Introdujo la cromatografía de capa fina como es practicada ahora James y Martin: Desarrollaron de la cromatografía de gas Sober y Peterson: Prepararon las primeras celulosas para intercambio iónico Lathe y Ruthvan: Usaron almidón natural y modificado como tamiz para la estimación del peso molecular.

3 1959 Porath y Flodin: Introdujeron al dextrán entrecruzado como tamiz molecular 1964 J. C. Moore: Desarrolló la cromatografía de permeación en gel. En 1906, el botánico ruso Mikhail Tswett ( ) formalizó el uso de la cromatografía en estudios científicos, aplicándola a la separación de los pigmentos naturales que se encuentran en las plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas). Además le dio ese nombre a la técnica. Tswett empacó una columna de vidrio vertical (de unos cuantos centímetros de diámetro) con material adsorbente. Luego, por la columna vertical virtió una solución que contenía la mezcla de pigmentos provenientes de las hojas molidas de una planta. Pasados unos minutos, el material empacado en la columna había adquirido una coloración diferente por segmentos. Es decir, había logrado la separación de los pigmentos naturales de la planta. En cada segmento de color definido había un pigmento diferente. CROMATOGRAFÍA La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. La fase estacionaria y la móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la muestra. Los componentes adyacentes (picos) se separan cuando el pico que sale después es retardado lo suficiente para impedir la sobreposición con el pico que emergió antes. Una amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un sentido amplio, la distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser

4 de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersión del tipo London. Parámetros teóricos que afectan la separación cromatográfica Comportamiento cromatográfico de los solutos. El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas formas. Considero ahora importante introducir las definiciones de algunos términos importantes para la cromatografía en columna (ver figura 1), como son: Tiempo de retención, t r. El tiempo que un soluto permanece en la columna, se mide desde el momento de la inyección hasta la elusión del pico máximo. Es característico del soluto para condiciones de operación constantes. Auxiliar en la identificación de los solutos. Tiempo muerto, t o. El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en la fase estacionaria. Tiempo que un soluto permanece en fase móvil. Representa el espacio vacío de la columna. Tiempo de retención ajustado, t r. Mide el tiempo que el componente permanece en fase estacionaria. t r = t r - t o Ancho a la base, W b. Es la porción de la línea base intersectada por las tangentes al pico. Para un pico gaussiano es igual a 4. Tradicionalmente usado en el cálculo de la eficiencia del sistema.

5 Ancho a la mitad de la altura, W_. Una medida mas reproducible, adecuada para evaluar manualmente la eficiencia del sistema (platos teóricos). Número de platos teóricos (N). Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución del soluto entre las fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder de separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos teóricos. Se calcula con cualquiera de las ecuaciones: Comportamiento de retención El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. El volumen de fase móvil necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de inyección, a través de la columna, hasta el detector (en el máximo del pico del soluto) se define como el volumen de retención, V r. Se puede obtener directamente del cromatograma multiplicando el tiempo de retención correspondiente, t r, por el gasto o flujo volumétrico, F c, expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo. V r = t r F c El gasto o flujo volumétrico, en términos de los parámetros de la columna, depende la sección transversal de la columna vacía, la porosidad total del relleno (empaque) de la columna y la velocidad lineal promedio de la fase móvil. Coeficiente de repartición Cuando un soluto entra al sistema cromatográfico inmediatamente se reparte o distribuye entre la fase móvil y la estacionaria. Si la fase móvil se para en cualquier momento el soluto establece un equilibrio de distribución entre las dos fases. La concentración en cada fase está dada por el coeficiente termodinámico de partición (o reparto): K = C s / C m donde C s y C m son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y móvil, respectivamente. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. El coeficiente de

6 reparto determina la velocidad promedio de cada zona de soluto, más específicamente, del centro de la zona de soluto conforme la fase móvil avanza a lo largo de la columna. Resolución El grado de separación o resolución de dos bandas adyacentes se define como la distancia entre los picos (o centros) dividida entre el ancho promedio de las bandas. Si la retención y el ancho de la banda se miden en unidades de tiempo (ver figura 2), la resolución está dada por: 2(t r,2 t r,1 ) R s = (W b,2 +W b,1 ) donde los tiempos de retención y los anchos se expresan en las mismas unidades. La resolución mínima aceptable en mezclas sencillas es 1.0 (ver figura 3), una resolución de 1.5 representa separación a la línea base. La resolución alcanzada en un sistema es proporcional al producto de la selectividad, la eficiencia y la capacidad del sistema, que son los tres más importantes parámetros de control en una columna cromatográfica, siendo la expresión analítica para Rs la siguiente:

7 (a-1) k Rs = _ ( N ) a (1+k) selectividad capacidad eficiencia La resolución de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la separación de los picos o disminuyendo los anchos de los picos individuales. Esto involucra la selectividad de la columna cuando se alejan más los picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico. Factor de Capacidad El factor de capacidad o retención k es la cantidad más importante de cromatografía en columna. Relaciona el equilibrio de distribución de la muestra dentro de la columna con las propiedades termodinámicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto dado de parámetros de operación, k es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relación el tiempo transcurrido en fase móvil. Se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase móvil: C s V s V s Factor de capacidad k = = K C m V m V m La razón volumétrica de fases, V m / V s, se denota usualmente por b. Así, k = K / b. Dicho de otra forma, la razón de reparto es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, en comparación con un soluto no retenido (para el cual k = 0), dividido entre el tiempo de elusión de una banda no retenida: k = V r1 - V 0 V 0 Capacidad La capacidad en un intercambiador iónico es una medida cuantitativa de su habilidad de tomar contra-iones intercambiables. La capacidad puede ser expresada como la capacidad iónica total, capacidad disponible o capacidad dinámica. La capacidad iónica total es el número de sustituyentes cargados por gramo drenado de intercambiador iónico o por ml de gel hidratado. La capacidad total puede medirse por titulación con un ácido o base fuerte.

8 Eficiencia La eficiencia de la columna está relacionada con el ensanchamiento de la banda que se encuentra en la columna y puede ser calculada: 2 V r1 donde W 1/2 es el ancho del pico a una altura media N = 5.54 del pico W 1/2 y se expresa como un número de platos teóricos (N) para la columna bajo condiciones experimentales específicas. La eficiencia es conocida frecuentemente como el número de platos teóricos por metro de cama cromatográfica, o expresada como H que es la longitud de la cama (L) dividida por el número de platos teóricos. H = L / N A partir de que el valor observado de N depende de factores experimentales tales como la velocidad de flujo y la carga de la muestra, es importante que las comparaciones sean hechas bajo condiciones idénticas. En el caso de la cromatografía de intercambio iónico, la eficiencia se mide bajo condiciones isocráticas, usando una sustancia que no interacciona con la matriz como por ejemplo, la acetona. Mejorar la cinética del sistema aumenta la eficiencia de la separación. Una de las principales causas del ensanchamiento de zona en una cama cromatográfica es la difusión longitudinal de moléculas de soluto. El efecto se minimiza si las distancias disponibles para difusión, en ambos la fase móvil y la fase estacionaria, son mínimas. En la práctica esto se logra usando tamaños de cuentas uniformes y pequeños. La mayor eficiencia se logra con minicuentas de 3mm de diámetro, no porosas diseñadas para aplicaciones analíticas y micropreparativas. Después del tamaño de cama, el segundo factor importante es una buena técnica experimental. Las camas cromatográficas empaquetadas irregularmente y burbujas de aire en ellas, producirán canales, ensanchamiento de la zona y pérdida de la resolución. Las buenas separaciones requieren columnas bien empaquetadas. Selectividad La selectividad (a) se define la habilidad del sistema para separar los picos, por ejemplo la distancia entre dos picos. El factor de selectividad puede ser calculado del cromatograma usando la expresión: k 2 V r2 - V 0 V r2 a = = = k 1 V r1 - V 0 V r1

9 Una buena selectividad es un factor muy importante, mejorar la selectividad implica alterar la termodinámica del sistema cromatográfico. Rs está relacionada de forma lineal con la selectividad pero relacionada de forma cuadrática con la eficiencia. Esto significa que un incremento de cuatro veces en la eficiencia es necesario para duplicar la resolución en condiciones isocráticas. La selectividad en la cromatografía de intercambio iónico depende no solo de la naturaleza y número de grupos iónicos en la matriz, también depende del ph y fuerza iónica. Tipos de cromatografía La cromatografía puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, mismo que es gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. Así la cromatografía puede ser de (1) adsorción, (2) partición, (3) intercambio iónico, (4) exclusión, y (5) afinidad (ver figura 4). 1. Cromatografía de adsorción La fase estacionaria es un sólido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía líquido-sólido) o un gas (cromatografía gas-sólido); los componentes se distribuyen entre dos fases a través de la combinación de los procesos de adsorción y desorción. La cromatografía de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografía por adsorción en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte sólido en un plato inerte. 2. Cromatografía de partición La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en un sólido inerte. Otra vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel.

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11 Estas son clasificaciones arbitrarias de la técnicas cromatográficas, y algunos tipos de cromatografía se les considera juntas como una técnica separada, como la cromatografía de gases para la cromatografía gas-sólido y gas-líquido. En cualquier caso, los equilibrios sucesivos son los que determinan cuanto tiempo el analito permanecerá unido o se moverá con el eluyente (fase móvil). La cromatografía de gases es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles. La disponibilidad de detectores versátiles y específicos, y la posibilidad de acoplar el cromatógrafo de gases a un espectro de masas o a un espectrofotómetro de infrarrojo, amplían aún más la utilidad de la cromatografía de gases. Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados para: 1) proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase móvil), 2) permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye, 3) contener la longitud apropiada de fase estacionaria, 4) mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura), 5) detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna, y 6) proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente. Sólo aprox. 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografía de gases, ya sea por que son insuficientemente volátiles y no pasan a través de la columna, o porque son térmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separación. La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra con ambas fases, móvil y estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase móvil para la cromatografía de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación. El recobro de la muestra es fácil en la HPLC. Las fracciones separadas se recolectan en forma sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la columna. El recobro es usualmente

12 cuantivativo (exceptuando la adsorción irreversible en la columna) y los componentes separados son fácilmente asilados del disolvente de la fase móvil. Adicionalmente al tipo usual de compuestos orgánicos, la cromatografía líquida en columna puede manejar separaciones de compuestos iónicos, productos lábiles de origen natural, materiales poliméricos y compuestos polifuncionales de alto peso molecular. En el modo normal de operaciones de partición líquido-líquido, una fase estacionaria polar (p. ej. agua, metanol) se usa con una fase estacionaria no polar (p. ej. hexano). Esto favorece la retención de compuestos polares y la elusión de compuestos no polares y se le conoce como cromatografía fase normal. Si se utiliza una fase estacionaria no polar con una fase móvil polar, entonces los solutos no polares serán retenidos y los solutos polares eluidos. Esto se conoce como cromatografía por fase reversa. El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa depende de interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto que une al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema. 3. Cromatografía de intercambio iónico La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico. Muchos de los experimento de intercambio iónico se llevan a cabo en cinco etapas. La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en las condiciones apropiadas de ph y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las moléculas de soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarán están asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente aniones o cationes simples, como cloruro o sodio).

13 En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en la cual las moléculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen son eluídas de la cama del intercambiador usando el buffer inicial. En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las condiciones de elusión, al desfavorecer la formación del enlace iónico de las moléculas de la muestra y la cama del intercambiador. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión o cambiando su ph. En las cuarta y quinta etapas corresponden a la remoción de sustancia no eluídas bajo las condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente purificación. La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen diferentes grados interacción con el intercambiador iónico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza iónica y el ph. Las diferencias en propiedades de carga de compuestos biológicos son a menudo considerables, y tomando en cuenta que la cromatografía de intercambio iónico es capaz de separar especies con propiedades poco diferentes. Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio iónico en una columna, mediante un procedimiento en lote o por adsorción en cama extendida. La matriz. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones móviles. Estos contra-iones pueden intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz. La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones también. Los intercambiadores cargados positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para ser intercambiados por lo que son llamados intercambiadores aniónicos. Intercambiadores cargados negativamente tienen contra-iones cargados positivamente (cationes) y se les conoce como intercambiadores catiónicos. La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos. Las características de la matriz determinan sus propiedades cromatográficas tales como su eficiencia,

14 capacidad y recuperación, así como su estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La naturaleza de la matriz afectará su comportamiento hacia sustancias biológicas y el mantenimiento de la actividad biológica Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un intercambiador iónico, y el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador iónico; su número total y disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden escogerse para usarse en intercambiadores iónicos; algunos de estos se muestran a continuación. Intercambiadores aniónicos Grupo funcional Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH 2 -CH 2 -N + H(CH 2 CH 3 ) 2 Aminoetil cuaternario (AEC) -O-CH 2 -CH 2 -N + H(CH 2 CH 5 ) 2 -CH 2 -CHOH-CH 3 Amonio cuaternario (C) -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -N + H(CH 3 ) 3 Intercambiadores catiónicos Grupo funcional Carboximetil (CM) -O-CH 2 -COO - Sulfopropil (SP) - -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 -CH 2 -CH 2 SO 3 Metil sulfonato (S) - -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 -CHOH-CH 2 SO 3 Se usan los grupos sulfónico y amino cuaternario para formar intercambiadores iónicos fuertes, los otros grupos formar intercambiadores iónicos débiles. Los términos fuerte y débiles se refieren a la extensión de variación de ionización con ph y no a la fuerza del enlace. Los intercambiadores iónicos fuertes están completamente ionizados en un amplio rango de ph mientras que con los intercambiadores iónicos débiles, el grado de disociación y la capacidad de intercambio varia más marcadamente con el ph. 4. Cromatografía de exclusión por tamaño En la cromatografía de exclusión puede separarse moléculas solvatadas de acuerdo a su tamaño y habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase estacionaria). La separación en cromatografía de partición y en cromatografía de intercambio iónico se logra de diferentes interacciones de solutos con la fase móvil y la fase estacionaria. En contraste, las separación en cromatografía de exclusión por tamaño se lleva a cabo por diferencias en tamaño molecular y la habilidad de diferentes moléculas para penetrar los poros de la fase estacionaria a diferentes tamaños o magnitudes.

15 La cromatografía de exclusión por tamaño se usa extensivamente para las separaciones preparativas de macromoléculas de origen biológico, así como para la purificación de polímeros orgánicos sintéticos. 5. Cromatografía de afinidad Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas de soluto y una segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. Por ejemplo, la molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo específico para un proteína particular. Cuando una mezcla cruda que contiene miles de proteínas se pasa a través de una columna, sólo una proteína reacciona con el anticuerpo que está unido a la columna. Después de lavar todos los otros solutos de la columna, la proteína deseada es desplazada del anticuerpo cambiando el ph, la fuerza iónica o la polaridad. Las interacciones entre las moléculas del ligando y blanco pueden ser el resultado de interacciones hidrofóbicas o interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals y/o puentes de hidrógeno. La purificación por afinidad requiere un ligando bioespecífico que puede ser unido covalentemente a una matriz cromatográfica. El ligando acoplado debe retener su afinidad específica de enlace hacia las moléculas blanco, y después de lavar el material no unido, la unión entre la molécula blanco y el ligando debe ser reversible y permitir que las moléculas blanco sean removidas en forma activa. Cualquier componente puede ser usado como un ligando para purificar a su compañero respectivo. Algunas interacciones biológicas típicas usadas frecuentemente en cromatografía de afinidad son: Enzima sustrato análogo, inhibidor, cofactor. Anticuerpo antígeno, virus, célula. Lecitina polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula. Ác. nucleico secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de ácidos nucleicos, proteína de unión al DNA. Hormona, vitamina receptor, proteína acarreadora. Glutatión glutatión-s-transferasa o proteínas de fusión GST Iones metálicos proteínas de fusión poli (his), proteínas nativas con histidina, residuos de cisteína y/o triptofano en sus superficies.

16 La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado. Algunas características importantes para ésta son: adsorción no específica extremadamente baja es esencial ya que el éxito de la cromatografía de afinidad depende de interacciones específicas, los grupos hidroxilo en los residuos de azúcar pueden servir para unirse a un ligando, proporcionando una plataforma ideal del desarrollo del medio de afinidad, la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unión alta, aún para biomoléculas grandes porque el interior de la matriz estaría disponible para el ataque de ligandos, propiedades de fluido buenas para la rápida separación, estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales tales como ph alto y bajo, detergentes y agentes disociadores. El ligando. Es la molécula que se une reversiblemente a moléculas específicas o grupo de moléculas, capacita la purificación por cromatografía de afinidad. La selección del ligando para cromatografía de afinidad está influenciado por dos factores: El ligando debe presentar una afinidad de unión específica y reversible para la sustancia blanco y debe tener grupos químicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su capacidad de unión. Brazo espaciador. El sitio de unión de una proteína blanco a menudo se localizan dentro de la molécula y un medio de afinidad preparado con pequeños ligandos acoplados directamente a la columna puede exhibir una capacidad de unión baja debido a interferencias estéricas, por ejemplo, el ligando no podría accesar al sitio de unión de la molécula blanco. En estas circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para facilitar la unión específica. El brazo espaciador puede ser diseñado para máximar la unión específica. APLICACIONES La cromatografía de adsorción es particularmente adecuada para el análisis de moléculas no ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son isómeros o compuestos muy relacionados. El intervalo de compuestos que pueden separarse se extiende desde los hidrocarburos muy polares hasta compuestos polifuncionales fuertemente polares. Esta cromatografía se ve poco influida por las diferencias en peso molecular y más por los grupos

17 funcionales específicos. En consecuencia, la separación por adsorción de compuestos que difieren solamente en el grado o tipo de sustitución alguilo, como en los miembros de las series homólogas, es pobre. Esta cromatografía se utiliza en la separación de la vitamina D 3 y sus metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas vitaminas), muchas drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos tricíclicos, bloqueadores beta y los PTHamino ácidos. Los aceites naturales y los extractos de esencias se analizan fácilmente y los pigmentos menos polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas, se han separado con éxito durante muchas décadas. Los ésteres también son factibles de ser separados, siendo los glicéridos y los ftalatos típicos de esta clase de compuestos. También han sido separadas en clumnas de sílice las aflatoxinas y otras micotoxinas. En química clínica cada vez se realiza con más frecuencia el análisis cuantitativo de las drogas de abuso por medio de la cromatografía de fase reversa. Los productos farmacéuticos que se analizan en forma rutinaria incluyen a los barbitúricos, drogas antiepilépticas, analgésicos y sedantes. Aplicaciones adicionales de los métodos de fase reversa son los conservadores alimentarios, herbicidas y azúcares. En el campo farmacéutico ha venido en aumento el uso de esta técnica a costa de la cromatografía de adsorción. Un amplio espectro de biomoléculas, lipofílicas o iónicas, pequeñas o grandes, pueden ser separadas debido a que el contenido de agua en la fase móvil puede variar desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en absoluto. Los compuestos lipofílicos, tal como los triglicéridos, que tienen una solubilidad muy pobre en los disolventes acuosos de la fase inversa, con frecuencia pueden separarse con una fase inversa no acuosa utilizando una columna empacada de octadecilo y disolventes orgánicos polares como el acetonitrilo o el tetrahidrofurano. En la actualidad, la cromatografía ha alcanzado tal nivel de fineza y especialización que cada uno de sus tipos constituyen herramientas imprescindibles en las áreas de la ciencia y la tecnología, en la industria química, farmacéutica, cosmética, en estudios ambientales, en la clínica, en alimentos, etc. Bibliografía Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A., Handbooks of Amersham Pharmacia Biotech: Ion Exchange Chromatography, Affinity Chromatography, Hydrophobic Interaction Chromatography, Reversed Phase Chromatography, Sweden,