T.P. N 3: COLORACIÓN

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Andrea Gómez Zúñiga
hace 8 años
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1 Histología Animal T.P. N 3: COLORACIÓN POR QUÉ ES NECESARIO COLOREAR UN CORTE HISTOLÓGICO? PREPARADOS FRESCOS U OBTENIDOS POST MORTEM SOLUCIONES COLOREADAS (M.O) Se diferencian sólo los elementos que poseen distinto índice de refracción (ir). Aquellos componentes con un ir. semejante aparecerán iguales al observador, por lo tanto serán confundidos en uno solo. Se unen selectivamente a ciertas estructuras, coloréandolas. Determinados detalles estructurales se hacen visibles Ej. Orceína Carmín de Best Fibras elásticas Glucógeno El estudio del preparado se realiza mediante el análisis cromático

Cuando una sustancia es incolora (no tiene absorción en el espectro visible), agregando algunos grupos no saturados (con doble ligadura) denominados CROMÓFOROS se pueden desplazar esas bandas hacia

2 Cuando una sustancia es incolora (no tiene absorción en el espectro visible), agregando algunos grupos no saturados (con doble ligadura) denominados CROMÓFOROS se pueden desplazar esas bandas hacia el espectro visible, entonces la sustancia presenta color. C O carbonilo N O nitroso N N azoico RESUMIENDO: Sustancia incolora + Cromóforos = CROMÓGENO No implica que la sustancia ya sea un colorante CROMÓGENO + AUXOCRÓMO = COLORANTE AUXOCRÓMOS: son radicales químicos que aumentan el color y adquieren la capacidad de colorear. Estos hacen que el cromógeno se ionice. Grupos aminos, hidroxilos, halógenos.

3 CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SU CARGA 1. BÁSICO Posee un grupo catiónico (R+=cromógeno) que se une a grupos ácidos de los tejidos: SO4= (sulfato); PO4= (fosfato). Azul de metileno Hematoxilina Fucsina básica Azul de toluidina 2. ÁCIDO Posee un grupo aniónico (R-) que se une a grupos básicos de los tejidos: NH3+ (grupo amino protonado). Na+ Na+ Eosina (Eosianato de Na) Orange G Azul de anilina 3. NEUTROS mezcla de un colorante ácido con uno básico. Eosianato de azul de metileno (May Grünwald)

4 Teniendo en cuenta la afinidad de un colorante por determinados grupos químicos presentes en el tejido diremos que: COMPONENTES TISULARES BASÓFILOS COLORANTE BÁSICO Formará uniones con componentes tisulares cargados (-) por ej. grupos ácidos Heterocromatina y nucléolos (grupos fosfato ionizados de los ácidos nucleicos). RER (grupo fosfato ionizados del ARN). Matriz extracelular del cartílago ( hidratos de carbono con grupos sulfatos. COMPONENTES TISULARES ACIDÓFILOS COLORANTE ÁCIDO Carga (-) aniónica Formará uniones con componentes tisulares cargados (+) por ej. grupos básicos Filamentos citoplasmáticos (Ej. Actina, miosina). Componentes membranosos intracelulares. Citoplasma en general. Fibras extracelulares (grupos aminos ionizados).

5 La intensidad de la coloración dependerá del grado de acidez o alcalinidad del medio. COLORANTE ÁCIDO Carga (-) aniónica Ej. Eosina (carga -) + COLORANTE BÁSICO carga (+) catiónico Ej. Azul Alcian (carga +)

6 CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES VEGETALES NATURALES Hematoxilina Orceína POR SU ORIGEN ANIMALES Carmín ARTIFICIALES Derivados de la destilación de la hulla Colorantes de anilina

MECANISMOS DE COLORACIÓN POR QUÉ SE COLOREA? FÍSICOS: a) Por disolución del colorante en distintas sustancias o componentes tisulares. Ej. Sudan III se disuelve en lípidos.

7 MECANISMOS DE COLORACIÓN POR QUÉ SE COLOREA? FÍSICOS: a) Por disolución del colorante en distintas sustancias o componentes tisulares. Ej. Sudan III se disuelve en lípidos. b) Por impregnación metálica: precipitación de sales metálicas sobre estructuras con diferente densidad. Ej. Sales de Ag (Técnica de Río Hortega), Hg (Técnica de Ramón Moliner).

8 QUÍMICA: Detección de una sustancia determinada a través de una unión química específica. Ej: Técnicas histoquímicas Reacción del ácido periódico-reactivo de Schiff (PAS) Reacción del azul alcian (AB) (detección de glicoconjugados) Técnica con Carmín de Best (detección de glucógeno). FÍSICOQUÍMICA (la mayoría) El colorante se une a la sustancia coloreable específica combinándose íntimamente con ella debido a la presencia de agrupaciones moleculares básicas y ácidas en los tejidos que se unirán con los grupos ácidos y básicos de los colorantes.

Ej: azul de metileno COMBINADA: se utilizan dos o más colorantes, se recurre al empleo de colorantes básicos y

9 GLOSARIO aplicable a coloraciones y/o colorantes SIMPLE: se utiliza un solo colorante y por ende se colorea solamente algunos elementos del preparado. Ej: azul de metileno COMBINADA: se utilizan dos o más colorantes, se recurre al empleo de colorantes básicos y ácidos. Ej: Hematoxilina-eosina Sucesiva: Tricrómico de Masson; H&E. Simultánea: Tricrómico de Mallory (azul de anilina-orange G) Hematoxilina-Eosina Tricrómico de Masson modificado Tricrómico de Mallory

10 PROGRESIVA: se deja actuar al colorante hasta obtener una coloración óptima. Ej: Orceína, para fibras elásticas (Técnica de Fränkel). REGRESIVA: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el exceso del colorante por medio de diferenciadores. Este proceso se denomina diferenciación. Ej: Coloración de Mallory-Heidenhain (AZAN): el azocarmín (colorante ácido) tiñe tantos núcleos como citoplasma. Diferenciador: 0.1% de aceite de anilina en ROH 96º.

11 DIRECTA: existe una verdadera afinidad entre la sustancia a colorear y el colorante. Ej: Eosina En un tiempo: Ej. Hematoxilina de Carazzi Hematoxilina al oxidarse con la luz o una sustancia oxidante INDIRECTA: requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que la coloración tenga lugar. Hemateína + Alumbre de K o Fe (mordiente) LACA O HEMALUMBRE En dos tiempos: Ej: Hematoxilina de Regaud 1º actúa el mordiente directamente en el tejido y luego el colorante. La laca se forma en el tejido.

12 PANÓPTICA: es una coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros. Ej. Coloración de May Grünwald-Giensa PANCRÓMICA: en un solo colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesitan. Ej. Coloración de Pappenheim Se mezcla en una solución colorante: ácido fénico, verde de metilo y pironina en agua destilada.

13 ORTOCROMÁTICA: el tejido toma el mismo color que el colorante. Ej. la fucsina, hematoxilina. METACROMÁTICA: un componente celular o una sustancia se tiñe de un color diferente al del colorante. Ej. azul de metileno, azul de toluidina Componentes tisulares inducen a que el colorante se polimerice y modifique su color. Se da con colorantes básicos

14 TÉCNICAS DE COLORACIÓN Coloraciones pueden ser: GENERALES O TOPOGRÁFICAS H & E Tricrómico de Masson AZAN ESPECIALES Fränkel Sudan III Klüver-Barrera Impregnaciones argénticas

15 HISTOQUÍMICAS APS Azul Alcian INMUNOHISTOQUÍMICAS

PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIÓN PARA CORTES EN PARAFINA Desparafinar: coplin con xilol (5 min). Hidratación (hasta el diluyente del colorante) ROH 96º: 1 min. COLODIONAR ROH 70º: 1 min.

16 PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIÓN PARA CORTES EN PARAFINA Desparafinar: coplin con xilol (5 min). Hidratación (hasta el diluyente del colorante) ROH 96º: 1 min. COLODIONAR ROH 70º: 1 min. ROH 50º: 1 min. AGUA DESTILADA: 1 min. Coloración propiamente dicha VER PROTOCOLOS Deshidratación ROH 96º: un pasaje Secar con papel de filtro o estufa. Aclaración Coplin con xilol (ATENCIÓN!!!) Montado COLORACIÓN ACLARACIÓN Utilización de un medio químicamente anhidro.

19 Coloraciones topográficas en cortes en parafina Hematoxilina-Eosina Tricrómico de Masson modificado

20 PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIÓN PARA CORTES EN RESINA Hidratación AGUA DESTILADA: 10 min Coloración propiamente dicha HEMATOXILINA DE CARAZZI 30 min Viraje en H2O corriente Lavado en H2O destilada EOSINA ALCOHOLICA IODADA 3 a 5 min. Controlar bajo microscopio. Lavar con H2O destilada Deshidratación ROH 90º: un pasaje ROH 100 un pasaje Dejar secar bajo campana Montaje Utilización de un medio químicamente anhidro.

21 Resina vs. Parafina Ventajas La inclusión y preparación del taco, lleva menos pasos y los tiempos son reducidos. Las estructuras celulares se observan con mayor definición. No interviene el efecto de la temperatura. No se utiliza xilol. Desventajas La inclusión y preparación del taco, deben hacerse el mismo día, no se pueden generar pausas en el proceso. Precisión en la preparación de las soluciones de trabajo. El tiempo de montaje del corte sobre el portaobjeto puede ser mayor. Es mas difícil lograr cortes seriados. Costos elevados. Tóxico.

22 Agradecimiento a Dra. J. Gimenez Hematoxilina -Eosina

23 Agradecimiento a Dra. J. Gimenez Hematoxilina -Eosina

24 Agradecimiento a Lic. M. Ojeda Tricrómico de Masson modificado

25 Hematoxilina -Eosina

26 Development of the Follicle Complex and Oocyte taging in Red Drum, Sciaenops ocellatus Linnaeus, 1776 (Perciformes, Sciaenidae). Dr. Harry J. Grier JOURNAL OF MORPHOLOGY 273: (2012)

27 PROTOCOLO DE COLORACIÓN PARA CORTES SEMIFINOS (MET) Cortes de 1 µm de espesor previo a la obtención de cortes ultrafinos.

28 PROTOCOLO DE CONTRASTE PARA CORTES SEMIFINOS (MET)

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