INDUCCION DEL DIMORFISMO EN Ustilago maydis

Transcripción

1 Memorias del XIV Congreso de Bioenergética y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C. 13 al 18 noviembre 2005; Oaxaca, Oaxaca. INDUCCION DEL DIMORFISMO EN Ustilago maydis Sánchez Medina M. A., Villagómez E., Pérez Santiago A. D. y Córdoba Alva F. Unidad de Bioquímica e Inmunología, Instituto Tecnológico de Oaxaca, Av. Ing. Víctor Bravo Ahuja No. 125, Esq. Calzada Tecnológico, Oaxaca, Oax , México almado@itoaxaca.edu.mx Resumen Con la finalidad de estudiar la participación de las estructuras glicosídicas superficiales de U. maydis en la transición dimórfica, y contribuir al entendimiento de los mecanismos de reconocimiento e infección entre hongos y plantas, se ensayó el efecto de la adición de Concanavalina A (Con A) al cultivo de hongo. Los datos mostraron que la distribución de estructuras glicosídicas específicas para Con A, principalmente manosa y glucosa, varía durante el ciclo de vida, presentándose en la zona de gemación de la levadura y en las puntas y zonas septadas del micelio. Tanto en basidiosporas como en micelio, Con A produjo modificación celular, aglutinación celular e incremento de la densidad celular. En la infección de plantas de maíz inoculadas con células de U. maydis incubadas previamente con Con A, no se observó el ciclo de vida completo del hongo, sin embargo, cuando se dio un tratamiento enzimático a las células con β-glucosidasa previo a la inoculación de las plantas, sí se presentó el ciclo de vida completo en un periodo de tiempo menor al del control. Introducción Ustilago maydis es un patógeno específico para maíz (Zea mays) y teocinte (Z. mexicana), y es responsable de la enfermedad denominada carbón común del maíz. Esta enfermedad se caracteriza por la inducción inicial de clorosis y/o pigmentación de antocianinas, y la formación de agallas características en los granos de elote, espiga, hojas de la planta, tallos y raíces de anclaje. U. maydis generalmente sobrevive como teliospora en plantas infectadas, en el suelo o en el estiércol si ha sido ingerido (1).

2 Los hongos generalmente muestran dos formas de crecimiento, levaduriforme o filamentoso, considerando que los hongos dimórficos una vez que son estimulados por las condiciones del ambiente, son capaces de pasar del estado de crecimiento levaduriforme al micelial. La forma patogénica del hongo Ustilago maydis es un filamento dicariótico (hifa), el cual consiste de una célula cilíndrica alargada separada por septas, en esta etapa del desarrollo, el hongo es capaz de colonizar el tejido e inducir tumores. La infección del huésped por U. maydis es una parte obligada del ciclo de vida y conlleva varios pasos: la formación de tubos de conjugación por las células haploides de diferente loci, la fusión de células para formar el dicarión, y finalmente el crecimiento (hifal) de filamentos del dicarión. El filamento dicariótico invade la planta a través de aberturas naturales, tales como estomas u órganos florales o por penetración directa. En la naturaleza, el proceso de apareamiento ocurre en la superficie de las hojas. Los tubos de conjugación forman hifas dicarióticas ramificadas, las cuales proliferan inter e intracelularmente iniciando la formación del tumor en diferentes partes de la planta (2,3). Cuando se compara a otros sistemas, U. maydis presenta un número de propiedades genéticas que lo hacen un importante candidato para esclarecer el mecanismo molecular de los hongos fitopatógenos y ha sido bien estudiado con respecto a su apareamiento, morfogénesis, patogenicidad, señales de transducción, recombinación de DNA, y, recientemente, pruebas genómicas, sin embargo, el mecanismo de reconocimiento planta-patógeno no es conocido (4,5). En la Unidad de Bioquímica del Instituto Tecnológico de Oaxaca, se ha reportado que las lectinas Triticum vulgaris, Phaseolus lunatus, Dolichos biflorus y coleoptilo de maíz (LCM), muestran inhibición de la germinación de teliosporas y el crecimiento fúngico de Ustilago maydis. Por el contrario, la lectina Concanavalina A no inhibe la germinación de teliosporas ni el crecimiento del mismo hongo (6,7). En este trabajo se utilizó Concanavalina A para identificar la distribución de estructuras glícosídicas durante la fase dimórfica de U. maydis, la cual es su etapa infectiva; así como evaluar el efecto de la lectina en esta fase del ciclo de desarrollo del hongo y reconocer su participación en la inducción del dimorfismo in vitro y en la infección de la planta.

3 Objetivos El objetivo de este trabajo fue estudiar la participación de estructuras glucosídicas superficiales de Ustilago maydis en el dimorfismo, determinar el efecto de Concanavalina A en la fase dimórfica in vitro, y en la infección de plantulas de maíz in vivo. Materiales y métodos Efecto de Con A sobre el micelio de U. maydis en medio líquido. Para obtener micelio de U. maydis en medio líquido, se realizaron modificaciones al método reportado por Ruiz-Herrera y colaboradores (8). Una solución de Con A ( µg/ml) fue adicionada a matraces de 10 ml de caldo Czapek previamente inoculado con la cepa de Ustilago maydis. Se dio seguimiento al crecimiento del cultivo cada 12 horas, midiendo densidad óptica a 650 nm y observación microscópica para detectar aglutinación y cambios morfológicos. Marcaje de células. Se tomó 500 µl del cultivo de U. maydis en medio Czapek, y se lavó por centrifugación cinco veces con PBS ph 7.2 estéril a 5000 rpm por 5 minutos. Se resuspendió el paquete celular en 400 µl de PBS ph 7.2 estéril y se adicionó 100 µl del marcador Concanavalina A-Alexa Fluor de 50 µg/ml de concentración. Se incubó durante 1 h a temperatura ambiente, en la oscuridad. Transcurrido el tiempo, se lavaron las células 5 veces más con PBS ph 7.2 estéril. El paquete celular fue suspendido en 100 µl de agua destilada estéril y se colocaron 10 µl de la suspensión en un portaobjetos. Se observó el marcaje celular en el microscopio de fluorescencia. Como control se utilizó una solución de α-manopiranosa 0.5 M y Concanavalina A-Alexa Fluor 50 µg/ml para incubar las células. Infección de plantas de maíz con basidiosporas de Ustilago maydis Semillas de maíz (Berentsen, Especie B-24, Variedad SB-302) fueron germinadas en charolas con tierra estéril, a 25+3º C. A los diez días de germinadas, las plantas fueron inoculadas en la base del tallo con 100 µl de una suspensión de

4 basidiosporas de 24 horas de edad, incubadas a º C y 100 rpm, obtenidas en medio CPES ph 7 y de 2.0 x 10 8 células/ml de concentración, para ello se utilizó una jeringa con aguja para insulina (1cc/ml 27Gx1/2). Las plántulas se incubaron a 25+3º C durante 15 días, analizando el estado de la infección por microscopía de contraste de fase cada 24 horas. Las muestras fueron obtenidas realizando cortes con bisturí en hojas y tallo, se colocaron sobre portaobjetos y fueron cubiertos con 20 µl de una solución de Rosa de Bengala 0.5% (Sigma, R-4507), se colocó un cubreobjetos y se mantuvo en reposo por 3 minutos. Para analizar el efecto de Con A en la infección de plantas de maíz in vivo, las basidiosporas de U. maydis fueron incubadas con Concanavalina A durante 24 horas y posteriormente fueron empleadas para la inoculación. Tratamiento enzimático de las células con β-glucosidasa. Para eliminar las estructuras β-glucosídicas de la superficie celular del hongo, se utilizó β- glucosidasa de almendras (Sigma, G-4511). A una suspensión de 2 x 10 8 células/ml, se adicionó 3 unidades de la enzima. Se incubó el paquete durante 1 hora a º C, transcurrido el tiempo, se lavó el paquete celular una vez con PBS ph 7.2 para retirar el excedente de la enzima, se resuspendieron las células y se inocularon las plantas. RESULTADOS Efecto de Con A en el crecimiento de micelio. Se experimentó el efecto de varias concentraciones de Concanavalina A sobre el dimorfismo de U. maydis, encontrándose que el comportamiento del micelio varía de acuerdo a la concentración de lectina; cuando se incubó con 50 µg/ml de lectina, se tuvo un comportamiento muy similar al control sin lectina, sólo después de las 51 hrs. de edad del cultivo, la densidad celular disminuyó con respecto al control, reduciéndose la pendiente de la curva hasta volverse casi estacionaria. En la Figura 1, se observa que la concentración de 500 µg/ml de lectina propició mayor densidad celular de micelio de U. maydis.

5 Figura 1. Efecto de Concanavalina A en el crecimiento de micelio. Densidad Optica de Ustilago maydis en matraces a ph 3 sin lectina ( ) y con 500 µg/ml de Con A ( ). Los datos graficados son el promedio de tres lecturas diferentes. Por otra parte, se presentó aglutinación celular en la fase dimórfica de U. maydis, la cual se incrementó conforme aumentó la concentración de Con A en el medio de cultivo (Figura 2). Cuando se probó con 300 µg/ml y 500 µg/ml de Concanavalina A, la aglutinación del micelio es considerablemente mayor que en el matraz con 50 µg/ml. Figura 2. Efecto de Con A en la aglutinación de U. maydis. La concentración de Con A, incrementa la aglutinación de U. maydis en medio czapek ph 3 a 28º C, d) 500 µ/ml (100 x). Las observaciones microscópicas fueron realizadas a las 24 h de edad del cultivo. En cuanto a la morfología, a las 48 horas del cultivo, el micelio del matraz control sin lectina representaba aproximadamente un 80% del paquete celular, se trataba de micelio septado y alargado con ramificaciones, sin embargo, el micelio obtenido en presencia de Con A presentó engrosamiento en algunas regiones. Marcaje fluorescente. El micelio obtenido y lavado con PBS, incubando durante una hora a º C y en total oscuridad con 50 µg/ml del fluorocromo

6 Concanavalina A-Alexa-Fluor 488, no se marcó (Figura 3a), sugiriendo la necesidad de un tratamiento adicional para descubrir los azúcares específicos para la lectina (Figura 3b). a b Figura 3. Marcaje fluorescente de micelio de U. maydis. Micelio marcado con 50 µg/ml de Con A- Alexa-Fluor 488 durante 1 hora a º C; a) Fluorescencia; b) Micelio tratado previamente durante una hora con 5 unidades de β-glucosidasa. 1000x. Infección de plantas. Plantas de maíz de 10 días de crecimiento, fueron inoculadas en la base del tallo con 100 µl de una suspensión de basidiosporas de 2.0x10 8 células/ml de concentración. A partir del día 8 y hasta el 14 se encontró micelio fraccionado para formar teliosporas. En las hojas se encontró micelio delgado desde el noveno día, aunque también había basidiosporas. Tratamiento con Concanavalina A. Cuando las basidiosporas incubadas con 500 µg/ml de Concanavalina A fueron inoculadas en la base del tallo de plantas de maíz de 10 días de germinadas, a partir del primer día posterior a la inoculación se encontró su presencia alrededor de la zona de infección y algunas pequeñas hifas aparecieron en el cuerpo de células alargadas. En ninguna de las observaciones hechas se encontró la presencia de micelio fragmentado, teliosporas inmaduras o maduras, lo que sugiere que la lectina está modificando de tal forma la superficie celular que no permite que el ciclo biológico de Ustilago maydis finalice. Tratamiento enzimático de las células con β-glucosidasa. Cuando las plantas de maíz fueron infectadas con basidiosporas previamente incubadas con 3

7 unidades de enzima β-glucosidasa durante un periodo de una hora, se observó un comportamiento igual al control durante los primeros tres días de infección, observándose la presencia de basidiosporas alrededor de la zona de inoculación después de 24 horas y células alargadas el segundo día. El cuarto día posterior a la inoculación se encontró micelio fragmentado y teliosporas maduras en el tejido vegetal. El micelio fragmentado se observó hasta el octavo día y no se llegó a observar la presencia de teliosporas maduras. S/L Con A β-glucosidasa Inóculo 2-5 días 8-10 días Figura 4. Infección de plantulas de maíz por U. maydis con diferente tratamiento. a,b y c. U. maydis sin lectina. d,e y f. U. maydis previamente tratado con lectina (500 µg/ml). g,h,i. U. maydis previamente tratado con β-glicosidasa. Discusión Estos resultados nos permiten considerar que las estructuras glicosídicas de la superficie de U. maydis específicas para Concanavalina A (manosa y glucosa),

8 varían su concentración y modifican su distribución en el cuerpo de la célula durante la transición dimórfica, encontrándose en las basidiosporas principalmente en las zonas de gemación y en el micelio en las puntas y zonas septadas, lo que plantea la importancia de esta distribución para preservar la célula y asegurar la fijación del hongo a la planta. La interacción de Con A con U. maydis in vitro sugiere que las estructuras sacarídicas presentes en el hongo (9) y reconocidas por la lectina funcionen como receptores que participan en el desarrollo del hongo. Sin embargo, aunque in vivo el hongo previamente tratado con la lectina no finaliza su ciclo biológico en la planta, no hay fragmentación del micelio ni formación de teliosporas, también sugiere que esas estructuras sacarídicas participan como una señal que dispara diferentes aspectos del desarrollo fungal que incluye la septación y fragmentación hifal. A partir de los resultados obtenidos en este trabajo, se propone que los azúcares de la superficie celular de U. maydis específicos para Con A, podrían participar como elicitors en el reconocimiento de la planta. Este reconocimiento se realizaría a través de proteínas de estructura molecular semejante a la Con A presentes en la superficie de las células de la planta. Varios cambios fisiológicos están asociados con la respuesta de hipersensibilidad, incluyendo la producción de reactivos de oxígeno, fortificaciones de la pared celular, deposición callosa, abertura transitoria de los canales de iones, alcalinización de medios de crecimiento, activación transcripcional de genes relacionados con la patogénesis, producción de fitoalexinas antimicrobianas y cambios en la fosforilación proteica. Además de estos cambios, se generan moléculas de señal secundarias que pueden estar involucradas en la señalización a larga distancia de las respuestas de defensa de la planta e incrementar la resistencia a posteriores ataques patogénicos. Para comprender a detalle el mecanismo de infección del hongo a la planta, es conveniente la aplicación de técnicas de biología molecular en la identificación de los genes que participan en el reconocimiento planta-patógeno. Agradecimientos Al CONACYT por la beca otorgada : Al Cosnet por el Proyecto P.

9 Referencias 1. Agrios, G. N. (1998) Fitopatología. Ed. Noriega, México D. F., 2a edición. 838 pp. 2. Banuett, F. and Herskowitz, I.(1994) Morphological Transitions in the Cycle of Ustilago maydis and Their Genetic Control by the a and b Loci. Experimental Micology 18: Banuett, F. and Herskowitz, I. (1996) Discrete develomental stages during teliospore formation in the corn smut fungus, Ustilago maydis. Development 122: Basse, C.W. y Steinberg, G. (2004) Ustilago maydis, model system for analysis of the molecular basis of fungal pathogenicity. Molecular Plant Pathology 5(2): Bölker, M. (2001) Ustilago maydis a valuable model system for the study of fungal dimorphism and virulence. Microbiology 147: Pérez-Santiago, A, Saavedra, E., Pérez-Campos, E., and Córdoba, F. (2000) Effect of plant lectins on Ustilago maydis in vitro. Cellular and Molecular Life Sciences 57: Saavedra Hernández, E., Pérez Santiago, A., Pérez Campos, E., Córdoba Alva, F. (2003) Efecto de la Concanavalina A en el Cultivo del fitopatógeno Ustilago maydis. Interciencia 28(5): Ruiz-Herrera, J., Leon, C. G., Guevara-Olvera, L., and Carabez-Trejo, A. (1995) Yeast-mycelial dimorphism of haploid and diploid strains of Ustilago maydis. Microbiology 141: Ruiz-Herrera, J., Leon, C. G., Carabez-Trejo, A., and Reyes-Salinas, E. (1996) Structure and Chemical Composition of the Cell walls from the Haploid Yeast and Mycelial Forms of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology 20: