AIREACIÓN C = ,5 x t. C = expresado en partes por millón

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1 1 AIREACIÓN El rol de los dispositivos de aireación colocados en los fermentadores, es de proveer a los microorganismos del oxigeno necesario para su crecimiento. Por otra parte el fin de la agitación es asegurar la uniformidad de la suspensión microbiana de manera de acelerar la rapidez de intercambio entre esta y el medio de cultivo. La turbulencia generada por la agitación además, permite la división de las burbujas de aire lo que aumenta la superficie de contacto y la duración de este, entre el oxigeno y los microorganismos. La demanda de oxigeno de cultivos líquidos es satisfecha inicialmente por el oxigeno disuelto en el medio proveniente del aire atmosférico, debido a la solubilidad extremadamente baja del mismo en medios líquidos, ( 7 ppm a 37º C ), esta no puede ser satisfecha, si no se toman medidas para restituir el oxigeno disuelto, por ejemplo en un cultivo denso y de rápido crecimiento. El método corriente es el burbujeo, pero a veces no logra aumentar el factor critico ( concentración de oxigeno disuelto ), porque por ejemplo, si las burbujas son de gran tamaño escapan rápidamente del seno del liquido hacia la superficie del mismo. La solubilidad el oxigeno es baja en agua pura ( 7 ppm ), pero esta tasa no es alcanzada en la industria ya que el aire no contiene mas del 20,9 % de oxigeno. La solubilidad del oxigeno es inversamente proporcional a la temperatura y entre 5 y 30º C puede ser calculada por la siguiente formula: C = ,5 x t C = expresado en partes por millón La presencia de compuestos disueltos disminuye la solubilidad del oxigeno, por este motivo es que en el agua de mar, la cantidad de oxigeno es el 80 % del disuelto en agua pura. Como las enzimas microbianas están localizadas en el interior de los microorganismos estos no pueden utilizar fácilmente el oxigeno disuelto en el medio de cultivo, por esta causa y por la baja solubilidad, la reserva de gas es muy baja, la cantidad disuelta en todo momento y lugar del medio de cultivo debe ser superior a un valor critico pre-establecido, por debajo del cual los disturbios metabólicos acarrean la muerte celular. A todo esto debe sumarse la viscosidad del medio, densidad celular, presencia de metabolitos, variaciones en la composición del sustrato, presencia de micelio, etc. todos factores que disminuyen la disponibilidad del oxigeno disuelto.

2 2 El método corriente de suministro es la aireación, pero a veces no se logra aumentar la eficacia de la oxigenación porque por ejemplo el aire introducido escapa rápidamente del medio. La demanda de oxigeno por ml de cultivo es igual a la demanda por célula por el numero de células por ml. La mayor demanda para un cultivo se registra al final del crecimiento exponencial, sin embargo, la demanda por célula es mayor en la fase de latencia debido al aumento de tamaño y permanece constante por unidad de peso durante todo el ciclo de crecimiento. La respiración celular y el crecimiento es prácticamente independiente de la concentración de oxigeno ha condición que esta concentración sea mantenida por encima de un valor critico por lo tanto no hay necesidad de trabajar con oxigeno en exceso. Es necesario conocer la demanda máxima de oxigeno de un microorganismo ya que condiciona su productividad. Se utiliza el coeficiente de absorción de oxigeno QO 2 definido por la cantidad de microlitros de oxigeno absorbidos por miligramo de células secas y por hora, podemos decir entonces que si C es la concentración, la formula seria: DEMANDA MÁXIMA = QO 2. C moles / litro / hora Para muchos microorganismos ya es conocida la demanda, si no la conocemos podemos obtenerla utilizando por ejemplo el respirometro de Warburg. Las técnicas respirometricas están basadas en la medida e interpretación del consumo biológico de oxigeno, debido a la respiración aeróbica, de una población microbiana bajo unas condiciones determinadas. El consumo biológico de oxigeno esta directamente relacionado con el crecimiento bacteriano y con el consumo de sustrato para la obtención de energía. Con el respirometro manometrico de Warburg,el oxigeno utilizado se mide con respecto al tiempo anotando la disminución de presión en el recipiente donde se esta realizando la respirometria, que tiene volumen constante, es hermético y se mantiene a temperatura constante. En el recipiente se introduce la muestra a analizar dejando una cámara de aire y además se coloca un vaso con una solución de hidróxido de potasio para que absorba el CO 2 producido, de tal forma que la disminución de la presión sea una medida del oxigeno consumido. Es un ejemplo de respirometro, en el que la medida de la concentración de oxigeno se realiza de manera indirecta y tanto la muestra liquida como el gas permanecen de manera estática en el interior del recipiente, sin que exista renovación alguna de ambos componentes durante la determinación.

3 3 MANOMETRO MUESTRA SOLUCION DE KOH Es necesario poder medir el consumo de oxigeno de los microorganismos y además la eficacia de los dispositivos de aireación para cada uno de ellos. Un método eficaz es el de Cooper, que se basa en la oxidación de sulfito a sulfato en presencia de un catalizador de cobre y a ph alcalino ( 8 ) El oxigeno absorbido por un volumen conocido de solución de sulfito de sodio se mide valorando la cantidad de este antes y después de la aireación. Se coloca agua en un recipiente y se añaden cantidades sulfito de sodio hasta que el ion sulfito ( SO 3 ) alcance una concentración aproximada de 1 N y sulfato de cobre hasta una concentración de por lo menos 0,001 M de Cu. Una vez disuelto todo se toma una muestra inicial y una segunda muestra después de un periodo de aireación establecido. Se vierte cada muestra en una solución patrón recién preparada de I 2 con pipeta vaciada en nitrógeno y se valora el iodo residual con patrón de tiosulfato en presencia de un indicador de almidón. El oxigeno absorbido se calcula restando el volumen de tiosulfato requerido para valorar la segunda muestra menos el volumen de la primera. El método es muy usado en la actualidad pero debe interpretarse con cuidado ya que lo que se mide es el volumen absorbido por una solución acuosa de sulfito y no por un medio de cultivo que contiene microorganismos y sus productos metabólicos, de todas maneras este fenómeno oxidativo puede ser comparado a la rapidez de absorción del oxigeno por los microorganismos. Podemos concluir entonces que la rapidez de la disolución del oxigeno expresado por la rapidez de la oxidación es igual a la rapidez de desaparición

4 4 del oxigeno por la respiración celular y es proporcional a la superficie de interfase entre el liquido y las burbujas de aire. TRANSFERENCIA DE O 2 ( OTR ) OTR = KLa ( C* - CL ) = QO 2 x C = rapidez de disolución de oxigeno C* = concentración del oxigeno en equilibrio con la atmósfera ( en la aireación es la conc. del oxigeno del aire ) CL = concentración real en el medio ( en método de sulfito = 0 ) KL = coeficiente de intercambio es decir la facilidad con que el oxigeno pasa desde el aire atmosférico al medio a = área de la interfase atmósfera medio por el método del sulfito podemos reducir la formula a Kla. C* como es imposible medir por separado estas superficies se valora en bloque Kla Ejemplo de aplicación: Sabemos que la demanda de oxigeno de E. coli es 5-8 mmoles / litro / hora, sino lo determinamos por Warburg. Tenemos un erlenmeyer agitado donde la vamos a cultivar y el Kla del mismo es 25 En el aire el valor C* es igual a 0,2 mmoles por litro ( 6,4 ppm ) Aplicando la formula: Kla. C* = 25. 0,2 = 5 Demanda QO 2 = 5 8 mmoles Observamos que estamos muy cerca del valor critico mínimo, determinado además por el método de sulfito de Cooper donde no se ponen en juego los parámetros de composición del medio, concentración celular etc. y que afectan la disponibilidad de oxigeno para los microorganismos, por lo tanto debemos lograr un mejor coeficiente de aireación, cosa que podemos hacer de varias maneras: Aumento de C*, es decir tratar de aumentar la presión parcial atmosférica, imposible, este parámetro no podemos modificarlo. Aumento a, es decir el área de intercambio, es lo mas corriente a utilizar y consiste en el aumento del burbujeo o la agitación del medio en el recipiente que contiene el medio.

5 5 Las burbujas pequeñas son mas eficaces porque aumentan el área de interfase gas liquido y se pueden obtener pasando el aire por un filtro poroso. El chorro de aire ingresa al biorreactor ( tanque agitado) por debajo del sistema agitador del mismo y al ser golpeado por por las paletas se transforma en miles de pequeñas burbujas de pequeño tamaño, si se coloca una placa sobre el sistema de burbujeo evitamos que estas escapen rápidamente en dirección a la superficie del medio lo que también se logra por la presencia de deflectores o pantallas laterales en el recipiente, que impiden la formación de vortice generando turbulencia en el liquido, de este modo logramos que las burbujas se mantengan temporalmente retenidas en el seno del liquido lo que también facilita la transferencia de O 2. Aumento de KL, facilidad con que el oxigeno pasa de la atmósfera al medio La formación de espuma dificulta con frecuencia la aireación en los cultivos con agitación, esta se forma principalmente en medios ricos en proteinas, el uso de antiespumantes, muy efectivos y generalmente inertes, evitan su formación. En estos caso debemos tener en cuenta que la espuma, si bien impide una buena aireación también genera el riesgo de rebalsamiento, con el consiguiente humedecimiento de los filtros de salida de aire del reactor, generando el riesgo de explosión del mismo. Los antiespumantes pueden también impedir la transferencia de O 2, al cubrir la superficie de los mismos, creando una nueva interfase: aire medio antiespumante microorganismo. En shakers la aireación puede verse dificultada por tapones de algodón demasiado apretados o mojados, en estos caso es preferible utilizar tapones de algodón envueltos en gasa. Para medir CL en medios de cultivo ya instalados en un biorreactor se usan electrodos que permiten la medición directa de la concentración de O 2 en cualquier momento del proceso. INHIBICIÓN POR AIREACIÓN EXCESIVA En determinadas circunstancias se inhibe el desarrollo microbiano por exceso de aireación, no están del todo aclaradas las causas, pero se cree que se debe a una deficiencia en CO 2 en el aire, inferior a la optima para dicho desarrollo. Se evita esto no aireando los cultivos hasta verlos turbios y en los medios salinos hasta 1 o 1,5 Hs. después de ser sembrados, cuando ya los microorganismos están en fase logarítmica de crecimiento. En medios salinos con latencia prolongada puede evitarse este efecto añadiendo SNa 2 al 0,01 %.

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