Alberto Martínez Serrano

Transcripción

1 Alberto Martínez Serrano Depto. Biología Molecular Facultad de Ciencias. Laboratorio CX-450. tel.: Concepto. Por qué medir oxígeno? Preparación mitocondrias Cadena respiratoria Uso distintos sustratos. Vresp Fosforilación oxidativa. Deasacopladores Compuesto problema 1

2 Presentación/Introducción: Bioenergética Cuantitativa entendida, frente a acto de fe, o frente a aplicar ecuaciones sin entenderlas. Recordatorio leyes termodinámica (y al sentido común) Energía libre, G (Gibbs) Potencial químico Cambios en G [ G] Compuestos con energía Potenciales redox (mención a transporte electrónico en mit) Potencial electroquímico (Ec. Nerst) Gradientes electro-químicos como fuerzas motrices de procesos bioquímicos Transporte 2

3 3

4 CÓMO SABER SI ÉSTO OCRURRE? Queriendo decir relativizar Y condiciones estándar Respecto al par de Hidrógeno Ojo, escala upside-down! valores pueden ser negativos porque la referencia es el par de Hidrógeno Recordatorio: energía útil! en sistemas bioquímicos. 4

5 OJO!!!! Son reductores de otros compuestos, O sea, tienen tendencia a ceder electrones REDUCCION ES GANAR ELECTRONES CUANDO LOS CEDEN, SE OXIDAN, Y REDUCEN A OTROS COMPUESTOS 5

6 6

7 7

8 Tipos de transporte: Activo=CONTRA GRADIENTE (QUÍMICO, ELECTRICO, AMBOS) (siempre gastando energía (ej. ATP), o usando energía de reacción o proceso acoplado/a) [pasivo, por el contrario significa a favor, sin gastar energía] PROTEINAS QUE INTERVIENEN BOMBAS IÓNICAS [Na-K ATPasa] ELECTRICIDAD Electroneutro Electrogénico UNIPORTADORES [glucosa, Ca2+] CO-TRANSPORTADORES: SIMPORTADORES [Na+glucosa] ANTIPORTADORES [Na-Ca, Na-H] BOMBAS IÓNICAS [H + ATPasa] Sin sustratos Con sustratos Compuesto rico en energía H+ H+ H+ H+ Con ATP ATP ADP+Pi Gastando ATP H+ H+ Generando ATP Con sustratos Sin ATP ADP+Pi ATP H+ H+ 8

9 UNIPORTADORES. P. ej., funcionando a favor potencial membrana Uniportador de calcio mitocondrial Mitocondria energizada Ejemplo: Sobrecarga de Calcio en una neurona tras un potencial de acción Compuesto rico en energía _ + Ψ, ph H+ H+ Ca 2+ Mm Ca 2+ nm microm 10E-3 10E-9 10E-6 Preparación Mitocondrias (hígado rata Wistar adulta) 9

10 REGISTRO: Plotter o PC MONITOR DE OXIGENO Polariza Amplifica Calibrar Interpreta (mv -%O2) Manda señal a registrador 10

11 0 v v Electrodo de plata (ánodo) Electrodo de platino (cátodo) El electrodo de oxígeno de Clark consiste en un cátodo de platino y un ánodo de Ag-AgCl inmersos en una solución saturada de KCl y separados de la solución problema por una membrana de teflón permeable al oxígeno pero impermeable a los demás constituyentes de la solución externa.. Las reacciones que tienen lugar son las siguientes: En el ánodo: 4Ag 4Ag + + 4e - En el cátodo + 4H + + 4e - 2H 2 O KCl saturado CUANTO MÁS OXIGENO HAY FUERA, MÁS ATRAVIESA LA MEMBRANA, Y MÁS CORRIENTE PASA ENTE ELECTRO Ag y Pt saturado 100% No tiempo anoxia CUANTO MÁS OXIGENO HAY FUERA, MÁS ATRAVIESA LA MEMBRANA, Y MÁS CORRIENTE PASA ENTE ELECTRO Ag y Pt 11

12 no Electrodo de plata (ánodo) no no no Electrodo de platino (cátodo) H 2 O no pasa no no OJO!: Se consume algo de oxígeno. Si se para la agitación = artefacto KCl saturado no Electrodo de plata (ánodo) no no Electrodo de platino (cátodo) H 2 O no pasa no no no OJO!: Se consume algo de oxígeno. KCl saturado Es necesario agitar la muestra 12

13 En los libros, se comenta algo que se define como potencial de transferencia del grupo fosfato (QUE NO ES EXCLUSIVO DE FOSFATOS. El acoplamiento se produce entre casi cualquier pareja de reaciones, usando la energía que se libera al romper un enlace para generar otro en otra molécula) Que no es más que el G de la hidrólisis de un grupo fosfato. P. ej. ATP ADP + Pi Y el acoplamiento reacciones (acabamos de verlo) P.ej. Fosfoenolpiruvato Piruvato (desprende energía) ADP ATP (necesita energía) G? Tema 21: Fosforilación oxidativa Teoría quimiosmótica. IDEALIZACIÓN: LA MITOCONDRIA SIEMPRE QUIERE TENER UN BUEN µ H+. PERO LA MITOCONDRIA NO PIENSA, ES PURA TERMODINÁMICA BIEN SUSTRATOS (equivalentes de reducción) O BIEN ATP ALMACENAN ENERGÍA, QUE ES USADA FACILMENTE PARA HACER ALGO: CONSTRUIR UN GRADIENTE ELECTROQUÍMICO DE H +. (Ésto ocurre espontáneamente, a favor de gastar energía, y siempre tiende a ocurrir) OJO, aún no hemos estudiado bombeo de protones CUANDO SE TIENE GRADIENTE ELECTROQUÍMICO DE H+, SIMPLEMENTE SE USA: PARA SINTESIS ATP, OTROS PROCESOS DE TRANSPORTE, ETC. CUANDO NO SE TIENE, O SE HA GASTADO, SE CREA A PARTIR DE SUSTRATOS O ATP EL BOMBEO DE PROTONES HACIA EL EXTERIOR MITOCONDRIAL TIENE UN LÍMITE (cuando hay mucho µ H+, cada vez cuesta más seguir expulsando protones, hasta que las bombas (cte - ) no lo pueden hacer. Entonces La cte - se para, y se deja de consumir equivalentes de reducción). 13

14 Tema 21: Fosforilación oxidativa Teoría quimiosmótica. [quimio-eléctrico-homeostática][concepto homeostasis] Sin sustratos Con sustratos Compuesto rico en energía H+ H+ H+ H+ Con ATP ATP ADP+Pi Gastando ATP H+ H+ Generando ATP Con µ H+ Sin ATP ADP+Pi ATP H+ H+ Tema 21: Fosforilación oxidativa Teoría quimiosmótica. GENERACION Y DISIPACION µ H+ SE GENERA bombeando protones al exterior, usando energía procedente de eq. de reducción o de ATP SE GASTA sintetizando ATP, o en procesos de transporte, o bien pasivamente. Ψ ph Fuera Dentro + - H + H + Ca 2+, gasta potencial de membrana (electrogénico) Sustratos con carga negativa, entrando con un protón (electroneutro, pero gasta gradiente químico) Intercambio Na-H (sacar Na gastando gradiente químico Recordad que µ H+ combina Ψ y ph 14

15 Tema 21: Fosforilación oxidativa Teoría quimiosmótica. Entran muchos protones por ATPasa µ H+ Mit cargada ADP Sustrato agotado Se transporta algo En el mundo ideal, o experimento laboratorio. Sustrato repuesto Sustratos Sin sustratos En el mundo real. Max Min Fluctuaciones cerca del máximo (nunca ocurre que no hay sustrato, o nunca que no hay ATP y sólo hay ADP, o nunca que dejan de transportarse compuestos HOMEOSTASIS DE µh+ Y SU USO Demostraciones experimentales de la Teoría Quimiosmótica: -El µ H+ combina Ψ y ph, y ambos se pueden medir µ H+ = Ψ 2.3RT/F ph Ψ es ~ 0.14 volts (positivo) ph es de ~ 1.4 unidades de ph (negativo) H+ H+ - + Entonces, µ H+ es de ~ 0,224 volts (positivo) (positivo quiere decir que la fuerza protón-motriz es en el sentido de forzar o impulsar la re-entrada de protones) La síntesis de ATP requiere de una membrana interna intacta. p. ej., tratamiento con detergentes resulta en no síntesis ATP. La síntesis de ATP requiere de µ H+ p. ej., tratamiento con protonóforos (que lo disipan), resulta en no síntesis ATP. POR TANTO PARECE OBVIO QUE HA DE HABER UN ACOPLAMIENTO ENTRE GRADIENTE ELECTROQUÍMICO DE PROTONES Y SÍNTESIS DE ATP (pero distinto de fosforilación de ADP a nivel de sustrato ) 15

16 Tema 21: -Complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. -Fosforilación oxidativa. -Balance energético del transporte electrónico. -Lanzaderas. Estequiometría: 2 electrones N protones N ATPs generados Energía en todo ello? Componentes cte- y flujo electrones Síntesis ATP Bombeo protones Tema 21: Fosforilación oxidativa. Medida de la razón P/O midiendo consumo oxígeno NADH Moles ATP generado por mol de sustrato oxidado u oxígeno reducido, para un sustrato. P/O ideal, 3 Experimental 2.5 Todo el ADP fosforilado a ATP 16

17 Tema 21: Fosforilación oxidativa. Qué es la razón P/O? Moles ATP generado por mol de sustrato oxidado u oxígeno reducido, para un sustrato. Es propia de cada sustrato porque distintos sustratos tienen distinta energía, entran en distintos sitios de la cte-, y por tanto resultan en el bombeo de más o menos H+ P/O teóricas, las experimentales están ligeramente por debajo ATPasa requiere 3H+, entonces NADH podría resultar en más de 3ATP y succinato en 2ATP Pero la realidad es: NADH, 2e-, 10H+, 2.5 ATP Succinato, 2e-, 6 H+, 1.5 ATP Porqué se necesitan más de 3 H+ para la síntesis de 1ATP? Para sintetizar 1ATP se necesita: Entrada de 3H+ por la ATPasa Entrada de Pi (gasta ph). Entrada de ADP (gasta Ψ) NADH + H+ + 1/2O2 + 3ADP + 3Pi NAD+ + 4H20 + 3ATP Aunque haya saltos de e- con Go mayores de -31 KJul/mol, no se genera ATP a nivel de sustrato. Go = -220 KJul/mol Cada ATP supondría +31 KJul/mol, Sólo el 42% de la energía se usa para generar ATP Y el resto, para qué se usa? 17

18 Tema 21: -Complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. -Fosforilación oxidativa. -Balance energético del transporte electrónico. -Lanzaderas. Estequiometría: 2 electrones N protones N ATPs generados Energía en todo ello? Componentes cte- y flujo electrones Síntesis ATP Bombeo protones Tema 21: Fosforilación oxidativa. Fosforilación oxidativa. Estructura H+-ATPasa α β 3H+ β α F1 desde arriba α β Cristalización F : se comprobó que dímeros alfa-beta podían estar en tres estados: Vacíos, con ADP, o con un análogo de ATP.. Loose, tight, open Laxa, fuerte, abierta In Out 3H+ Se propone un mecanismo rotatorio de γ y ε en F1 junto con c en F0 La rotación de gamma (por la energía de 3H+) induce cambios conformación en dímeros alfa-beta, que consigue que se lleve a cabo la síntesis o rotura de enlaces, y que se unan o se liberen los sustratos o productos 18

19 F1(cabeza): 3α+ 3β+ 1γ+ 1ε +1δ F0 (pié): 12(10-14)c + a + 2b Bacterias cloroplastos ATP se sintetiza en subunidades beta de F1 La entrada de 3H+ vía a, promueve la rotación del anillo c, que arrastra a γ y cambia la conformación alfa-beta para que tenga lugar la síntesis de ATP PNAS, Published Feb 1,

20 Tema 21: -Complejos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. -Fosforilación oxidativa. -Balance energético del transporte electrónico. -Lanzaderas. Estequiometría: 2 electrones N protones N ATPs generados Energía en todo ello? Componentes cte- y flujo electrones Síntesis ATP Bombeo protones 20