Fisiología Bacteriana. Tarea de aula I

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1 Fisiología Bacteriana Tarea de aula I

2 Técnicas Básicas de Laboratorio de Microbiología Objetivo en Microbiología: Caracterización de un microorganismo Procesos de desinfección y esterilización. Manejo de técnicas asépticas. Aislamiento de microorganismos. Nutrición Técnicas de coloración

3 Desinfección y esterilización

4 Esterilización Eliminación total de cualquier forma viviente en un medio o material de trabajo con un agente físico o químico. El material permanece estéril si se encuentra en un compartimento aislado, libre del contacto con microorganismos del ambiente exterior. Agentes físicos Temperatura Desecación Radiaciones Ondas sonoras Presión hidrostática Presión osmótica Agentes químicos Desinfectantes y antisépticos Quimioterápicos de síntesis Antibióticos Disponibilidad de Equipo Tipo de material a esterilizar

5 Por Calor. Húmedo Autoclave. Seco Horno Por Radiación. Ionizantes: (Mat. farmacéutico, quirúrgico). No ionizantes (UV) (Zonas aéreas, sup. de trabajo) Equipos para Esterilización Por Filtración. Filtros de distinto material y tamaño de poro (membranas de 0.45 y 0.22 μm). (Líquidos termosensibles, gases) Por Compuestos químicos. Gaseosa Oxido de etileno, Formaldehido o H2O2 (Material plástico o sensible al calor). Detergentes, comp. fenólicos, alcoholes, ácidos y bases, Me pesados, agentes oxidantes, colorantes, agentes alquilantes: Desinfectantes y antisépticos. A- Filtro de celulosa de 0.22 micras de diámetro de poro. B- Depósito para la muestra o medio. C- Depósito para la muestra o medio filtrado. D- Sistema de vacío.

6 La destrucción de microorganismos por acción del calor sigue una cinética de primer orden N: nº de microorganismos vivos en cada momento k d : constante cinética de muerte térmica a temperatura T. (k d depende fuertemente de la temperatura T) La cinética de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos. La muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura esencial. (ADN cromosómico o daño irreparable en la membrana). ln N ln N0 kd t

7 Gráficos de supervivencia Ln N/N 0 Gráfico de supervivencia a temperatura constante ln N ln N0 kd t Ej. Sobrevida de esporas a 2 valores de T Ln N/N 0 Gráfico de supervivencia para 3 valores de T

8 Correlación de k d con la Temp Arrhenius kd A e E ª RT ln( kd) ln( A) Eª R 1 T Kd, constante cinética dependiente de T. A, constante que depende del medio. Eª, energía de activación, E necesaria para que se de el proceso. R, constante general de los gases. T, temperatura absoluta. ln(kd) ln(a) -Eª/R 1/T Ej.

9 Condiciones de inactivación total por calor húmedo: - Tiempo térmico mortal - Tiempo de reducción decimal - Punto térmico mortal Microorganismo La mayoría de células vegetativas, de bacterias, levaduras y hongos Bacilo tuberculoso Bacilo tuberculoso Bacilo tuberculoso Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis La mayoría de esporas de bacterias patógenas Esporas del patógeno Clostridium botulinum Esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos Esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos Condiciones 80 o C, 5-10 min 58 o C, 30 min 59 o C, 20 min 65 o C, 2 min 60 o C, 60 min 100 o C, pocos min 100 o C, 5,5 horas 100 o C, muchas horas 120 o C, 15 minutos

10 Causas de la Esterilización - Desnaturalización de proteínas - Fusión de lípidos de membrana - Ruptura de enlaces débiles (ptes. H entre grupos C=O y H 2 -N) Ocurre más fácilmente por calor húmedo (en atmósfera saturada de vapor de agua), debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los ptes. H. Calor húmedo: La inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que la inactivación que se realiza en ausencia de agua.

11 Calor húmedo Protocolo de esterilización en Autoclave Temperatura: C Presión: 1 atmósfera sobre la atmosférica Tiempo: min Recomendaciones El tiempo depende de la cantidad y tamaño de los materiales a esterilizar. No colocar recipientes completamente cerrados en la autoclave. El vapor debe entrar en contacto con todo lo que se quiere esterilizar. No esterilizar solventes o químicos corrosivos. Si se esterilizan líquidos, bajar la presión lentamente y dejar enfriar los recipientes dentro de la autoclave.

12 Calor seco Protocolo de esterilización en Horno Temperatura: C Tiempo: 2-3 hs

13 Control de la temperatura y el tiempo del tratamiento térmico: - Inactivación parcial Pasteurización (alimentos) de la población microbiana - Inactivación total Esterilización

14 Autoclave: Permite calentar muestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición del agua (sin que ésta hierva). El tratamiento se efectúa en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosférica. Parámetros de esterilización: temperatura 121 C y min. Diagrama del Autoclave Válvula de Seguridad Tapa Calderin Control de esterilización: esporas de especies saprofitas, que son las formas de vida que más resisten el calor sin perder viabilidad. Bandeja Resistencia Válvula de Drenaje

15 Agentes Químicos Agentes Esterilizantes Agentes Desinfectantes (químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un material. Efectos tóxicos sobre tejidos vivos (sólo sobre materiales inertes) Agentes Antisépticos Sust químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales vivos. Baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican. Quimioterápicos o quimioterapéuticos Efecto de Desinfectantes y Antisépticos: Concentración del agente Tiempo de exposición ph Naturaleza del microorganismo Presencia de materiales extraños

16 Efecto de los Agentes Agentes que Dañan la Membrana Detergentes Compuestos Fenólicos Alcoholes Agentes Desnaturalizantes de Proteínas Ácidos y Bases Fuertes Ácidos Orgánicos Agentes Modificadores de Grupos Funcionales Metales Pesados Agentes Oxidantes Colorantes Agentes Alquilantes

17 Técnicas asépticas

18 Manipulación del material en condiciones de esterilidad

19 Manipulación del material en condiciones de esterilidad

20 Manipulación del material en condiciones de esterilidad

21 Preparación de medios de cultivo en placa - Volcar el medio en condiciones de asepsia (20-30 ml/placa) y esperar a que solidifique (ver figura). Luego secar las placas invertidas en estufa a 42ºC. Llenado del medio Mesada Tapa Rotulo Medio de cultivo

22 INOCULACIÓN

23 Inoculación de un medio de cultivo semisólido por picadura con hilo de siembra

24 Diluciones seriadas y recuento de bacterias (UFC) Extensión en superficie con espátula de Drigalsky

25 Esterilización de la espátula de Drigalsky Dejar enfriar al lado de mechero y Extender sobre la superficie la siembra Etanol

26 Depósito y posterior quemado Técnica de aislamiento de colonias

27 Incubación en función del requerimiento de oxígeno.

28 Trabajo Práctico N 1: Técnicas básicas de Microbiología. Esterilización de materiales. Manejo de técnicas asépticas. Preparación de medios de cultivo y acondicionamiento para esterilizar en autoclave - Medios de cultivo: - Agar nutritivo, - Caldo nutritivo, - Agar MacConkey, - SIM, etc. - Soluciones, tubos de ensayo, frascos, etc. Manejo del material en condiciones de esterilidad - Entrenamiento en el manejo de técnicas asépticas (manipulación de pipetas y micropipetas, trasvasado de materiales líquidos, inoculación, etc.) - Preparación de medios sólidos y semisólidos en tubos. - Preparación de medios sólidos en placas de Petri.

29 Trabajo Práctico N 1: Técnicas básicas de Microbiología. Esterilización de materiales. Manejo de técnicas asépticas. Siembra y aislamiento de distintas muestras bacterianas - Siembra y aislamiento en placas, siembra en tubos pico de flauta. - Siembra por punción en medio semisólido. Acción de antisépticos y desinfectantes -Tomar muestras con hisopos estériles antes y después de aplicar un antiséptico o desinfectante a una superficie o parte del cuerpo. - Sembrar en placas de agar nutritivo e incubar a 37ºC Acción antimicrobiana de la radiación UV - Siembra en estría de diferentes bacterias. - Exposición a luz UV por diferentes tiempos. Armado de la columna de Winogradsky

30 Traer los siguientes materiales para los prácticos. Por comisión: Agua oxigenada (10 vol) Alcohol 96º, cuatro botellas Rollos de papel absorbente de cocina 4 paquetes Hisopos (vástago largo de madera) un paquete Papel borrador o de diario Bolsitas chicas para descarte Dos latas grandes de conservas vacías con tapa de metal 2 botellas de plástico transparente de litros iguales Barro y agua estancada. 1 kg de barro y 2 litros de agua Por persona: Marcador indeleble Encendedor Guardapolvo Cinta de papel

31 CONDICIONES DE REGULARIDAD DE LA MATERIA 1) Aprobación del parcial teórico/prácticos. 2) Aprobación de los trabajos prácticos: a. 80% de asistencia. b. 80% de parcialitos aprobados. Se tomará uno por cada trabajo práctico y al comienzo del mismo. c. Evaluación favorable de los informes que deberán realizar y entregar al finalizar cada trabajo práctico.

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