ANTICUERPOS CONTRA PÉPTIDOS CITRULINADOS EN LA ARTRITIS REUMATOIDE DE CORTA EVOLUCIÓN: SIGNIFICACIÓN DIAGNÓSTICA Y PRONÓSTICA

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1 ANTICUERPOS CONTRA PÉPTIDOS CITRULINADOS EN LA ARTRITIS REUMATOIDE DE CORTA EVOLUCIÓN: SIGNIFICACIÓN DIAGNÓSTICA Y PRONÓSTICA Investigadores principales: Dr. Raimon Sanmartí Sala Hospital Clínic i Provincial de Barcelona Dra. Isabel Haro Villar Institut d'investigacions Químiques i Ambientals de Barcelona Dr. Alejandro Balsa Criado Sociedad Española de Reumatología. Madrid Duración: 3 años MEMORIA FINAL 1. Resumen Éste es un proyecto multicéntrico y coordinado que tiene como objetivo principal desarrollar un método de enzima-inmunoensayo empleando péptidos sintéticos citrulinados derivados de dominios de fibrina humana, que pueda ser utilizado como test diagnóstico para la artritis reumatoide (AR) y así estudiar su valor pronóstico. El presente proyecto consta de los siguientes subproyectos: 1

2 Subproyecto 1 (Dra. Isabel Haro). Proyecto básico en el que se pretende sintetizar químicamente péptidos derivados de dominios de las cadenas alfa y beta de la fibrina, en que el aminoácido arginina es sustituido por el aminoácido citrulina. Estos péptidos citrulinados servirán como sustrato antigénico para detectar a través de técnicas de enzima-inmunoanálisis (ELISA) anticuerpos presentes en el suero de pacientes con artritis reumatoide. Los ELISA que emplean estos péptidos citrulinados derivados de fibrina (ampliamente presente en la membrana sinovial de pacientes con AR) pueden ser más sensibles que los empleados hasta el momento presente (derivados de filagrina y otras proteínas) y pueden tener mayor capacidad pronóstica. En este proyecto se han seleccionado secuencias peptídicas a partir de la estructura primaria de la fibrina, mediante algoritmos clásicos de predicción de antigenicidad y/o epitope mapping de las proteínas y posteriormente se han obtenido químicamente determinados análogos citrulinados (siguiendo metodologías de síntesis de péptidos en fase sólida) en forma lineal, cíclica y/o ramificada. Posteriormente, se han desarrollado diferentes ELISA para la detección de autoanticuerpos en el suero, utilizando los péptidos citrulinados obtenidos. Ha sido evaluada la unión covalente y la adsorción directa, previa derivación hidrófoba, de las secuencias peptídicas en las placas de microtitulación. Por último, se ha estudiado la sensibilidad y especificidad de estos ELISA para el diagnóstico de AR y se han comparado los resultados con los ELISA comerciales de primera y segunda generación que usan péptidos citrulinados cíclicos derivados de la estructura de la filagrina humana (anti-ccp1) y otras secuencias peptídicas (anti-ccp2). Subproyecto 2 (Dr. Raimon Sanmartí). En este proyecto se ha estudiado el valor pronóstico de los nuevos ELISA desarrollados en el primer subproyecto que utilizan péptidos sintéticos citrulinados derivados de fibrina humana, en pacientes con AR de corta evolución. 2

3 Se ha estudiado una cohorte de pacientes con AR de menos de dos años de evolución, que han sido seguidos de forma protocolizada a lo largo de dos años de seguimiento. Como medida de mal pronóstico se ha considerado el grado de destrucción articular (evaluado por radiografía) al final del seguimiento. Se han estudiado los factores (clínicos, genéticos y de laboratorio) que se asocian a una mayor destrucción articular, incluyendo los valores de anticuerpos contra péptidos citrulinados de fibrina humana. Se han estudiado otras asociaciones de estos anticuerpos y se ha comparado su valor pronóstico con los anti-ccp2. Subproyecto 3 (Dr. Alejandro Balsa). Se trata de un proyecto multicéntrico de la Sociedad Española de Reumatología en el que participan 34 centros de toda la geografía española y que analiza los factores asociados al desarrollo de AR en una cohorte prospectiva de pacientes con artritis de reciente inicio y que ha sido seguida durante 5 años. Se ha determinado el papel de los anticuerpos contra péptidos citrulinados (CCP2 y contra fibrina humana) en el futuro diagnóstico de artritis reumatoide. 2. Resultados Subproyecto 1. Se ha comprobado que los péptidos citrulinados sintéticos relacionados con la fibrina son reconocidos por el suero de pacientes con AR. Han sido sintetizados satisfactoriamente diferentes regiones citrulinadas de las cadenas alfa y beta de la fibrina. Determinadas regiones de estas cadenas alfa (péptidos p18, p19, p22) y beta (péptido p38) han mostrado niveles muy altos de sensibilidad para la detección de los autoanticuerpos presentes en el suero de pacientes con AR. Posteriormente, se comprobó que la capacidad antigénica de los péptidos lineales mejoraba por la 3

4 ciclación de las secuencias. Finalmente, se demostró que la combinación en la misma molécula de péptidos derivados de la filagrina (péptido cíclico cfc1cyc) y de la cadena alfa de la fibrina péptidos quiméricos fibrina/filagrina (fb/f) incrementaba la sensibilidad de los ELISA y permitía identificar anticuerpos en el suero de pacientes con AR que no se detectaban a través de los tests de ELISA comerciales (CCP1, CCP2). Al analizar el balance sensibilidad/especificidad de los nuevos tests de ELISA utilizando los péptidos quiméricos fb/f, en diferentes poblaciones (AR, donantes de sangre y otras patologías reumáticas) se ha demostrado la alta sensibilidad de estos ELISA para la detección de autoanticuerpos en pacientes de AR (72-78%). En el estudio de especificidad de los diferentes autoanticuerpos en otras patologías donde se observan fenómenos autoinmunitarios (Lupus eritematoso sistémico, hepatitis crónica por virus C) o que presentan un cuadro clínico similar a AR (artritis psoriásica), se ha comprobado que los anticuerpos antiquiméricos fb/f son muy específicos, de forma similar a los anti-ccp2 comerciales. Dicha especificidad es del 97-98%, a excepción de los LES, donde la misma es algo más baja (91-92%), a consecuencia de la presencia de algunos falsos positivos. Subproyecto 2. Se ha analizado en un grupo de 188 pacientes con AR de reciente inicio y seguidos durante 2 años, el valor pronóstico de los anticuerpos contra péptidos sintéticos citrulinados quiméricos fibrina/filagrina p18, p19 y p22. Un 82% de los pacientes tenía anticuerpos contra alguno de los péptidos quiméricos citrulinados (frente a un 74% con el test comercial CCP2). La presencia de estos autoanticuerpos en el momento de la inclusión (valores basales) se asociaba a una mayor destrucción articular, en especial los dirigidos contra el quimérico fb/f p18, de forma incluso superior al test comercial CCP2. Se ha demostrado una muy buena correlación entre los resultados de los tres ELISA que utilizan péptidos quiméricos y el 4

5 test comercial CCP2, a pesar de existir discrepancias en un número importante de pacientes (alrededor del 14%). Sin embargo se ha observado una asociación entre la presencia de estos autoanticuerpos, en especial el quimérico fb/f p18 y determinado genotipo HLA (HLA-DRB04). Subproyecto 3. Se ha analizado en una cohorte de 171 pacientes con artritis de inicio con seguimiento durante un promedio de 3,6 años, el valor discriminante de los anti-ccp2 y los anticuerpos quiméricos fibrina/filagrina, para el posterior desarrollo de AR. La gran mayoría de los pacientes (94%) fueron diagnosticados de AR durante el seguimiento. Tanto el anti-ccp2 como los antiquiméricos fb/f p18 (en fase de análisis definitivo) se han asociado al posterior desarrollo de AR en esta población. 3. Relevancia e implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Los anticuerpos contra péptidos citrulinados son los marcadores serológicos más específicos de AR. Los resultados finales obtenidos en el transcurso del presente proyecto de investigación han permitido definir péptidos quiméricos que contienen dominios de dos proteínas distintas (filagrina y fibrina) y que son reconocidos por autoanticuerpos presentes en el suero de pacientes con AR con un muy buen balance especificidad/sensibilidad. Podemos concluir que los péptidos citrulinados sintéticos muestran un claro interés en el desarrollo de nuevos tests mejorados para el diagnóstico de AR. Cobra mayor fuerza la idea de que epítopos de las cadenas alfa y beta de la fibrina humana, presentes en la sinovial reumatoide podrían constituir los principales antígenos que desencadenan la respuesta inmunológica a la AR, con sus implicaciones 5

6 etiopatogénicas. En consecuencia, se prevé una notable implicación clínica de los péptidos quiméricos fibrina-filagrina, ya que éstos mejoran la sensibilidad de detección de los autoanticuerpos presentes en pacientes de AR. En el análisis de sensibilidad/especifidad de estos autoanticuerpos, se ha demostrado que poseen una alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de AR. Utilizando una población de 322 pacientes con AR y 307 controles (Banco de Sangre) y manteniendo una especificidad del 98%, la sensibilidad de los tres anticuerpos antiquiméricos fibrina/filagrina (fb/f) (p18, p19 y p22) es del 72-78%, no inferior a la observada con los anti-ccp2 comerciales (74%). De forma interesante, y aunque la correlación entre los diferentes autoanticuerpos es muy estrecha, existe un porcentaje notable de discrepancias entre ellos (alrededor del 14%), lo que manifiesta que la determinación de más de un anticuerpo puede incrementar la sensibilidad (hasta un 81%) sin prácticamente perder especificidad (96-97%). En el estudio de especificidad de los diferentes autoanticuerpos en otras patologías donde se observan fenómenos autoinmunitarios (Lupus eritematoso sistémico, hepatitis crónica por virus C) o que tienen un cuadro clínico similar a AR (artritis psoriásica), se ha comprobado que los anticuerpos antiquiméricos fb/f son muy específicos, de forma similar a los anti-ccp2 comerciales. Esta especificidad es del 97-98%, a excepción de LES, donde es algo más baja (91-92%) a consecuencia de la presencia de algunos falsos positivos. Al analizarse el valor pronóstico de estos autoanticuerpos, se ha podido demostrar que en una cohorte de pacientes con AR de corta evolución, su presencia se ha asociado a un mayor grado de destrucción articular. Los pacientes con estos autoanticuerpos (en especial con el anticuerpo antiquimérico fb/f p18) presentan un mayor grado de progresión radiológica de la enfermedad después de 6

7 dos años de seguimiento, identificando a aquellos pacientes con una enfermedad más grave. En conclusión, estos anticuerpos antiquiméricos fibrina/filagrina poseen una alta sensibilidad para el diagnóstico de AR y pueden estar presentes en pacientes en que el anti-ccp2 (test comercial, utilizado en la práctica clínica) no la ha conseguido identificar. Por dicho motivo, la identificación conjunta de estos autoanticuerpos antiquiméricos (en especial fb/f p18) incrementa la sensibilidad diagnóstica para la artritis reumatoide, además de aportar información adicional sobre el pronóstico. Los nuevos tests de ELISA que utilizan péptidos citrulinados sintéticos donde se incluyen dominios de fibrina humana pueden constituir una de las pruebas con un mejor balance sensibilidad/especificidad para el diagnóstico de AR y ser muy útiles para determinar su pronóstico. 4. Publicaciones M.L. Pérez, M.J. Gómara, D. Kasi, A. Alonso, O. Viñas, G. Ercilla, R. Sanmartí and I. Haro Synthesis of overlapping fibrin citrullinated peptides and its use for diagnosing rheumatoid arthritis Chem. Biol. Drug Des. 68, (2006) M.L. Pérez, M.J. Gómara, G. Ercilla, R. Sanmartí, I. Haro Antibodies to citrullinated human fibrinogen synthetic peptides in diagnosing rheumatoid arthritis. J. Med. Chem. 50, (2007) 7

8 Vázquez I, Graell E, Gratacós J, Cañete J.D, Viñas O, Ercilla M.G, Gómez A, Hernández M.V, Rodríguez-Cros J.R, Larrosa M. and Sanmartí R. Prognostic markers of clinical remission in early rheumatoid arthritis after two years of Dmards in a clinical setting. Clin Exp Rheumatol 2007; 25: Sanmartí R, *Gómez-Centeno A, **Ercilla G, *Larrosa M, **Viñas O, Vazquez I, Gómez-Puerta J-A, *Gratacós J, Salvador G and Cañete JD. Prognostic factors of radiographic progression in early rheumatoid arthritis. a two year prospective study after a structured therapeutic strategy using dmards and very low doses of glucocorticoids. Clinical Rheumatol 2007; 26: Patentes I. Haro, M.J. Gómara, M.L. Pérez, R. Sanmartí Polipéptido quimérico fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide Nº Solicitud: P Entidad titular: CSIC-Fundació Clínic País: España Año: presentada solicitud

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