Laboratorio de Introducción a la Microbiología. Practico N 1

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1 Laboratorio de Introducción a la Microbiología Practico N 1 PREPARACIÓN PARA LA OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS POR MICROSCOPIA Los microorganismos son demasiado pequeños para ser observados a simple vista, por lo que es necesario utilizar un microscopio. Los modernos microscopios proporcionan, con una gran claridad, aumentos de decenas a cientos de veces superiores a los obtenidos con las lentes sencillas de van Leeuwenhoek. Figura 1: Microscopio óptico

2 Resumen de las características de distintos microscopios. Tipos de microscopio Características especiales Usos principales Campo claro Campo oscuro Utiliza luz visible como fuente de iluminación; no puede resolver estructuras de menos de 0,2 m; la muestra aparece sobre fondo brillante. Utiliza un condensador especial con un disco opaco que impide la entrada directa de la luz en el objetivo; entra la luz difractada por la muestra, la cual aparece brillante sobre fondo oscura. Comúnmente usado para observar especimenes teñidos (muertos) diversos; no resuelve muestras muy pequeñas, como los virus. El instrumento es económico y fácil de usar. Comúnmente usado para examinar microorganismos vivos que sean invisibles al microscopio de campo claro, que sean difíciles de teñir o que se alteren por la tinción; usado a menudo para detectar Treponema pallidum. Contraste de fases Usa un condensador especial y una placa de difracción que difracta los rayos de luz para que se desfacen unos con respecto a otros; la muestra aparece con diferentes grados de brillo y contraste. Se usa frecuentemente para permitir un examen detallado de las estructuras internas de los especímenes vivos; no se requiere tinción. Fluorescencia Utiliza una fuente de luz ultravioleta o cercana a la ultravioleta que provoca la emisión de luz por parte de compuestos fluorescentes presentes en la muestra. Su uso fundamental es en técnicas de inmunofluorescencia para detectar o identificar con rapidez microorganismos en muestras clínicas. Electrónico Usa haces de electrones en vez de luz gracias a la longitud de onda más corta de los electrones puede resolver estructuras menores de 0,2 m. Se usa el microscopio electrónico de transmisión para examinar virus o ultraestructuras celulares en cortes delgados, la imagen no es tridimensional. El microscopio electrónico de barrido se usa para estudiar la superficie de células y virus, la imagen que se forma e tridimensional.

3 Para poder observar los microorganismos directamente, el microbiólogo debe utilizar un instrumento de precisión, el microscopio. Si lo que interesa observar es la motilidad o reactividad frente a sustancias químicas es conveniente examinar las bacterias sin teñir; por otra parte si se quiere visualizar estructuras celulares específicas es necesario tratar las células con colorantes, proceso denominado TINCIÓN. Examen de microorganismos sin tinción: 1.- Preparación húmeda: es la forma más simple de examinar las bacterias y otros microorganismos vivos, y consiste en la suspensión de un inóculo de cultivo en agua u otro líquido, colocando una gota de ésta suspensión en un portaobjeto común y cubrirlo con un cubreobjeto. Este procedimiento requiere utilizar microscopía de contraste de fase. 2.- Preparación de la gota pendiente: ésta técnica requiere de un portaobjeto con una concavidad o depresión circular en su centro (portaobjeto excavado) - Colocar un anillo delgado de vaselina alrededor de la depresión central. - Depositar una gota de solución fisiológica en el centro del cubreobjeto y emulsionar en ella el material a examinar si proviene de un cultivo sólido o utilizar una gota de cultivo si es líquido. - Invierta el portaobjeto de manera tal que la excavación central quede encima de la gota del cubreobjeto. - Presione el portaobjeto y luego inviértalo con un movimiento rápido. La gota que contiene el material quedará pendiendo sobre la excavación del portaobjeto como se muestra en la figura 2: Con el estudio de la gota pendiente, se puede conocer la motilidad de los microorganismos, sus agrupaciones naturales, sus reacciones en presencia de ciertas sustancias químicas. Figura 2: Técnica de la gota pendiente.

4 Examen de microorganismos teñidos: Colorantes: son compuestos químicos orgánicos, generalmente sales, en las que uno de sus iones es el portador del color. Según su comportamiento químico los colorantes pueden clasificarse en : ácidos, básicos y neutros. a).- b).- c).- Colorante Ácido o aniónico: la carga del ión que imparte el color es negativa. Ejemplo: fucsina ácida, eosina. Los colorantes ácidos no son atraídos por la mayoría de las bacterias porque los iones negativos del colorante son repelidos por la superficie bacteriana cargada negativamente. De modo que el colorante es repelido por la bacteria y colorea en cambio el fondo de la preparación. Esta preparación de bacterias incoloras sobre un fondo coloreado se llama tinción negativa. Es útil para la observación de la morfología externa de la célula, del tamaño y de la cápsula, porque las células resultan muy visibles al contrastar con el fondo oscuro. Colorante Básico o catiónico: el ión que imparte el color tiene carga positiva. Ejemplo: cristal violeta, azul de metileno, safranina. A ph 7.0 las bacterias tienen carga ligeramente negativa y por lo tanto el ión positivo coloreado de un colorante básico es atraído por la célula bacteriana. Colorante neutro: sal compuesta de un colorante ácido y otro básico. Ejemplo: eosinato de azul de metileno. El proceso de tinción supone una reacción de intercambio de iones, entre el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la célula. Para teñir una preparación se pone una pequeña cantidad del material a examinar en un portaobjeto limpio y sin grasa. Si el inóculo proviene de un medio sólido se emulsiona en una gota de solución fisiológica estéril o agua destilada. La muestra se extiende con el asa (esterilizada y enfriada) hasta que quede una fina película. Esta película se conoce como FROTIS. Una vez realizado el frotis, se procede a la FIJACIÓN. Éste es un procedimiento que mata las bacterias del frotis y hace que se adhieran al portaobjeto, ya que el calor desnaturaliza las proteínas. La fijación también se puede realizar sumergiendo el portaobjeto en alcohol metílico, éter o formalina; sin embargo es el calor el más indicado para el trabajo de rutina. La fijación por calor se logra pasando el portaobjeto varias veces por sobre la llama del mechero. Una vez realizado el frotis y la fijación, se procede a aplicar el o los colorantes según sea la tinción. En bacteriología se utilizan tres clases de tinciones: a) Tinción simple b) Tinción diferencial c) Tinciones especiales.

5 1.-Tinción simple: es aquella que hace uso de un sólo tipo de colorante y sirve para observar tamaño y forma celular. Las más comunes son la de azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta y safranina. -frotis y fijación de la muestra -colorante durante un minuto -lavar con agua para retirar exceso de colorante -dejar secar al aire -observar al microscópio de inmersión Tinciones diferenciales: permiten dividir a las bacterias en grupos, de acuerdo a su reacción con los colorantes utilizados. Entre ellos la tinción de Gram y la de alcohol-ácido resistente son las más usadas Tinción Gram: es la técnica de uso más común en microbiología y permite dividir las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas, de acuerdo a las propiedades físicas de la pared celular. -frotis y fijación de la muestra -cristal violeta durante un minuto -lavar con agua -mordiente: solución de yodo (lugol) durante un minuto -lavar con agua -agente decolorante: alcohol durante 30 seg. -lavar con agua -safranina por 30 seg. -lavar con agua y secar al aire -examinar al microscópio con objetivo de inmersión El mordiente tiene la función de aumentar la afinidad del colorante con las estructuras celulares. El agente decolorante tiene la función de retirar el colorante de la célula. Las bacterias sometidas a la tinción de Gram que retienen el colorante "cristal violeta" y aparecen de color violeta profundo se clasifican como bacterias Grampositivas. Aquellas que pierden el cristal violeta y se tiñen rojas por el colorante de contraste, se clasifican como bacterias Gram-negativas. Este resultado se fundamenta en el hecho de que las bacterias Gram(+), después del tratamiento con alcohol, se produce una deshidratación con la consiguiente disminución en el diámetro de los poros de péptidoglicano de la pared celular. Esto permite que el colorante cristal violeta quede retenido en el interior de la célula. Las paredes de las bacterias G(-) tienen una cantidad

6 mucho menor de péptidoglicano con ligaduras cruzadas menos extensas, lo que le da una consistencia mucho más laxa que permite la salida del complejo cristal violeta-yodo y la posterior tinción con safranina. (Cuadro I). Figura 3: Tinción de Gram CUADRO I: Reacción de las células Gram (+) y Gram (-), frente a la tinción de Gram. COLORANTE GRAM (+) GRAM (-) Cristal violeta azul azul Lugol azul azul Alcohol azul decolorada Safranina azul rojo El método de Gram es una de las técnicas de tinción más importantes en microbiología médica. No obstante, los resultados de la tinción de Gram no son absolutos porque algunas células bacterianas se tiñen mal o no lo hacen. La reacción de Gram es más reproducible cuando se aplica a bacterias jóvenes en crecimiento (cultivos de horas). En muchos casos la tinción de Gram de una bacteria proporciona una información útil para el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, las bacterias Gram positivas tienden a ser más sensibles a la penicilina y a las sulfamidas. Las bacterias Gram negativas suelen ser resistentes a estos fármacos pero son mucho más susceptibles a antibióticos como la estreptomicina, el cloramfenicol y las tetraciclinas. Por lo tanto, la identificación de una bacteria según la tinción de Gram puede ayudar a determinar que fármaco será más eficaz contra la enfermedad.

7 2.2 Tinción de ácido-alcohol resistencia Otra importante tinción diferencial (que divide a las bacterias en grupos diferenciados) es la tinción de ácido alcohol resistencia. Los microbiólogos utilizan esta tinción para identificar bacterias pertenecientes a los géneros Micobacterium y Nocardia. Aunque muchas bacterias de este grupo no son patógenas, hay dos miembros que son importantes productores de enfermedad, Micobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. La diferencia principal del Micobacterium y Nocardia con otros microorganismos es que estos dos géneros poseen ceras e sus paredes celulares. En la técnica de tinción de ácido alcohol resistencia se aplica sobre la tinción fijada el colorante rojo carbolfuchsina y el portaobjetos se calienta suavemente sobre la llama durante varios minutos. El calor facilita la penetración y retención del colorante. Se deja enfriar la preparación y se lava con agua. A continuación se trata con ácido y alcohol, un decolorante, que elimina el colorante rojo de las bacterias que no son ácido alcohol resistentes. Las bacterias ácido alcohol resistentes retienen el color rojo porque la corbolfuchsina es más soluble en las ceras que forman parte de su pared celular que en el ácido alcohol. En las bacterias no ácido alcohol resistentes, cuyas paredes carecen de ceras, la carbolfuchsina es rápidamente eliminada durante la decoloración, quedando sus células sin teñir. La extensión se tiñe entonces con azul de metileno como colorante de contraste. Las bacterias que no son ácido alcohol resistente aparecen azules tras la tinción de contraste. 3.- Tinciones Especiales: Sirven para observar estructuras dentro o en el exterior de la célula bacteriana, inclusiones citoplasmáticas como también algunos microorganismos que dadas sus características especiales no se tiñen adecuadamente con técnicas rutinarias. a. Esporas: Son muy impermeables a los colorantes, por lo que se hace necesario usar técnicas especiales. - Frotis y fijación de la muestra - Cubrir frotis con papel filtro - Teñir con Verde Malaquita a emisión de vapores por 10 a 15 min. - Enfriar y lavar con agua - Aplicar Safranina por 30 segs a 1 min. - Lavar con agua y secar al aire - observar al microscopio con objetivo de inmersión Las esporas aparecen de color verde y la célula vegetativa roja. La vaporización del colorante sobre la muestra incrementa la penetración de éste en los recubrimientos impermeables de la espora (Cuadro II).

8 CUADRO II: Reacción de las células frente a la tinción de Esporas. COLORANTE ESPORA CÉLULA VEGETATIVA Verde malaquita verde verde Agua verde decolorada Safranina verde roja b. Cápsula: Muchos microorganismos poseen una cubierta gelatinosa llamada cápsula. En microbiología clínica de demostración de la presencia de cápsula es un medio para determinar la virulencia de un microorganismo, es decir, la capacidad de un patógeno para producir enfermedad. La cápsula es una envoltura mucosa, se compone de polisacáridos, polipéptidos y polímeros extracelulares complejos. Como estas estructuras se alteran por el calor, nunca se podrá utilizar calor en ninguno de los pasos de la tinción. La cápsula no tiene afinidad con los colorantes ordinarios pero puede apreciarse como un halo transparente alrededor de la célula. La técnica de la tinción negativa incorpora materiales tales como tinta china, que se compone de partículas demasiado grandes para penetrar la célula y un colorante de contraste, la safranina, que penetra la célula bacteriana. Al examinar la preparación, la cápsula aparecerá como una zona transparente que rodea la pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras observadas sean cápsulas, debido a que el encogimiento de las células o la separación de la tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general cuando un frotis tratado contiene muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es probable que sean reales y no artificiales. - Sobre un portaobjeto limpio colocar una gota de tinta china (con asa de loop) y emulsionar con ella los microorganismos a examinar. - Extender la muestra y dejar secar al aire. - Cubrir con Safranina por 30 a 45 segs. - Dejar secar - Observar al microscopio con inmersión. La cápsula se verá como un halo transparente rodeando la célula de color rojo y el resto de la preparación aparecerá de color negro. c) Tinción de flagelos Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción demasiado pequeñas para verse al microscopio óptico. Para poderlas visualizar se utiliza un procedimiento de tinción tedioso y delicado que emplea un mordiente y carbolfuchsina para engrosar el diámetro de los flagelos hasta hacerlos aparentes al microscopio óptico. Los microbiólogos utilizan el número y disposición de los flagelos como una ayuda para la identificación de las bacterias.

9 Figura 4: Bacillus subtillis, bacilo esporulado Gram+ Figura 5: Staphylococcus aureus, azul-violeta Gram + Figura 6: Bacillus subtillis, bacilo esporulado Tinción espora, bacilo(rojo), espora (verde)

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