4. Preparación de muestras para microscopía óptica

Transcripción

1 para microscopía óptica

2 Criterios en las técnicas de preparación Técnicas para luz transmitida Técnicas para luz reflejada

3 El objetivo de la preparación de muestras para microscopía óptica es permitir que las estructuras de los materiales se revelen con suficiente contraste de modo que las características de interés sean descritas, grabadas y caracterizadas en detalles visibles a una escala menor que la agudeza visual del ojo humano. La escala última de observación estará limitada por la resolución del sistema de imagen del microscopio.

4 Criterios en las técnicas de preparación Asegurar que la muestra a observar es representativa del material, objeto u organismo de procedencia que se desea estudiar. Hacer que las características de interés sean accesibles al sistema de imagen del microscopio. Cuando sea necesario, aumentar el contraste entre los elementos estructurales de los materiales y el fondo.

5 Criterios en las técnicas de preparación Proporcionar las condiciones suficientes para la estabilidad de las muestras, y suficiente significa proteger las muestras de decaimiento, degradación, corrosión o contaminación dentro de la escala de tiempo de la observación. Ajustar la muestra a los requisitos ópticos del sistema de imagen del microscopio para proveer de las condiciones óptimas de contraste y resolución, y evitar artefactos ópticos que pudieran aparecer y que oscurecerían la imagen o incorporarían falsos detalles.

6 Las muestras biológicas pueden ser examinadas en muchos estados como combinación de los siguientes: vivas o muertas frescas o preservadas/fijadas enteras o en secciones teñidas o sin teñir hidratadas o deshidratadas opacas o aclaradas

7 Las muestras lo suficientemente pequeñas como para ser observadas enteras pueden también ser observadas vivas, obteniéndose el contraste mediante dispositivos ópticos tales como contraste de fases o contraste interferencial u, ocasionalmente, por medio de tintes vivos (tinciones no tóxicas que tienen afinidad por ciertos componentes celulares).

8 Sin embargo, la mayoría de los organismos, sus órganos y tejidos, e incluso sus células, son demasiado grandes para proporcionar información de alta resolución con los microscopios ópticos convencionales. Por ello no pueden ser observados vivos sino que hay que matarlos y entonces (generalmente) deben ser deshidratados, incluidos, cortados, teñidos y montados antes de su examen al microscopio.

9 Montajes temporales de muestras vivas enteras Las muestras que son organismos completos o partes de organismos vivientes requieren un tratamiento especial, tanto para mantenerlos vivos durante la observación, como para asegurar que su muerte no destruya información de interés. Las muestras examinadas al microscopio mientras están vivas suelen ser pequeñas: organismos completos como bacterias, protozoos y pequeños animales y plantas, o partes discretas de organismos como células en cultivo, células sanguíneas, granos de polen, etc.

10 Montajes temporales de muestras vivas enteras Dependiendo de la duración de la observación y de la naturaleza de la muestra, se debe prestar atención a la provisión de suficiente oxígeno, al mantenimiento de la concentración de otras sustancias (por ejemplo sales y alimento ), a la eliminación del CO2 y otros residuos, al control de la temperatura, a la provisión de luz apropiada, a la eliminación de organismos extraños o depredadores.

11 Montajes temporales de muestras vivas enteras Las muestras aquí señaladas estarán montadas, normalmente, en el medio en que se dan habitualmente o serán cultivadas, por eso las técnicas de preparación se limitan a montarlas en un portaobjetos, bajo un cubreobjetos, en una pequeña gota de medio. Si la observación va a ser prolongada puede ser necesario retardar la evaporación sellando los bordes del cubreobjetos.

12 Montajes temporales de muestras vivas enteras

15 Montajes permanentes de muestras no vivas Fijación Deshidratación e inclusión Corte Tinción Montaje

16 Montajes permanentes de muestras no vivas Fijación: Los organismos de los cuales se van a obtener montajes permanentes deben estar necesariamente muertos y se debe tener mucho cuidado en que el sacrificio se produzca en condiciones humanitarias y con la menor alteración posible de la estructura. Tan pronto como sea posible después de la muerte y, en algunos casos, simultáneamente, los tejidos deben ser fijados, un proceso que mata las células, inactiva sus enzimas, y precipita y entrecruza las moléculas que están en solución o suspensión dentro de las células.

17 Montajes permanentes de muestras no vivas Fijación: Todas estas acciones estabilizan la estructura frente a daños en el procesado posterior. La fijación también debe actuar como preservativo frente al ataque microbiano y puede mejorar la afinidad de la muestra por ciertas tinciones. La fijación se lleva a cabo generalmente por tratamiento químico aunque en ciertas circunstancias se puede usar la fijación física por calentamiento o por congelación rápida.

18 Montajes permanentes de muestras no vivas Deshidratación e inclusión: A las células les falta rigidez y se les proporciona artificialmente con el soporte adecuado antes del corte, convencionalmente por inclusión. Un medio de inclusión debe ser capaz de infiltrar el tejido en medio líquido y entonces solidificarse por enfriamiento o polimerización para dar el soporte necesario a los pequeños detalles del interior de la muestra.

19 Montajes permanentes de muestras no vivas Deshidratación e inclusión: El medio más utilizado para la inclusión es la parafina, de un grado que funde a unos 56 ºC. Sin embargo, la parafina no es miscible con los fluidos acuosos en los que la muestra se encuentra y requiere que ésta sea deshidratada, generalmente en pasos a través de concentraciones crecientes de etanol hasta llegar al absoluto, 100%.

20 Montajes permanentes de muestras no vivas Deshidratación e inclusión: El etanol es un agente deshidratante muy bueno pero no es miscible con la parafina fundida, así que hay que reemplazar el etanol con un fluido de transición miscible con él y con la parafina: xileno, tolueno o compuestos menos tóxicos. Una vez reemplazado el etanol con este fluido, el tejido se sumerge en parafina fundida un período de tiempo y ésta infiltra el tejido. Finalmente el tejido se transfiere a parafina fresca y se deja que ésta solidifique.

21 Montajes permanentes de muestras no vivas Corte: Puede ser posible cortar secciones a mano, sin embargo, la mayoría de las secciones se cortan con la ayuda de un microtomo.

22 Montajes permanentes de muestras no vivas Corte: Microtomos

23 Montajes permanentes de muestras no vivas Corte: Con una buena técnica se pueden obtener secciones de unas 5 µm e incluso menores en algunos casos. Durante el corte las secciones forman una fila unas pegadas a otras que es cómoda de manejar y montar.

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25 Montajes permanentes de muestras no vivas Corte: Los cortes se colocan en un porta de microscopía limpio, generalmente flotándolos en una gota de disolución diluida de albúmina, se calienta en una placa hasta que la parafina se reblandezca (sin fundir) para eliminar las arrugas en las secciones y se deja secar en un sitio cálido.

26 Montajes permanentes de muestras no vivas Tinción: A las secciones cortadas en parafina se les debe eliminar ésta por inmersión en el disolvente apropiado, tradicionalmente xileno. Esto se sigue de una sucesión en aumento de concentración de disoluciones acuosas de etanol hasta que la muestra está completamente hidratada, ya que la tinción se suele aplicar en medio acuoso.

27 Montajes permanentes de muestras no vivas Tinción: Una vez que el soporte de la parafina se ha eliminado no se debe permitir que la muestra se seque porque se causarían daños por tensión superficial. La tinción explota la afinidad química entre el tinte y las sustancias presentes en la muestra. El uso sucesivo o combinado de varios tintes, incluyendo la hematoxilina o eosina, cada uno con su afinidad específica, da una coloración tricolor o más compleja a los diversos componentes tisulares.

28 Montajes permanentes de muestras no vivas Tinción: La hematoxilina es un tinte básico (catiónico) que se une electrostáticamente a sitios ácidos (aniónicos) de los ácidos nucleicos (DNA y RNA). La eosina es un tinte ácido (aniónico) que se une a las proteínas, las cuales se vuelven catiónicas cuando la tinción se lleva a cabo a ph 4-5.

29 Montajes permanentes de muestras no vivas Tinción: En el microscopio, las estructuras ricas en ácidos nucleicos, como los núcleos celulares, tienen el color azul de la hematoxilina, mientras que las regiones ricas en proteínas del citoplasma muestran la tinción roja de la eosina.

30 Montajes permanentes de muestras no vivas Tinción:

31 Montajes permanentes de muestras no vivas Tinción:

32 Montajes permanentes de muestras no vivas Tinción: La forma más específica de tinción se da en la inmunocitoquímica donde los marcadores se unen específicamente a moléculas objetivo dentro de la muestra por reacciones inmunológicas. La técnica requiere anticuerpos específicos de la sustancia en estudio junto con una manera de localizar el anticuerpo usando un marcador fluorescente u otro marcador.

33 Montajes permanentes de muestras no vivas Montaje: El paso final en la preparación de una muestra es montarla en una lámina de vidrio, generalmente de 25 mm x 76 mm, el portaobjetos. El material de montaje utilizado, el montante, puede ser bálsamo de Canadá, glicerina, aceites, líquidos acuosos, etc. Una vez colocada la muestra en el portaobjetos y con el montante, se cubre con una lámina, disco o placa de vidrio fino, el cubreobjetos.

34 Montajes permanentes de muestras no vivas Montaje:

35 Montajes permanentes de muestras no vivas Montaje: El grosor del portaobjetos, el del cubreobjetos y el índice de refracción del material de montaje y su adecuación a la muestra, son factores que se deben tener en cuenta. El grosor del cubre es convencionalmente 0,17 mm. El montante debe ser inerte o actuar como preservativo frente a la degradación de la muestra dentro de la escala de tiempo de la observación.

36 Muestras no biológicas Los materiales no biológicos en partículas (como granos de minerales) no requieren preparación anterior al montaje. En situaciones en las que se requiere mantener la distribución de los granos (arcillas o cerámicas porosas) la muestra original se debe impregnar con resina y preparar una lámina delgada. Las secciones finas de materiales blandos como polímeros se pueden preparar usando un microtomo.

37 Muestras no biológicas Las secciones finas de materiales duros (minerales, rocas, cerámicas, cerámicas impregnadas con resina) se preparan según la secuencia de pasos siguiente: 1) Se corta una lámina de 1 mm de grosor o se desprende un fragmento del material original. 2) Se monta la lámina en un porta usando Lakeside u otro cemento. 3) Se pule un lado de la lámina.

38 Muestras no biológicas 4) Se monta la lámina boca abajo en otro porta y se retira el primero. 5) Se pule la parte superior hasta el grosor requerido. 6) Se pega el cubre en la superficie superior.

39 Técnicas de preparación para luz reflejada Preparación inicial y montaje: Para facilitar el manejo, por un lado, y para proporcionar una superficie de muestra suficientemente grande, por el otro, las dimensiones de la muestra deben ser del orden de 5 a 15 mm en la superficie preparada y de 1 a 10 mm de grosor. El corte de esta muestra a partir de una pieza más grande de roca o de metal, por ejemplo, se debe hacer con mucho cuidado. En muchos casos la orientación de la superficie de la muestra (por ejemplo en relación con la roca origen o el componente metálico) es importante y debe quedar registrada.

40 Técnicas de preparación para luz reflejada Preparación inicial y montaje: Para el corte de la muestra lo más apropiado y lo que da lugar a una menor deformación en la superficie de corte es un abrasivo en húmedo como una rueda de metal o bakelita impregnada con alúmina, nitruro de boro, carburo de silicio o diamante.

41 Técnicas de preparación para luz reflejada Pulido: El pulido se lleva a cabo a mano usando tiras de papel abrasivo o utilizando discos abrasivos montados en una rueda con sucesivos grados de grit cada vez más finos, normalmente carburo de silicio para los grados más gruesos, y α- y γ-alúmina y diamante para los pulidos más finos. El carburo de silicio se utiliza entre 58 y 15 µm de grit. En las etapas finales el α-alúmina de 10 a 1 µm y la γalúmina de unos 0,3 µm o bien el diamante de 6 a 1 µm.

42 Técnicas de preparación para luz reflejada Tratamiento superficial: Para muchos materiales (como rocas o cerámicas) no es necesario más tratamiento y las fases constituyentes pueden estar suficientemente reveladas por sus diferencias de color, birreflectancia o textura superficial. Para los metales y tratamientos de etching. aleaciones se requieren En cualquier caso todos los materiales deben examinarse en las condiciones de recién pulido para comprobar que no existen artefactos y detectar inclusiones gruesas o porosidad que puedan influir en el proceso de etching.

43 Técnicas de preparación para luz reflejada Tratamiento superficial: El etching se puede definir como un ataque selectivo de los granos o de las fronteras interfase y/o el ataque selectivo de las propias fases. Los atacantes son disoluciones acuosas o alcohólicas y mezclas de sales, ácidos y bases, etc. Cuanto más resistentes a la corrosión son los metales y las aleaciones, naturalmente requerirán disoluciones más agresivas.

44 Técnicas de preparación para luz reflejada Tratamiento superficial: El proceso de etching consiste simplemente en sumergir la muestra en el atacante, o por electrolisis hacer de la muestra el ánodo de una cuba electrolítica. Generalmente se requiere un proceso de pulido final después del etching.