DNA RECONBINANTE Depende de enzimas capaces de: Cortar Unir Replicar Transcribir inversamente el RNA Otra herramienta es el uso de Sondas específicas

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1 DNA RECONBINANTE Depende de enzimas capaces de: Cortar Unir Replicar Transcribir inversamente el RNA Otra herramienta es el uso de Sondas específicas

2 ELEMENTOS BÁSICOS DE LA INVESTIGACIÓN EN GENES Análisis de enzimas de restricción: Bisturíes moleculares Técnicas de trasnferencia o Blotting: Southern y Northern se utilizan para separar y caracterizar DNA y RNA respectivamente. Secuenciación del DNA. Síntesis en fase sólida de ácidos nucleicos. Reacción en cadena de la polimerasa.

3 Enzimas de restricción Endonucleasas que reconocen secuencias de bases específicas en el DNA doble hélice, y cortan ambas hebras en sitios concretos. Se han encontrado en gran variedad de procariotas. Su función biológica consiste en destruir DNA foráneo, el DNA propio no se degrada porque los sitios de cortes se encuentran metilados. Reconocen secuencias específicas de entre 4 y 8 pares de bases e hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra de esta región.

4 Generalmente las secuencias de cortes son palindrómicas

5 Se han purificado y caracterizado más de 100 enzimas de restricción Se nombran con una abreviatura de 3 letras que hacen referencia al organismo hospedador, seguido de una indicación de la cepa de la cuál se aisló y de un número romano, en caso de haber más de una enzima de la misma cepa. Ej: EcoRI (Escherichia coli), Hae III (Haemophilus aegyptius), El producto del corte con una enzima puede ser a su vez digerido en fragmentos más pequeños con otras enzimas y en su conjunto dichos fragmentos servir como huellas digitales de una molécula de DNA.

6 LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN PUEDEN SEPARARSE POR ELECTROFORESIS EN UN GEL En general la movilidad de un fragmento de DNA es inversamente proporcional al log del N de pares de bases Se utilizan geles de poliacrilamida para separar fragmentos de hasta mil pares de bases. Para resolver fragmentos mayores (hasta 20 Kb) se utilizan geles de agarosa. Una característica importante de esos geles es su alto poder de resolución: se pueden distinguir fragmentos de varios cientos de nucleótidos que difieren en longitud por un solo nucleótido

7 Visualización de un fragmento de restricción Técnica de Southern blot Mezcla de fragmentos se separan por electroforésis en gel de agarosa. Se desnaturalizan los fragmentos para formar DNAs y se transfiere a una Membrana de nitrocelulosa. Se expone la membrana a una sonda de DNA marcada con 32 P La sonda se hibrida con la secuencia complementaria Se revela por autorradiografía.

8 Southern Blot (Edwin Southern)

9 Western Blot Técnica utilizada para la visualización de proteínas. Se realiza un extracto de proteínas totales Se corren proteínas totales en un gel de poliacrilamida ( distintos %) Se transfiere las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa Se incuba con un anticuerpo primario que reconozca la proteína problema Posteriormente se incuba con un Ac Sec anti IgG de la Sp donde se realizó el Ac 1rio. Este Ac. Sec posee unido covalentemente una enzima (Peroxidasa) Se coloca el sustrato de la enzima unido a un cromoforo (ej: Luminol) Se revela

10 Secuenciación del DNA La clave en la secuenciación del DNA es la generación de fragmentos, cuya Longitud depende de la última base de la secuencia. Generando grupos de estos fragmentos por interrupción controlada de la replicación enzimática (Método Sanger).

11 Para obtener la secuencia de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos Segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Una enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Pol. I del bacteriofago T4 "primers" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN. este cebador procede de una región del vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia se conoce. Los cuatro nucleótidos trifosfato (datp, dctp, dgtp y dttp). Nucleótidos didesoxi (ddatp, ddttp, ddctp y ddgtp). han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.

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13 Descripción del método En primer lugar, se realizan cuatro mezclas de reacción. Cada una contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (datp, dctp, de dttp y dgtp), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido didesoxi, por ejemplo ddatp, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddatp en este ejemplo) competirá con su homólogo (datp) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reacción se producen una serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

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15 Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos se separan por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucleótido.los productos de cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel. Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de autorradiografía. La aparición de una banda en una posición concreta de la autorradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción correspondiente.

16 Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección 5' 3'.

17 Método automático de secuenciación La principal diferencia entre método de SANGER y el método automático radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dttp) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción. La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.

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19 Ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia.

20 Clonación de DNA Acción de realizar copias idénticas de una molécula de DNA Pero también es el aislamiento de una secuencia concreta del DNA (gralmente un gen). La clonación del DNA se puede llevar a cabo de diferentes maneras, Siempre dependiendo y teniendo en cuenta EL OBJETIVO DEL LA CLONACIÓN: Clonado para sobre-expresar una proteína Clonado para identificar una proteína Clonado para secuenciar un gen

21 La forma más sencilla de clonación es la sig: 1. Inserción de un fragmento de DNA, en un elemento génico autorreplicativo, Ej un virus o un plásmido 2. Introducción de la molécula de DNA recombinante en una bacteria, amplificando la expresión de la secuencia insertada. Los VIRUS o PLÁSMIDOS se denominan VECTORES DE CLONACIÓN Y se dice que el DNA insertado que se propaga ha sido CLONADO

22 PASO 1 PASO 2 PASO 3

23 PASO 1 PASO 2 PASO 3

24 Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia. Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador. Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

25 Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto. Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente. En bacterias (células procariotas): Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a Tratamientos físicos y químicos. Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.

26 Generalmente para clonar un gen se comienza construyendo Una BIBLIOTECA DE DNA o GENOTECA: Colección de fragmentos de DNA clonados a partir de células Tejidos u organismos. 1. Biblioteca DNA genómico 2. Biblioteca de cdna

27 Biblioteca de cdna 1. Extracción de RNAm total 2. Copia de DNA complementario cdna de c/u de las moléculas de RNAm mediante el uso de una transcriptasa inversa de retrovirus, la cuál sintetiza DNA a partir de un molde de RNA. 3. Las moléculas de DNA monocatenarias sintetizadas se transforman en doblecatenarias por DNA polimerasa. 4. Se insertan en vectores y se clonan.

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