CINETICA DE ANTIGENOS Y ANTICUERPOS EN UNA INFECCION VIRAL

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1 ENSAYOS VIROLOGICOS

2 CINETICA DE ANTIGENOS Y ANTICUERPOS EN UNA INFECCION VIRAL reinfeccion Titulo de Ac en suero VIRUS Periodo de Período incubación enfermedad Periodo convalesciente Signos y Sintomas Ventana Ventana inmunologica inmunológica Tiempo en semanas

3 CADENA DEL DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO Decisión del estudio: En base a la evolución clínica investigación viral Obtención de la muestra: Envio de la Muestra: Inmediatamente, en condiciones de bioseguridad Metodologia de laboratorio: Métodos Directos Métodos Indirectos Interpretacion de los resultados: Integración de datos clínicos, epidemiológicos y de laboratorio. Qué? Cuándo? Cómo?

4 Qué muestra clínica solicitar para el aislamiento viral? Muestra clínica Agente Síndrome asociado más importante Aspirado NasofaríngeoAspirado Lavado Nasal Hisopado nasal y/o faríngeo Enterovirus Sarampión Rubeola Citomegalovirus Virus respiratorio (IA, IB, VRS, Ad, etc) Enterovirus Rotavirus, Adenovirus, V.Nonwalk, Calicivirus,Coronavirus Citomegalovirus Adenovirus Encefalitis Enfermedad eruptiva Enfermedad eruptiva Infección congénita Infecciones respiratorias altas y bajas Encefalitis Diarrea infecciosa aguda Virus Herpes simplex tipo 1 y 2 Virus Varicela Zoster HIV 1 2 HTLV I II Epstein Barr Virus Junin Enterovirus Virus Herpes simplex tipo 1 y 2 CMV Sarampión Eruptiva Vesicular Materia Fecal Orina Muestra de lesión Sangre Liquido cefalo raquideo Infección congénita Cistitis SIDA Leucemia a células T Mononucleosis infecciosa Fiebre hemorragica Argentina Encefalitis Encefalitis Encefalitis Encefalitis post eruptiva

5 DIAGNOSTICO VIRAL AISLAMIENTO VIRAL Proteínas (Ag virales) PRESENCIA DE VIRUS DETECCIÓN Acidos nucleicos(adn,arn) OBSERVACION DIRECTA DE PARTICULAS VIRALES RESPUESTA INMUNE DEL HUESPED INMUNOGLOBULINAS (IgM, IgG, IgA)

6 AISLAMIENTO VIRAL Se basa en la capacidad infectiva del agente infeccioso presente en la muestra Huevos embrionados Lesiones de Membrana Estudio de líquidos y tejidos Animales Enfermedad o muerte Cultivos Celulares Efecto Citopático Producción de Hemaglutininas Interferencia (primarios, línea contínua) El aislamiento viral NO ES un método de diagnóstico rápido en la rutina de laboratorio, ya que necesita de cierta infraestructura y condiciones (tiempos de cultivo, pasajes en ciego, condiciones de la muestra) para su realización.

7 Aislamiento viral en huevos embrionados Inoculación de ratón recién nacido para aislamiento viral

8 Cultivos Celulares Efecto Citopático Hemadsorción

9 IDENTIFICACION Luego del aislamiento del agente viral se procede a identificarlo por métodos inmunológicos y/o moleculares Inmunofluorescencia, Inmunoperoxidasa Inhibición de la Hemoaglutinación Test de Neutralización EIA Detección de Ac. Nucleicos

10 Inmunoflorescencia INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD) Celulas del cultivo celular infectado Célula epitelial infectada con HSV INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) Celulas del cultivo celular infectado

11 Ag viral +GR Hemoaglutinación Agviral +Ac. Esp...+ GR Inhibición de la Hemoaglutinación

12 Neutralización Virus Célula susceptible Anticuerpo Célula infectada Específico Célula no infectada

13 DIAGNOSTICO VIRAL AISLAMIENTO VIRAL IF IDENTIFICACION IHA NEUT. Proteínas (Ag virales) PRESENCIA DE VIRUS DETECCIÓN Acidos nucleicos(adn,arn) OBSERVACION DIRECTA DE PARTICULAS VIRALES RESPUESTA INMUNE DEL HUESPED INMUNOGLOBULINAS (IgM, IgG, IgA)

14 Detección de Antígenos Virales No se requiere necesariamente la presencia del virus completo. Los antígenos virales pueden detectarse a través de la formación de un complejo inmune con su anticuerpo específico. Inmunofluorescencia (IF) Test de aglutinación Enzimoinmunoensayo (EIA) EIA sandwich EIA indirecto EIA en membrana Radioinmunoensayo (RIA)

15 INMUNOFLUORESCENCIA INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD) Células de la muestra clínica INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) Células de la muestra clínica

16 DETECCION DE ANTIGENOS POR EIA EIA en Placa EIA en membrana

17 DIAGNOSTICO VIRAL IHA IDENTIFICACION AISLAMIENTO VIRAL PRESENCIA DE VIRUS IF NEUT. DETECCIÓN Proteínas IF (Ag virales) Aglut EIA - RIA Acidos nucleicos(adn,arn) OBSERVACION DIRECTA DE PARTICULAS VIRALES(ME) RESPUESTA INMUNE DEL HUESPED INMUNOGLOBULINAS (IgM, IgG, IgA)

18 DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES Detección específica de secuencias de ac. Nucleicos virales.(diag. Tipo, subtipo, carga viral, etc) Detección directa de Ac. Nucleico (ej rotavirus) Hibridización (sonda ac. Nucleico) Amplificación de la secuencia viral PCR (virus ADN) RT-PCR (virus ARN) NASBA (virus ARN) Real Time PCR

19 Detección directa de ácido nucleico (ARNdc, ej rotavirus) TINCIÓN CON BrEt TINCIÓN CON AgNO3

20 Hibridización

21 PCR (virus ADN) 4 PRIMEROS CICLOS DE UNA PCR: ADN dc DESNATURALIZACION fragmento a amplificar HIBRIDIZACION ELONGACION ADN blanco nº de doble cadena de long. correcta: AMPLICON de long. definida por 5 de los primers ciclo 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo

22 RT-PCR ARN Nested-PCR Multiplex ADNdc ADNdc AAAAAAA RT ADNc PCR 1er par de primers PCR ADNdc permite la amplificación de ARN mediante previa retrotranscripción enzimática ya que el mismo no es sustrato apto para la ADN pol. ARN ADNc ADNdc PCR 2do par de primers amplificación en dos rondas de PCR con dos juegos de primers, internos a la sec. previamente amplificada Sensibilidad / especificidad PCR posibles múltiples juegos de primers amplificación simultánea de múltiples blancos en una única reacción Detección simultánea de diferentes agentes virales

23 RT-PCR (hantavirus) RT-PCR multiplex (influenza) Detección en gel de agarosa con Br Et.

24 bdna

25 RT-PCR ARN ss ARN Cebadores biotinilados Extracción con tiocianato de guanidinio rtth pol ADN c Polimrización ADN amplificado biotinilado HIV Pocillo de captura con sonda HIV Avidina - HPR Espectrofotometro Peróxido de hidrogeno

26 PCR en tiempo real

27 DIAGNOSTICO VIRAL IDENTIFICACION AISLAMIENTO VIRAL PRESENCIA DE VIRUS DETECCIÓN IF IHA NEUT. Proteínas IF (Ag virales) Aglut EIA - RIA Acidos nucleicos(adn,arn) OBSERVACION DIRECTA Hibridación RT-PCR PCR NASBA DE PARTICULAS VIRALES(ME) RESPUESTA INMUNE DEL HUESPED INMUNOGLOBULINAS (IgM, IgG, IgA)

28 Detección de particulas virales Estas técnicas se basan en la visualización de los viriones presentes en los materiales clínicos. La morfologia y el tamaño viral sirven como guía para su diagnóstico presuntivo. Adenovirus en muestra Rotavirus en muestra de materia fecal de materia fecal HIV brotando de la membrana plasmática La flecha en D muestra la forma de cono de la nucleocapside

29 DIAGNOSTICO VIRAL AISLAMIENTO VIRAL PRESENCIA DE VIRUS DETECCIÓN IF IDENTIFICACION IHA NEUT. Proteínas IF (Ag virales) Aglut EIA - RIA Acidos nucleicos(hib, PCR, RT-PCR, NASBA, etc) Tinción negativa de partículas OBSERVACION DIRECTA DE PARTICULAS VIRALES(ME) RESPUESTA INMUNE DEL HUESPED Sección fina de células infectadas por virus INMUNOGLOBULINAS (IgM, IgG, IgA)

30 CINETICA DE ANTIGENOS Y ANTICUERPOS EN UNA INFECCION VIRAL reinfeccion Titulo de Ac en suero VIRUS Periodo de Período incubación enfermedad Periodo convalesciente Signos y Sintomas Ventana Ventana inmunologica inmunológica Tiempo en semanas

31 Respuesta inmune del huésped Criterio para el diagnóstico de una infección primaria. c) Seroconversión: aparición de Ac IgG o el aumento de su título en más de 4 veces en 2 muestras pareadas de suero. e) Detección de IgM específica permite realizar con certeza un diagnóstico de infección reciente, aún con una sola muestra de suero obtenida en el período agudo de la enfermedad.

32 METODOS DE DETECCION DE ANTICUERPOS Métodos basados en la reacción Ag-Ac. En estas técnicas el Ag es conocido, siendo el Ac la variable a investigar (IgM, IgG e IgA) Neutralización IF Inhibición de la hemoaglutinación Aglutinación Pasiva Ensayos inmunométricos EIA (competitivos, de captura, indirecto) Western Blot

33 Aglutinación Pasiva Agregado de Ac. Partículas cubiertas de Ag.

34 ELISA directo para detección de IgG E SOPORTE SÓLIDO E + + E + Sustrato E Antígeno Suero del paciente Anticuerpo anti IgG(humano) conjugado a enzima Producto coloreado

35 PRINCIPIO DEL ENZIMOINMUNOANALISIS DE CAPTURA PARA IgA VIH ESPECIFICA E SOPORTE SOLIDO E + + E + E Anticuerpos Anti IgA Suero del paciente Antígeno conjugado a enzima Producto coloreado

36 ELISA de captura (sandwich) para detección de IgM específica anti hantavirus suero del paciente Anticuerpos anti IgM (m) fase sólida suero de conejo anti hantavirus Maciel antígeno hantavirus Maciel sustrato (ABTS) Anticuerpo anti conejo conjugado con peroxidasa Producto coloreado

37 WESTERN BLOT Interpretación del patrón de bandas: Carril 1, suero HIV+ (control positivo) Carril 2, suero HIV- (control negativo) Carril A, NEGATIVO Carril B, INDETERMINADO Carril C, POSITIVO

38 TEST RAPIDOS

39 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD La capacidad diagnóstica de un método, se determina por el cálculo de la sensibilidad y especificidad del mismo, en comparación con la técnica considerada de referencia. Sensibilidad: Es la capacidad de un método para detectar positivos frente a un determinado patógeno. Un método que posee alta sensibilidad es aquél que permite que todos los positivos sean detectados. Verdaderos positivos x 100 Total con patología Especificidad: Es la capacidad de un método para diferenciar positivos de negativos frente a un determinado patógeno. Un método altamente específico es aquél que minimiza el número de falsos positivos Ningún negativo debe ser considerado por la técnica como positivo. Verdaderos negativos x 100 Total sin patología

40 Bibliografia recomendada S. Specter, R L. Hodinka, S.A. Young Clinical Virology Manual. 3º Edición. ASM Press Washington, D.C. E. H. Lennette, D.A. Lennette, E.T. Lennette Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. 7th Edición. American Public Health Association. Knipe DM, Howley PM., Fields Virology. Fifth Edition. Lippincott Williams & Wilkins

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