Informe Final DISPOSITIVO INTRAVAGINAL LIBERADOR PARA USO EN CAPRINOS Y OVINOS (DICO) Edgardo Rubianes, MSc, PhD Alejo Menchaca, DVM, MSc

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1 Informe Final CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO DISPOSITIVO INTRAVAGINAL LIBERADOR DE PROGESTERONA PARA USO EN CAPRINOS Y OVINOS (DICO) Edgardo Rubianes, MSc, PhD Alejo Menchaca, DVM, MSc Convenio FisRep-Syntex Fundaciba Montevideo, Uruguay 1 de Agosto 2006

2 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/2006 1

3 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ RESUMEN EJECUTIVO Durante los meses de mayo-julio de 2006 se realizó una serie de ensayos para caracterizar un nuevo dispositivo siliconado de progesterona para uso intravaginal en ovinos (DICO, Syntex, Buenos Aires, Argentina). Los resultados muestran que las concentraciones séricas inducidas por la inserción del DICO tanto en animales previamente ovariectomizados (ensayo A1) como en animales en fase luteal avanzada (día 9-10 del ciclo interestral) (ensayo B1) no son diferentes de las inducidas por el dispositivo existente en el mercado, CIDR-G (Pharmacia & Upjhon, Hamilton, Nueva Zelanda). Luego del retiro de los dispositivos el intervalo al estro (30 hs vs 35 hs) y a la ovulación (55 vs 60 hs) ocurre en forma similar. La tasa ovulatoria, el tamaño del foliculo ovulatorio y la edad de este también fueron similares con el uso de uno u otro de los dispositivos. El reuso por 6 días de un DICO previamente usado por 6 días, induce en ovejas ovariectomizadas concentraciones séricas de progesterona significativamente más bajas que uno nuevo (ensayo A2) pero siempre superiores a 2 ng/ml durante todo el período. El uso de un DICO en un tratamiento corto (6 días) asociado a una dosis de PGF2 alfa al momento del retiro del mismo induce un intervalo al estro y a la ovulación de 46 horas y 74 horas, respectivamente (ensayo B2). El uso de una dosis de 350 UI de ecg administrada al momento de retirar el DICO adelantó el inicio del estro y la ovulación en aproximadamente 10 horas (36 hs y 63 hs, respectivamente). Edgardo Rubianes y Alejo Menchaca 1 de Agosto de 2006 Los ensayos se realizaron en las instalaciones del Laboratorio de Fisiología de la Reproducción (PEDECIBA, Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas), Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. La dirección técnica estuvo a cargo de Edgardo Rubianes, MSc, PhD y de Alejo Menchaca, DVM, MSc. Participaron los Bres. Marcela Vilariño y Federico Arruti en el trabajo técnico, el Sr. Milton Pintos en el trabajo con los animales y Elize Van Lier, DVM, MSc, PhD en la determinación hormonal de las muestras sanguíneas. La ejecución financiera se realizó por FUNDACIBA (Fundación del PEDECIBA). Edgardo Rubianes es Profesor Adjunto de Reproducción Animal de la Facultad de Agronomía, Universidad de la República, Investigador senior del PEDECIBA; de los Programas de Posgrado de las Facultad de Agronomía y de la Facultad de Veterinaria; y del Fondo Nacional de Investigadores. Alejo Menchaca es Investigador junior del Fondo Nacional de Investigadores.

4 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO DISPOSITIVO INTRAVAGINAL LIBERADOR DE PROGESTERONA PARA USO EN CAPRINOS Y OVINOS (DICO) Se efectuaron una serie de ensayos con ovejas ovariectomizadas y con ovejas ciclando durante los meses de mayo a julio de A) ENSAYOS CON OVEJAS OVARIECTOMIZADAS (OVX) A1) COMPARACIÓN DE LOS DISPOSITIVOS DICO Y CIDR EN TRATAMIENTOS LARGOS a) OBJETIVO El objetivo fue establecer los perfiles séricos de progesterona inducidos por un dispositivo siliconado intravaginal (DICO, Syntex) con un tratamiento de duración tradicional (14 días) y compararlos con los obtenidos con el dispositivo de una marca comercial presente en el mercado en animales sin actividad ovárica. b) MANEJO DE LOS ANIMALES Se utilizaron 18 ovejas Corriedale adultas previamente ovariectomizadas que pesaban 50,5 ± 4,9 kg (media ± DS) y tenían una condición corporal de 3,9 ± 0,3 en una escala del 0 al 5 siendo 0 emaciado y 5 obeso. Los animales fueron mantenidos juntos en bretes apropiados y recibieron la misma alimentación y el mismo manejo diario. La alimentación consistió en 2,5 kg de heno de alfalfa y 900 gr de balanceado comercial por animal por día. El heno fue ofertado en partes iguales en tres oportunidades: a las 9 AM, a la 1 PM y a las 6 PM y el balanceado 1 hora más tarde. Los animales se encontraban habituados al régimen alimenticio y al manejo diario dado que hacia dos meses venían recibiendo el mismo. c) DISPOSITIVOS UTILIZADOS Los animales fueron adjudicados a dos grupos experimentales de 9 ovejas cada uno las que fueron tratadas con un DICO o un CIDR-G durante 14 días. De acuerdo a la información suministrada por los fabricantes ambos dispositivos contienen 0,3 gr de progesterona. La partida del Dispositivo Intravaginal en evaluación (DICO) fue elaborada en abril de 2006 por la empresa SYNTEX. El dispositivo presente en el mercado fue CIDR- G (Control Internal Drug Release, Eazi-Breed, Hamilton, Nueva Zelanda) para uso en ovejas y cabras (Pharmacia & Upjohn; batch Nº F111042; expiry date: 11/2007). e) OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS SANGUÍNEAS Se tomaron muestras sanguíneas por venopunción yugular de los animales en la misma secuencia y por el mismo técnico. Las muestras diarias se tomaron entre las 8 y 9 AM, es decir previo a la alimentación de los animales. La excepción a esta regla solo se dio cuando se tomó más de una muestra diaria (v. gr. entre el día 0 y el día 1 y entre el día 14 y día 16 luego de la inserción del dispositivo). Las muestras sanguíneas fueron colocadas en tubos de vidrio, dejadas coagular a temperatura de laboratorio y centrifugadas a 3000 rpm durante 15 minutos dentro de la hora de extraída. El suero fue separado con jeringa y aguja. Alícuotas de suero fueron colocadas en duplicado en tubos eppendorf de 1.5 ml identificados apropiadamente. Inmediatamente los tubos fueron colocados en un freezer a

5 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ grados centígrados y mantenidos allí hasta su procesamiento para la determinación de progesterona sérica por radioinmunoanálisis. f) DETERMINACIÓN DE PROGESTERONA SÉRICA POR RADIOINMUNOANÁLISIS La concentración de progesterona sérica fue determinada en duplicado utilizando un Kit comercial de Radioinmunoanálisis Iodo 125 de fase sólida (Coat-a-Count, DPC, Los Angeles, CA, USA). El volumen utilizado para los ensayos fue de 100 μl de suero puro. De acuerdo al fabricante el anticuerpo contra progesterona es altamente específico para progesterona con baja reacción cruzada a otros esteroides naturales. La técnica ha sido validada para su uso en ovinos (Garófalo & Tasende, 1996). Los valores promedios de los controles fueron de 0,75 ng/ml, 2,77 ng/ml y 8,57 ng/ml para los valores bajo, medio y alto respectivamente. Los coeficientes de variación intraensayo fueron respectivamente 8%, 6,8% y 4,6%, y los coeficientes de variación interensayo fueron de 10,5%, 9% y 8,2%. El límite de detección fue de 0,12 ng/ml. g) ESTUDIOS ESTADÍSTICOS Se utilizó el procedimiento de análisis para mediciones repetidas del paquete estadístico SAS. El modelo incluyó los efectos grupo, tiempo y sus interacciones. RESULTADOS Los resultados muestran que las concentraciones de progesterona sérica provocados por la inserción de un CIDR o un DICO fueron similares (P> 0,1) tanto durante el período del tratamiento de 14 días (Figura 1) como inmediatamente luego de su inserción (Figura 2a) o de su retiro (Figura 2b). progesterona (ng/ml) CIDR DICO Día Figura 1. Media (± error estándar) de la concentraciones séricas diarias de progesterona en ovejas ovariectomizadas tratadas con un dispositivo intravaginal de progesterona CIDR (n=9) o DICO (Syntex ; n=9). Día 0 momento de inserción del dispositivo y Día 14 momento del retiro del mismo.

6 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ progesterona (ng/ml) CIDR DICO -24 h 0 2 h 4 h 12 h 24 h 36 h horas desde la inserción del dispositivo progesterona (ng/ml) h 0 2 h 4 h 12 h 24 h 36 h horas desde el retiro del dispositivo CIDR DICO Figura 2. Media (± error estándar) de la concentraciones séricas de progesterona en ovejas ovariectomizadas tratadas con un dispositivo intravaginal de progesterona CIDR (n=9) o DICO (n=9). En A se muestran las concentraciones inducidas por la inserción del dispositivo y en B las observadas luego de retirado a los 14 días de su aplicación. h) CONCLUSION El uso de un DICO durante 14 días indujo concentraciones séricas de progesterona de manera similar a un CIDR. A partir de estos resultados el nuevo dispositivo DICO podría ser utilizado con la misma efectividad que el CIDR para controlar la concentración de progesterona en sangre en ovejas. A2) COMPARACIÓN DE UN DISPOSITIVO DICO NUEVO CON UNO REUTILIZADO a) OBJETIVO El objetivo fue comparar en animales ovariectomizados, los perfiles séricos de progesterona inducidos por un DICO nuevo utilizado durante 6 días con los obtenidos con el reuso por igual período con un DICO previamente usado por 6 días. b) ANIMALES Y TRATAMIENTOS Se utilizaron 11 ovejas Corriedale adultas, previamente ovariectomizadas, y que pesaban 50,8 ± 4,8 kg (media ± DS) y con una condición corporal de 3,9 ± 0,1. El experimento se realizó en dos replicados cruzados. A 6 animales se les colocó el dispositivo nuevo en el primer replicado y en el segundo replicado un dispositivo previamente usado por 6 días. A la inversa, en los otros 5 animales se les colocó en el primer replicado un dispositivo previamente usado por 6 días y en el segundo replicado un dispositivo nuevo. El intervalo entre un replicado y otro fue de 7 días. El manejo de los animales, la obtención y procesamiento de muestras y la determinación de progesterona sérica por radioinmunoanálisis se efectuó en forma similar a lo descrito en los literales A1d, A1e y A1f. Todos los dispositivos DICO utilizados eran de la misma partida (ver A1 c) y los reutilizados fueron usados previamente durante 6 días en otros animales de la misma majada experimental. RESULTADOS

7 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ progesterona (ng/ml) DICO nuevo DICO usado h 4h 12h 24h 36h 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 6 d 6 d 6 d 6 d 6 d +2 h +4 h +12 h+24h+36 h tiempo desde la inserción del dispositivo Figura 3. Media (± error estándar) de la concentración sérica de progesterona en 11 ovejas ovariectomizadas tratadas durante 6 días con un dispositivo intravaginal de progesterona DICO (Syntex) nuevo o previamente usado por 6 días. Día 0 momento de inserción del dispositivo y Día 6 momento del retiro del mismo. En la Figura 3 se muestran las concentraciones séricas de progesterona. La inserción de un DICO previamente usado indujo concentraciones de progesterona significativamente menores (P< 0.01) durante todo el período. No obstante es interesante observar que las mismas son más estables en función del tiempo que cuando se utilizó un DICO nuevo y en ambos grupos se mantuvieron concentraciones superiores a 2 ng/ml durante todo el tratamiento. d) CONCLUSION La reutilización de un DICO durante 6 días permite obtener una concentración adecuada de progesterona sérica (> 2 ng/ml) durante todo el tratamiento. De esta manera con un tratamiento por 6 días es posible reutilizar los dispositivos DICOs usados previamente por 6 días.

8 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ B) ENSAYOS CON OVEJAS CICLANDO (en fase luteal avanzada: días 9-10) B1) COMPARACIÓN DE LOS DISPOSITIVOS DICO Y CIDR EN TRATAMIENTOS LARGOS a) OBJETIVOS Caracterizar los perfiles séricos de progesterona inducidos por el nuevo dispositivo (DICO) con un tratamiento de duración tradicional (14 días) y compararlos con el dispositivo comercial presente en el mercado (CIDR) utilizando animales ciclando, en lo que serían las condiciones habituales de uso de este producto. Caracterizar la actividad ovárica -folicular y luteal- cuando se utilizan dichos dispositivos y precisar el grado de sincronización del momento ovulatorio luego de tratamientos de duración tradicional (14 días). b) ANIMALES Se utilizaron 15 ovejas Corriedale adultas que fueron adjudicadas a dos grupos: CIDR (n= 7) y DICO (n=8). Los animales pesaron 43,8 ± 4,3 kg. (media ± DS) y tenían una condición corporal de 4,0 ± 0,2 en una escala del 0 al 5. c) MANEJO DE LOS ANIMALES Los animales fueron mantenidos juntos en bretes apropiados recibiendo la misma alimentación y manejo diario. Las ovejas permanecieron bajo estas condiciones durante un mes previo al experimento con el objetivo de que se adaptaran a dicho manejo. La alimentación consistió en 2,5 kg de heno de alfalfa y 900 gr de balanceado comercial por animal por día. El heno fue ofertado en partes iguales en tres oportunidades: a las 9 AM; a la 1 PM y a las 6 PM y el balanceado 1 hora más tarde. d) TRATAMIENTOS EXPERIMENTALES El ciclo de los animales fue presincronizado para iniciar el tratamiento con el dispositivo en fase luteal avanzada (día 9-10 del ciclo estral) utilizando un tratamiento de dos dosis de un análogo de PGF2 alfa (D cloprostenol, 75μg por dosis, Ciclase, Syntex, Argentina) separadas por 7 días. La aparición del celo fue determinada utilizando dos capones marcadores que fueron tratados con andrógenos previo a su utilización (3 dosis consecutivas separadas por una semana de 200 mg de ciclopentilpropionato de testosterona, Laboratorio Dispert, Uruguay). Los machos marcadores se ubicaron con las ovejas (1 por grupo experimental), se les aplicó tierra de colores en la zona periprepucial y fueron rotados cada 6 horas entre ambos grupos. Se registró en las ovejas la existencia de marcas indicadoras de celo cada 6 horas durante las 120 horas siguientes al retiro del dispositivo. e) OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS SANGUÍNEAS Las muestras se tomaron y procesaron como fue descrito en A1e y A1f. f) SEGUIMIENTO OVÁRICO POR ULTRASONOGRAFÍA El seguimiento ovárico por ultrasonografía fue realizado diariamente desde 3 días antes de la inserción del dispositivo hasta el día de retiro del dispositivo y luego cada 12 horas hasta que la ovulación fue detectada y confirmada en la ecografía siguiente. Luego de confirmada la ovulación el animal fue retirado del experimento.

9 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ Para realizar las ecografías se utilizó un equipo Aloka 500 provisto de un transductor de 7.5 MHz. A este se le dio rigidez insertándolo en un caño de PVC de 30 cm cortado longitudinalmente. De ese modo fue posible introducir el transductor en el recto y manipularlo desde el exterior para identificar las estructuras ováricas. Los técnicos actuantes poseen gran experiencia en esta técnica y los animales se habitúan rápidamente a este procedimiento que es totalmente inocuo. Los animales fueron sujetados en un cepo, se procedió al retiro de las materias fecales y se introdujo entre 30 y 50 ml de gel de carboximetyil celulosa en el recto por medio de una jeringa para facilitar el contacto entre el transductor y la pared del recto. Luego de localizarse los ovarios se realizó un mapeo de las estructuras observadas, es decir de los folículos mayores de 2 mm y de los cuerpos lúteos (CL). El diámetro de los folículos mayores así como el de los CLs fueron medidos utilizando el calibre del monitor del ecógrafo. El análisis de la información obtenida permitió determinar diferentes variables vinculadas a la dinámica folicular como las características de las ondas foliculares, tamaño del folículo ovulatorio y momento de la ovulación. Para la comparación de estas variables se utilizó análisis de varianza. g) RESULTADOS La Figura 4 muestra la concentración sérica de progesterona durante los días de tratamiento en ambos grupos. Los resultados demuestran que el DICO mantuvo valores muy similares a los obtenidos con un CIDR en ovejas ciclando de manera similar a lo encontrado en el experimento anterior con ovejas ovariectomizadas. progesterona (ng/ml) h 12h , ,5 Días CIDR DICO Figura 4. Media (± error estándar) de la concentración sérica de progesterona en ovejas cíclicas tratadas durante 14 días con un dispositivo intravaginal de progesterona DICO o un CIDR-G. Día 0 momento de inserción del dispositivo y Día 14 momento del retiro del mismo. La Tabla 1 muestra que el inicio del estro, el desarrollo folicular y el momento ovulatorio inducido por un tratamiento con un DICO fue muy similar a los resultados obtenidos con

10 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ un CIDR. Este trabajo demuestra que ambos dispositivos utilizados durante 14 días inducen una misma respuesta en ovejas cíclicas. Tabla 1. Características del folículo ovulatorio inducido por el tratamiento durante 14 días con un DICO o con un CIDR-G en ovejas cíclicas. Intervalo (hs) al estro* Intervalo (hs) a la ovulación* Tasa ovulatoria Diámetro (mm) folículo ovulatorio P= 0,15 0,23 0,50 0,52 0,32 *desde el retiro del dispositivo h) CONCLUSION En conclusión, este trabajo demuestra que la concentración de progesterona, el inicio del estro y el momento ovulatorio inducido por un DICO no es diferente a los resultados obtenidos con un CIDR. La concentración de progesterona se mantiene en valores similares para ambos dispositivos durante todo el tratamiento y el momento ovulatorio ocurre aproximadamente a las horas de retirado el dispositivo. B2) EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS CORTOS UTILIZANDO UN DICO a) OBJETIVO Evaluar la respuesta ovárica a un Tratamiento Corto (descrito por Rubianes & Menchaca, 2003) utilizando un DICO asociado a la administración de ecg (gonadotrofina coriónica equina) como alternativa para sincronizar la ovulación y permitir así la posible aplicación de programas de Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (IATF). b) ANIMALES Se utilizaron 15 ovejas Corriedale adultas con 41,9 ± 3,6 kg (media ± DS) de peso vivo y una condición corporal de 3,8 ± 0,6 que fueron manejadas de acuerdo a la metodología descrita en el literal B1c. c) TRATAMIENTOS EXPERIMENTALES El ciclo estral fue presincronizado y evaluada la presencia de estro de acuerdo a la metodología descrita en el literal B1d. Un grupo experimental (DICO, n=7) recibió un Tratamiento Corto mediante un dispositivo por 6 días + una dosis de PGF2 alfa (75 μg de D cloprostenol, Ciclase, Syntex, Buenos Aires, Argentina) por vía intramuscular al momento del retiro del dispositivo. Otro grupo (DICO + ecg, n=8) recibió el mismo Tratamiento Corto asociado a una dosis de 350 UI de ecg (Novormon, Syntex, Buenos Aires, Argentina) por vía intramuscular al momento de retirar el dispositivo. d) OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS SANGUÍNEAS Las muestras se tomaron y procesaron como fue descrito en A1e y A1f. Días de vida a la ovulación DICO 34,5 ± 2,8 60,0 ± 9,1 1,3 ± 0,5 7,0 ± 0,8 8,6 ± 2,2 CIDR 30,0 ± 7,7 54,9 ± 6,4 1,4 ± 0,5 7,3 ± 1,1 10,0 ± 2,9 e) SEGUIMIENTO OVÁRICO POR ULTRASONOGRAFÍA La dinámica folicular y las características del folículo ovulatorio fue monitoreado y los datos procesados de acuerdo a la metodología descrita en el literal B1f.

11 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ f) RESULTADOS La Tabla 2 muestra que el momento ovulatorio inducido por un Tratamiento Corto con un DICO asociado a ecg permitió un adelanto en el momento ovulatorio comparado con las ovejas que no recibieron ecg. De manera similar el inicio del estro ocurrió antes en las ovejas tratadas con ecg. Tabla 2. Respuesta estral y ovulatoria con el uso de 350 UI de ecg luego de un Tratamiento Corto durante 6 días con un DICO en ovejas cíclicas. Todos los animales recibieron una dosis de un análogo de PGF2 alfa al momento del retiro del dispositivo. Intervalo (hs) al estro* Intervalo (hs) a la ovulación* Tasa ovulatoria Diámetro (mm) folículo ovulatorio Días de vida a la ovulación DICO 46,3 ± 5,7 a 73,7 ± 4,5 a 1,1 ± 0,4 a 6,3 ± 0,4 a 5,8 ± 0,7 a DICO+eCG 36,0 ± 6,4 b 63,0 ± 5,3 b 1,1 ± 0,4 a 6,5 ± 0,8 a 7,2 ± 1,9 a Para diferentes superíndices, P< 0,01. La Figura 5 muestra la concentración sérica de progesterona en ambos grupos experimentales. Como era de esperar ambos grupos mostraron concentraciones de progesterona muy similares entre sí ya que el tratamiento fue el mismo hasta el retiro del dispositivo. progesterona (ng/ml) DICO DICO+eCG h h ,5 7 7,5 Días Figura 5. Media (± error estándar) de la concentración sérica de progesterona en ovejas cíclicas tratadas durante 6 días con un dispositivo intravaginal de progesterona DICO. Día 0 momento de inserción del dispositivo y Día 6 momento del retiro del mismo. Al momento del retiro del dispositivo todos los animales recibieron una dosis de PGF2 alfa y un grupo recibió una dosis de ecg (Grupo DICO+eCG). g) CONCLUSION El uso de ecg asociado al Tratamiento Corto con un DICO adelantó el inicio del estro y el momento ovulatorio en ovejas cíclicas. El estro fue inducido a las 36 horas y la ovulación ocurrió a las 63 horas de retirado el DICO y administrada la ecg. Referencias Garófalo E; Tasende C Uterine oestrogen and progesterone receptors in prepubertal ewes: distribution in myometrium, endometrium and caruncles. Veterinary Research 27:

12 E Rubianes & A Menchaca NFORME FINAL DICO Convenio FisRep-Syntex 1/8/ Rubianes E; Menchaca A The pattern and manipulation of ovarian follicular growth in goats. Animal Reproduction Science 78:

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