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2 References 1. Todd, E.W. Antigenic Streptococcal Hemolysin. J. Exp. Med. 55: , Klein, G.C. Immune response to streptococcal infection. In: Manual of Clinical Immunology. Chapter 33. American Society for Microbiology. Washington, D.C Kalbak, K. The Antistreptolysin Reaction. The State Serum Institute. Denmark, Klein, G.C., Baker, C.N. and Moody, M.D. Comparison of Antistreptolysin-O Latex Screening Test with the Antistreptolysin-O Hemolytic Test. Applied Microbiology. 19: 60-61, Klein, G.C., Baker, C.N. and Jones, W.L. "Upper limits of Normal" Antistreptolysin-O and Antideoxyribonuclease B Titers. Applied Microbliology. 21: , Rantz, L.A. and Randall, E.A. Modification of the Technic for Determination of the Antistreptolysin Titer. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 59: 22-25, Hodge, B.E. and Swift, H.F. Varying Hemolytic and Constant Combining Capacity of Streptolysins; Influence on Testing for Antistreptolysins. J. Exp. Med. 58: , Spaun, J., Bentzon, M.W., Larsen, S.O. and Hewitt, L.F. International Standard for Antistreptolysin-O. Bull. WHO. 24: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC/NIH manual, 4th edition, rheumajet ASO Rapid test for the qualitative and semiquantitative determination of the antistreptolysin-o titer in serum by agglutination of latex particles on slide. Measurement of antistreptolysin-o in serum aids in the diagnosis of group A streptococcal infections. Summary The group A ß-hemolytic streptococci produces various toxins that can act as antigens. One of these exotoxins is streptolysin-o that was discovered by Todd in 1932 (1). A person infected with group A ß-hemolytic streptococci produces specific antibodies against these exotoxins, one of which is antistreptolysin-o. An elevated level of antistreptolysin-o is an indication of a recent infection with group A ß-hemolytic streptococci and can be an aid in the diagnosis of acute rheumatic fever and post-streptococcal glomerulonephritis (2). The usual procedure for the determination of the antistreptolysin titer is based on the inhibitory effect that the patient s serum produces on the hemolytic power of a pretitrated and reduced streptolysin-o (2-6). However the antigen-antibody reaction occurs independently of the hemolytic activity of streptolysin-o (7). This property enables the establishment of a qualitative and semiquantitative test for the determination of the antistreptolysin-o by agglutination of latex particles on slide. Principle The latex reagent is a suspension of polystyrene latex particles of uniform size coated with recombinant streptolysin-o. Latex particles allow visual observation of the antigen-antibody reaction. If the reaction takes place, due to the presence of antistreptolysin-o in the serum, the latex suspension changes its uniform appearance and a clear agglutination becomes evident. This change occurs because the antistreptolysin-o present in the serum reacts with the streptolysin-o coated to the latex particles, starting the formation of a web between them. When the latex reagent is mixed with the serum, if the serum contains abnormally high levels of antistreptolysin-o, a clear agglutination will appear. Results are expressed in IU/ml of antistreptolysin-o based on the WHO International Standard (8). Components REF a) Latex reagent: 2 x 2.5 ml. Suspension of polystyrene latex particles coated with recombinant streptolysin-o, in a buffer. Contains < 0.1% sodium azide. b) Positive control: 1 x 1.5 ml. Diluted rabbit serum containing more than 200 IU/ml of antistreptolysin-o. Ready to use. Contains < 0.1% sodium azide. c) Negative control: 1 x 1.5 ml. Diluted human serum containing less than 100 IU/ml of antistreptolysin-o. Ready to use. Contains < 0.1% sodium azide. d) Disposable slides: 18 units (x6). BIOKIT, S.A Lliçà d Amunt BARCELONA - SPAIN 01/08 24 Precautions rheumajet ASO is intended for IN VITRO diagnostic use. The reagents contain sodium azide as a preservative. Azides may react with metal plumbing forming explosive components. Upon disposal, please flush abundantly with water. Each donor unit used in the preparation of the negative control of this kit was tested by an FDA approved method for the presence of HIV 1/2 and HCV antibodies, as well as for HBsAg and found to be negative. WARNING: POTENTIALLY BIOHAZARDOUS MATERIAL. Because no test method can offer complete assurance of the absence of infectious agents, the reagents should be handled carefully (9). Dispose all used materials in a suitable biohazardous waste container. 1

3 Storage The reagents will remain stable until the expiration date shown on the label, if stored between 2-8 C. Do not freeze. The reagents can be damaged by improper handling, especially in extreme temperatures. Checking with the positive and negative controls provided will permit detection of reagent deterioration. The latex reagent, once shaken, must be uniform without visible clumping. When stored a slight sedimentation may occur and should be considered normal. The reagent and the controls contain preservatives, but are still susceptible to contamination. Handle with the normal precautions. The reagent dropper dispenses drops of 50 µl ± 10%. The dropper must be held perpendicular to the slide surface and a single drop allowed to fall. Do not use another dropper without previously checking the volume of the drop. Material required not provided Normal saline (0.9% NaCl, only for semiquantitative test), automatic pipettes, rotator, stirrers and timer. Sample collection Use fresh serum. Samples can be stored at 2-8 C for 8 days. For longer periods, samples should be frozen (-20 C). It is not necessary to inactivate the serum. As in all serological tests, hemolytic, lipemic or turbid sera may cause incorrect results and should not be used. Do not use plasma. Procedure Quality control: Before performing a set of determinations it is advisable to test the latex reagent with each of the controls included in the kit, following the steps outlined in the section QUALITATIVE TEST. The reaction between the positive control and the reagent should show a clear agglutination different from the uniform appearance of the negative control. If these results are not obtained, do not use the kit. To assure proper delivery of the reagent, the reagent dropper must be held vertically and a single drop allowed to fall. Características funcionais O reativo rheumajet ASO foi avaliado (nível de detecção de 200 UI/ml) por comparação com um reativo de látex comercializado. Foram analisadas 170 amostras de soro utilizando a técnica qualitativa, obtendo-se uma concordância de 95,9% entre os dois testes (96,7% de sensibilidade e 95,4% de especificidade). Os soros discrepantes foram analisados utilizando um outro reativo de látex comercializado, obtendo-se então uma sensibilidade de 98,4% e uma especificidade de 98,1%, com uma concordância total de 98,2%. Para estudar a reprodutibilidade do reativo, 3 pessoas diferentes testaram diluições duplas seriadas de uma amostra forte em 5 dias diferentes, 2 vêzes ao dia. Os resultados do estudo demonstraram uma reprodutibilidade dos resultados (± uma diluição) de 100%. Bibliografia Veja "References" no fim deste folheto. QUALITATIVE TEST 200 IU/ml detection level 1. Allow the reagents and samples to reach room temperature (20-30 C). 2. Place 50 µl of the sample (or one drop of control) onto one section of the slide. 3. Shake the reagent vial and add one drop of reagent next to the drop of sample. 4. Mix both drops with a stirrer covering the whole surface of the slide section. 5. Rotate the slide for 2 minutes manually or on a rotary shaker set at rpm. 6. Observe for agglutination. 100 IU/ml detection level 1. Allow the reagents and samples to reach room temperature (20-30 C). 2. Place 100 µl of the sample (or two drops of control) onto one section of the slide. 3. Shake the reagent vial and add one drop of reagent next to the drop of sample. 4. Mix both drops with a stirrer covering the whole surface of the slide section. 5. Rotate the slide for 4 minutes manually or on a rotary shaker set at rpm. 6. Observe for agglutination. Interpretation of the results 200 IU/ml detection level The presence of agglutination indicates a content of antistreptolysin-o in the serum equal to or greater than 200 IU/ml. The absence of agglutination indicates a content of antistreptolysin-o in the serum of less than 200 IU/ml. 100 IU/ml detection level The presence of agglutination indicates a content of antistreptolysin-o in the serum equal to or greater than 100 IU/ml. The absence of agglutination indicates a content of antistreptolysin-o in the serum of less than 100 IU/ml. POSITIVE REACTIONS: 3+ Large clumping with clear background. 2+ Moderate clumping with fluid slightly opaque in background. 1+ Small clumping with opaque fluid in background. NEGATIVE REACTIONS: No visible clumping, uniform suspension. 2 23

4 Nível de detecção de 100 UI/ml A presença de aglutinação indica uma concentração de antiestreptolisina-o no soro igual ou superior a 100 Ul/ml. A ausência de aglutinação indica uma concentração de antiestreptolisina-o no soro inferior a 100 Ul/ml. REAÇÕES POSITIVAS: 3+ Agregados grandes sobre fundo transparente. 2+ Agregados moderados sobre fundo ligeiramente opaco. 1+ Agregados finos sobre fundo opaco. REAÇÕES NEGATIVAS: Ausência de agregados, suspensão uniforme. TESTE SEMI-QUANTITATIVO 1. Colocar 50 µl de solução salina em cada uma das seções 2 a 6 da lâmina. 2. Com uma pipeta automática, colocar 50 µl de soro nas seções 1 e 2 da lâmina. 3. Com a mesma pipeta, aspirar e expulsar várias vezes o soro e a solução salina contidos na seção 2 até conseguir uma boa mistura. 4. Tomar 50 µl da mistura obtida na seção 2 e transferir para a seção Realizar as mesmas operações descritas anteriormente para conseguir a mistura correta dos reativos até a seção 6, devendo-se desprezar 50 µl. 6. Testar cada diluição tal como se descreve na seção TESTE QUALITATIVO. Seção Salina µl Soro µl Misturar e transferir µl Diluição 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Ul/ml Interpretação dos resultados O título aproximado corresponderá à diluição mais alta do soro que ainda apresente aglutinação claramente visível. Limitações do procedimento A leitura dos resultados deve ser efetuada aos 2 minutos (4 minutos no nível de detecção de 100 UI/ml) após o início da reação. Exceder este período de tempo pode levar a uma incorreta interpretação dos resultados. O grau de aglutinação não é necessariamente indicativo da concentração relativa de antiestreptolisina-o. Quando a concentração de antiestreptolisina-o é superior a 1500 UI/ml (750 UI/ml no nível de detecção de 100 UI/ml) podem ocorrer reações mais fracas devido ao excesso de anticorpos. Se há suspeita de concentrações de antiestreptolisina-o acima de 2000 UI/ml (1000 UI/ml no nível de detecção de 100 UI/ml) as amostras devem ser diluídas. Um título elevado de antiestreptolisina-o é útil no diagnóstico de infeccção por estreptococo do grupo A e suas seqüelas, como febre reumática aguda e glomérulo nefrite pós-estreptococo. Embora se haja confirmado um aumento do título de antiestpreptolisina-o em 80 a 85% dos pacientes, a obtenção de um resultado negativo não deve excluir o diagnóstico (2). Valores previstos Embora os valores normais possam variar segundo a idade, estação do ano e área geográfica (2), o limite superior normal é de 100 Ul/ml de antiestreptolisina-o em crianças em idade pré-escolar e de 166 a 250 Ul/ml em crianças em idade escolar ou jovens adultos (5). Em qualquer caso, a média pode ser estabelecida em aproximadamente 200 Ul/ml. Por causa desta variação, títulos acima do limite superior podem ser indicativos de uma infecção estreptocócica mas só serão considerados significativos aumentos de título de duas ou mais diluições entre duas amostras diferentes, de fase aguda e convalescente (2). Após um processo de infecção estreptocócica aguda, o título de antiestreptolisina-o se eleva transcorrida uma semana, alcança um nível máximo depois de 3 a 5 semanas, e torna, na maioria dos casos, aos níveis prévios ao aparecimento da infecção de 6 a 12 meses mais tarde (2). SEMIQUANTITATIVE TEST 1. Place 50 µl of normal saline onto slide sections 2 through Using an automatic pipette, place 50 µl of the serum onto slide sections 1 and Using the same pipette take in and release the serum and the saline solution on section 2 several times until they are well mixed. 4. Take 50 µl of the mixture made on section 2 and transfer it to section Repeat the aforementioned operations to obtain a thorough mixing of reagents, through section 6 thereafter discarding 50 µl. 6. Test each dilution as described in the section QUALITATIVE TEST. Section Saline µl Serum µl Mix and transfer µl Dilution 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 IU/ml Interpretation of the results The approximate titer will correspond to the highest serum dilution that still presents a clearly visible agglutination. Limitations of the procedure Reading of the results should be done at 2 minutes (4 minutes at the 100 IU/ml detection level) from the beginning of the reaction. A reading obtained after this period of time may give false positive results. The strength of agglutination is not necessarily indicative of relative antistreptolysin-o concentration. When antistreptolysin-o concentration exceeds 1500 IU/ml (750 IU/ml in the 100 IU/ml detection level), weak reactions may occur due to antibody excess. If concentrations higher than 2000 IU/ml are suspected (1000 IU/ml in the 100 IU/ml detection level), samples should be diluted. An elevated antistreptolysin-o titer is used as a laboratory aid in the detection of group A streptococcal infections and their sequellae, acute rheumatic fever and post-streptococcal glomerulonephritis. Although a rise in the antistreptolysin-o titer is noted in 80 to 85% of patients, the diagnosis should not be excluded because of a negative test (2). Expected values Although normal values can vary with age, season of the year and geographical area (2), the "upper limit of normal" antistreptolysin-o titers for preschool children is less than 100 IU/ml, and in school age children or young adults is usually between 166 and 250 IU/ml (5). In any case, the average can be established at less than 200 IU/ml. Because of this variation, titers above the upper limits may be indicative of a streptococcal infection, but only a two or more dilution rise in titer between acute and convalescent stage specimens should be considered significant (2). Following acute streptococcal infection, the antistreptolysin-o titer will usually rise after one week, increasing to a maximum level within 3 to 5 weeks and usually returning to the preinfection levels in approximately 6 to 12 months (2). Performance characteristics rheumajet ASO was evaluated (200 IU/ml detection level) by comparison with a commercially available latex test. A total of 170 serum samples were tested following the qualitative technique. This study demonstrated a 95.9% agreement between the tests (sensitivity 96.7% and specificity 95.4%). Discrepancies were resolved with another commercially available latex test, and the obtained sensitivity was 98.4% and the specificity 98.1%, with an overall agreement of 98.2% To study the reproducibility of the reagent, three different people tested double dilutions of a strong sample on five different days, twice every day. The results of the study indicate that the reagent in-house reproducibility of the results (within one dilution) was 100%. References See "References" at the end of the package insert. 22 3

5 rheumajet ASO Test rápido para la determinación cualitativa y semicuantitativa en suero del título de antiestreptolisina-o por aglutinación de partículas de látex en porta. La determinación de antiestreptolisina-o en suero ayuda en el diagnóstico de las infecciones por estreptococo del grupo A. Sumario El estreptococo ß-hemolítico del grupo A produce varias toxinas que pueden actuar como antígenos. Una de estas exotoxinas es la estreptolisina-o que fue descubierta por Todd en 1932 (1). El organismo afectado produce anticuerpos específicos contra dichas exotoxinas, destacando entre ellos la antiestreptolisina-o. Un nivel elevado de antiestreptolisina-o indica una infección reciente por estreptococo ß-hemolítico del grupo A y puede ser de ayuda en el diagnóstico de fiebre reumática aguda y de glomerulonefritis post-estreptocócica (2). El procedimiento clásico para la determinación del título de antiestreptolisina-o se basa en el efecto inhibitorio que el suero del enfermo tiene sobre el poder hemolítico de una estreptolisina-o previamente titulada y reducida (2-6). Sin embargo, la reacción antígeno-anticuerpo ocurre independientemente de la actividad hemolítica de la estreptolisina-o (7), lo que facilita el desarrollo de un test cualitativo y semicuantitativo para la determinación del título de antiestreptolisina-o por aglutinación de partículas de látex en portaobjetos. Principio El reactivo látex es una suspensión de partículas de látex de poliestireno de tamaño uniforme sensibilizadas con estreptolisina-o recombinante. Las partículas de látex ponen de manifiesto la reacción antígeno-anticuerpo. Si debido a la presencia de antiestreptolisina-o en el suero tiene lugar dicha reacción, la suspensión de látex pierde su aspecto uniforme haciéndose evidente una clara aglutinación. Ello se debe a que la antiestreptolisina-o presente en el suero, reacciona con la estreptolisina-o unida a las partículas de látex, iniciando la formación de una malla entre las mismas. Cuando se mezcla el reactivo látex con el suero, si el suero contiene niveles anormalmente altos de antiestreptolisina-o, se produce una clara aglutinación. Los resultados se expresan en UI/ml de antiestreptolisina-o de acuerdo con el Estándar Internacional de la OMS (8). Componentes REF a) Reactivo látex: 2 x 2,5 ml. Suspensión de partículas de látex de poliestireno sensibilizadas con estreptolisina-o recombinante, en un tampón. Contiene azida sódica < 0,1%. b) Control positivo: 1 x 1,5 ml. Suero de conejo diluido que contiene más de 200 UI/ml de antiestreptolisina-o. Listo para su uso. Contiene azida sódica < 0,1%. c) Control negativo: 1 x 1,5 ml. Suero humano diluido que contiene menos de 100 UI/ml de antiestreptolisina-o. Listo para su uso. Contiene azida sódica < 0,1%. d) Portaobjetos desechables: 18 unidades (x6). Precauciones rheumajet ASO es sólo para el diagnóstico IN VITRO. Los reactivos contienen azida sódica como conservante. Las azidas pueden reaccionar con tuberías y desagües metálicos dando lugar a compuestos explosivos. Al tirar los restos de reactivos, dejar correr agua suficiente. Todo el material de origen humano usado en la preparación del control negativo de este kit ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV 1/2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la hepatitis B, por un método aprobado por la FDA. ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Ya que ningún método puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, los reactivos deben ser manejados con precaución (9). Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. 4 Conservação Os reativos permanecem estáveis até a data de validade indicada na etiqueta, se forem conservados entre 2-8 C. Não congelar. Os reativos podem deteriorar-se se forem armazenados indevidamente, especialmente se forem submetidos a temperaturas extremas. Um teste com os controles positivo e negativo incluídos no kit, permite detectar possíveis alterações. O reativo látex, uma vez agitado, deve apresentar um aspecto homogêneo. Após um período de armazenamento, pode aparecer uma ligeira sedimentação que deve ser considerada normal. O reativo e os controles contêm conservantes, mas apesar disto são susceptíveis de contaminação. Manipular com as precauções habituais. O conta-gotas do reativo dispensa gotas de 50 µl ± 10%. O conta-gotas deve ser colocado em posição perpendicular à superfície da lâmina e deixar cair apenas uma gota. Não utilizar conta-gotas diferente daquele que acompanha o kit, sem antes verificar o tamanho da gota. Material necessário não incluído Solução salina (NaCl 0,9%, somente para a teste semi-quantitativo), pipetas automáticas, agitador rotatório, palitos de madeira e cronômetro. Coleta da amostra Usar soro fresco. As amostras podem ser conservadas por 8 dias entre 2-8 C. Para guardar por um período de tempo mais longo as amostras devem ser congeladas (-20 C). Não é necessário inativar o soro. Como em todos os exames sorológicos, os soros lipêmicos, hemolizados ou turvos podem apresentar resultados pouco fiáveis e não devem ser utilizados. Não utilizar plasma. Procedimento Controle de qualidade: Antes de efetuar uma série de determinações é aconselhável testar o reativo látex com cada um dos controles, incluídos no kit. Os controles devem ser testados seguindo-se o TESTE QUALITATIVO. A reação entre o controle positivo e o reativo deve dar uma clara aglutinação, diferente da aparência uniforme do controle negativo. Se estes resultados não são obtidos, não utilize o kit. Para assegurar uma correta dosagem do reativo o conta-gotas deve ser colocado verticalmente e deixar cair apenas uma gota. TESTE QUALITATIVO Nível de detecção de 200 UI/ml 1. Deixar que o reativo e as amostras alcance a temperatura ambiente (20-30 C). 2. Colocar 50 µl de amostra (ou uma gota de controle) em uma das seções da lâmina. 3. Agitar o frasco do reativo e colocar uma gota do reativo junto à gota de amostra. 4. Misturar ambas gotas com um palito, cobrindo-se toda a superfície da seção da lâmina. 5. Agitar a lâmina com um suave movimento de rotação, seja manualmente ou com um agitador rotatório ( rpm), durante 2 minutos. 6. Observar a presença ou ausência de aglutinação. Nível de detecção de 100 UI/ml 1. Deixar que o reativo e as amostras alcance a temperatura ambiente (20-30 C). 2. Colocar 100 µl de amostra (ou duas gotas de controle) em uma das seções da lâmina. 3. Agitar o frasco do reativo e colocar uma gota do reativo junto à gota de amostra. 4. Misturar ambas gotas com um palito, cobrindo-se toda a superfície da seção da lâmina. 5. Agitar a lâmina com um suave movimento de rotação, seja manualmente ou com um agitador rotatório ( rpm), durante 4 minutos. 6. Observar a presença ou ausência de aglutinação. Interpretação dos resultados Nível de detecção de 200 UI/ml A presença de aglutinação indica uma concentração de antiestreptolisina-o no soro igual ou superior a 200 Ul/ml. A ausência de aglutinação indica uma concentração de antiestreptolisina-o no soro inferior a 200 Ul/ml. 21

6 rheumajet ASO Teste rápido para determinação qualitativa e semi-quantitativa de antiestreptolisina-o em soro, por aglutinação de partículas de látex em lâmina. A determinação de antiestreptolisina-o em soro ajuda no diagnóstico das infecções por estreptococo do grupo A Sumário O estreptococo ß-hemolítico do grupo A produz várias toxinas que podem atuar como antígenos. Uma destas exotoxinas é a estreptolisina-o que foi descoberta por Todd em 1932 (1). O organismo afetado produz anticorpos específicos contra as mencionadas exotoxinas, dentre os quais podemos destacar o anticorpo antiestreptolisina-o. Um nível alto de antiestreptolisina-o indica uma infecção recente por estreptococo ß-hemolítico do grupo A e pode ser útil no diagnóstico de febre reumática aguda e de glomerulonefrite pós-estreptocócica (2). O procedimento clássico para a determinação do título de antiestreptolisina-o, está baseado no efeito inibidor que o soro do paciente tem sobre o poder hemolítico da estreptolisina-o, previamente titulada e reduzida (2-6). No entanto, a reação antígeno-anticorpo sucede independentemente da atividade hemolítica da estreptolisina-o (7), o que facilita o desenvolvimento de um teste qualitativo e semiquantitativo para a determinação de antiestreptolisina-o por aglutinação de partículas de látex em lâmina. Princípio O reativo látex é uma suspensão de partículas de látex de poliestireno de tamanho uniforme recobertas com estreptolisina-o recombinante. As partículas de látex permitem visualizar a reação antígeno-anticorpo. Se a antiestreptolisina-o está presente no soro sucederá a mencionada reação e a suspensão de látex perderá seu aspecto homogêneo, evidenciando-se uma clara aglutinação. Isto acontece porque a antiestreptolisina-o presente no soro reage com a estreptolisina-o unida às partículas de látex, iniciando-se a formação de uma malha entre as mesmas. Quando o reativo látex se mistura com o soro, se o soro contiver níveis anormalmente altos de antiestreptolisina-o, ocorrerá uma clara aglutinação. Os resultados são expressos em Ul/ml de antiestreptolisina-o com base no Padrão Internacional da OMS (8). Componentes REF a) Reativo látex: 2 x 2,5 ml. Suspensão de partículas de látex de poliestireno recobertas com estreptolisina-o recombinante, em um tampão. Contém azida sódica < 0,1%. b) Controle positivo: 1 x 1,5 ml. Soro de coelho diluído que contém mais de 200 UI/ml de antiestreptolisina-o. Pronto para uso. Contém azida sódica < 0,1%. c) Controle negativo: 1 x 1,5 ml. Soro humano diluído que contém menos de 100 UI/ml de antiestreptolisina-o. Pronto para uso. Contém azida sódica < 0,1%. d) Lâminas descartáveis: 18 unidades (x6). Precauções rheumajet ASO é para o diagnóstico IN VITRO. Os reativos deste kit contém azida sódica como conservante. A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre, originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao descartar os restos de reativos, fazê-lo em abundante volume de água. Todo o material de origem humana utilizado na preparação do controle negativo deste kit fora testado e apresentara resultado negativo para a presença de anticorpos contra os vírus HIV 1/2 e hepatite C como também para o antígeno de superfície da hepatite B, utilizando um método aprovado pelo FDA. ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Dado que nenhum método pode oferecer a total segurança da ausência de agentes infecciosos, os reativos deste kit devem ser manipulados com cuidado (9). Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. 20 Conservación Los reactivos permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8 C. No congelar. Los reactivos pueden deteriorarse por almacenamiento indebido, especialmente a temperaturas extremas. La comprobación con los controles positivo y negativo incluidos en el kit, permitirá detectar posibles alteraciones. El reactivo látex, una vez agitado, debe presentar un aspecto uniforme. Después de un período de almacenamiento puede aparecer una ligera sedimentación que debe considerarse normal. El reactivo y los controles contienen conservantes, pero a pesar de ello son susceptibles de contaminación. Manejar con las precauciones habituales. El gotero del reactivo dispensa gotas de 50 µl ± 10%. El gotero debe colocarse perpendicular a la superficie del porta y dejar caer una gota libremente. No usar otro gotero distinto al suministrado, sin comprobar el tamaño de la gota. Material necesario no incluido Solución salina (0,9% NaCl, sólo para el test semicuantitativo), pipetas automáticas, agitador rotatorio, palillos mezcladores y cronómetro. Recolección de la muestra Usar suero fresco. Las muestras pueden ser conservadas durante 8 días entre 2-8 C. Si es por un período de tiempo más largo las muestras deben ser congeladas (-20 C). No es necesario inactivar el suero. Como en todas las pruebas serológicas, los sueros hemolizados, lipémicos o turbios pueden causar resultados incorrectos y no deben utilizarse. No utilizar plasma. Procedimiento Control de calidad: Antes de realizar una serie de determinaciones es aconsejable controlar el reactivo látex con cada uno de los controles incluidos en el kit. Ambos controles deberán utilizarse siguiendo los pasos descritos para el TEST CUALITATIVO. La reacción entre el control positivo y el reactivo debe dar una clara aglutinación distinta de la apariencia uniforme del control negativo. Si no se obtienen dichos resultados, no utilice el kit. De cara a asegurar una correcta dosificación del reactivo, el gotero debe colocarse verticalmente y dejar caer una sola gota libremente. TEST CUALITATIVO Nivel de detección de 200 UI/ml 1. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente (20-30 C). 2. Dosificar 50 µl de muestra (o una gota de control) en una de las secciones del portaobjetos. 3. Agitar el vial del reactivo y añadir una gota del reactivo junto a la gota de muestra. 4. Mezclar ambas gotas con un palillo cubriendo toda la superficie de la sección del portaobjetos. 5. Agitar el portaobjetos con un suave movimiento de rotación ya sea manualmente o en un agitador rotatorio ( rpm) durante 2 minutos. 6. Observar la presencia o ausencia de aglutinación. Nivel de detección de 100 UI/ml 1. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente (20-30 C). 2. Dosificar 100 µl de muestra (o dos gotas de control) en una de las secciones del portaobjetos. 3. Agitar el vial del reactivo y añadir una gota del reactivo junto a la gota de muestra. 4. Mezclar ambas gotas con un palillo cubriendo toda la superficie de la sección del portaobjetos. 5. Agitar el portaobjetos con un suave movimiento de rotación ya sea manualmente o en un agitador rotatorio ( rpm) durante 4 minutos. 6. Observar la presencia o ausencia de aglutinación. Interpretación de los resultados Nivel de detección de 200 UI/ml La presencia de aglutinación indica un contenido de antiestreptolisina-o en el suero igual o superior a 200 UI/ml. La ausencia de aglutinación indica un contenido de antiestreptolisina-o en el suero inferior a 200 UI/ml. 5

7 Nivel de detección de 100 UI/ml La presencia de aglutinación indica un contenido de antiestreptolisina-o en el suero igual o superior a 100 UI/ml. La ausencia de aglutinación indica un contenido de antiestreptolisina-o en el suero inferior a 100 UI/ml. REACCIONES POSITIVAS: 3+ Agregados grandes sobre fondo transparente. 2+ Agregados moderados sobre fondo ligeramente opaco. 1+ Agregados finos sobre fondo opaco. REACCIONES NEGATIVAS: Ausencia de agregados, suspensión uniforme. TEST SEMICUANTITATIVO 1. Dosificar 50 µl de solución salina en cada una de las secciones 2 a 6 del portaobjetos. 2. Dosificar con una pipeta automática 50 µl de suero en las secciones 1 y 2 del portaobjetos. 3. Con la misma pipeta aspirar y expulsar varias veces el suero y la solución salina contenidas en la sección 2 hasta lograr una buena mezcla. 4. Tomar 50 µl de la mezcla realizada en la sección 2 y transferirlos a la sección Realizar las mismas operaciones descritas anteriormente para lograr la mezcla correcta de los reactivos hasta la sección 6 y desechar entonces 50 µl. 6. Comprobar cada dilución como está descrito en el apartado TEST CUALITATIVO. Caratteristiche di funzionalità Il reagente rheumajet ASO è stato analizzato (livello di determinazione di 200 UI/ml) mediante confronto con un altro reagente di lattice reperibile in commercio. Complessivamente, sono stati inclusi nello studio 170 campioni di siero utilizzando il test qualitativo: la percentuale di risultati analoghi è stata del 95,9% (96,7% di sensibilità e 95,4% di specificità). I sieri non concordanti sono stati analizzati di nuovo con un altro reagente di lattice reperibile in commercio: si sono avuti risultati di sensibilità del 98,4% e di specificità del 98,1%, per una concordanza complessiva dei risultati pari al 98,2%. Per esaminare la riproducibilità del reagente, 3 persone diverse hanno verificato diluizioni in doppio seriate di un campione dal titolo elevato, effettuando misure duplici per 5 giorni diversi. Il risultato della ricerca indica che il reagente mostra una riproducibilità dei risultati (± una diluizione) del 100%. Bibliografia Vedi "References" alla fine del prospetto. Sección Salina µl Suero µl Mezclar y transferir µl Dilución 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Ul/ml Interpretación de los resultados El título aproximado corresponderá al de la dilución más alta de suero que aún presente aglutinación claramente visible. Limitaciones del procedimiento La lectura de resultados debe efectuarse a los 2 minutos (4 minutos en el nivel de detección de 100 UI/ml) de haberse iniciado la reacción. El exceder este tiempo puede inducir a la interpretación errónea de los mismos. El grado de aglutinación no es necesariamente indicativo de la concentración de antiestreptolisina-o. Cuando la concentración de antiestreptolisina-o sea superior a 1500 UI/ml (750 UI/ml en el nivel de detección de 100 UI/ml), pueden observarse reacciones más débiles debido al exceso de anticuerpos. Si se sospechan concentraciones de antiestreptolisina-o superiores a 2000 UI/ml (1000 UI/ml en el nivel de detección de 100 UI/ml), las muestras deben diluirse. Un título elevado de antiestreptolisina-o es útil para apoyar el diagnóstico de infección por estreptococo del grupo A y sus secuelas, fiebre reumática aguda y glomerulonefritis post-estreptocócica. Si bien se ha confirmado un aumento del título de antiestreptolisina-o en un 80 a 85% de los pacientes, la obtención de un resultado negativo no debe excluir el diagnóstico (2). Valores previstos Aunque los valores normales pueden variar con la edad, estación del año y área geográfica (2), el "límite superior normal" es de 100 UI/ml de antiestreptolisina-o en niños en edad pre-escolar y de 166 a 250 UI/ml en niños en edad escolar o adultos jóvenes (5). En cualquier caso el promedio puede establecerse en aproximadamente 200 UI/ml. Debido a esta variación, títulos por encima del límite superior pueden ser indicativos de una infección estreptocócica pero sólo se considerarán significativos incrementos de título de 2 o más diluciones entre dos muestras distintas de fase aguda y convaleciente (2). Después de una infección estreptocócica aguda, el título de antiestreptolisina-o se eleva al cabo de una semana, alcanzando un nivel máximo a las 3-5 semanas, para volver generalmente a los niveles previos a la infección, entre 6 y 12 meses más tarde (2). 6 19

8 Livello di determinazione di 100 UI/ml La presenza di agglutinazione indica un contenuto di antistreptolisina-o nel siero uguale o superiore a 100 Ul/ml. L'assenza di agglutinazione indica un contenuto di antistreptolisina-o nel siero inferiore a 100 Ul/ml. REAZIONI POSITIVE: 3+ Aggregati grandi su fondo trasparente. 2+ Aggregati moderati su fondo leggermente opaco. 1+ Aggregati fini su fondo opaco. REAZIONI NEGATIVE: Assenza di aggregati, sospensione omogenea. TEST SEMIQUANTITATIVO 1. Mettere 50 µl di soluzione salina nelle sezioni del vetrino da 2 a Com una pipetta automatica mettere 50 µl di siero nelle sezioni 1 e 2 del vetrino. 3. Con la stessa pipetta miscelare il siero con la salina nella sezione 2 fino ad ottenere una buona miscelazione. 4. Prendere 50 µl di questa miscela dalla sezione 2 e trasferirlo nella sezione Ripetere questa operazione fino alla sezione 6 per ottenere la corretta miscelazione dei reagenti. Scartare 50 µl dalla sezione Misurare ogni diluizione come descritto nella sezione TEST QUALITATIVO. Características funcionales El reactivo rheumajet ASO se evaluó (nivel de detección de 200 UI/ml) por comparación con un reactivo de látex ya comercializado. Se analizaron un total de 170 muestras de suero utilizando la técnica cualitativa, obteniéndose un 95,9% de concordancia entre ambos tests (96,7% de sensibilidad y 95,4% de especificidad). Los sueros discrepantes se reanalizaron utilizando otro reactivo de látex comercializado, obteniéndose entonces una sensibilidad de un 98,4% y una especificidad de un 98,1%, con una concordancia total de los resultados de un 98,2%. Para estudiar la reproducibilidad del reactivo, 3 personas distintas comprobaron diluciones dobles seriadas de una muestra de título elevado, por duplicado durante 5 días diferentes. El resultado de este estudio indica que el reactivo muestra una reproducibilidad de los resultados (± una dilución) del 100%. Bibliografía Ver "References" al final del folleto. Sezione Saline µl Siero μl Mescolare e trasferire µl Diluizione 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Ul/ml Interpretazione dei risultati Il titolo approssimativo corrisponderà alla diluizione di siero più alta che presenti ancora una chiara agglutinazione. Limitazioni della procedura La lettura dei risultati deve essere effettuata agli 2 minuti (4 minuti nel livello di determinazione di 100 UI/ml) di l'inizio della reazione. Trascorso questo tempo si possono avere interpretazioni erronee. Il grado di agglutinazione non è necessariamente indicativo della concentrazione di antistreptolisina-o. Se la concentrazione di antistreptolisina-o è superiore a 1500 Ul/ml (750 UI/ml nel livello di determinazione di 100 UI/ml), si possono osservare reazioni più deboli a causa dell'eccesso di anticorpi. Se si sospetta l'esistenza di concentrazioni di antistreptolisina-o superiori a 2000 Ul/ml (1000 UI/ml nel livello di determinazione di 100 UI/ml), occorre diluire i campioni. Un titolo elevato di antistreptolisina-o è utile per confermare diagnosi di infezione da streptococco del gruppo A e relative sequele, febbre reumatica acuta e glomerulonefrite post-streptococco. Sebbene sia stato confermato l'aumento del titolo di antistreptolisina-o nell'80-85% dei pazienti, il verificarsi di un risultato negativo non deve escludere la diagnosi (2). Valori attesi Sebbene i valori normali possono variare secondo l'età, la stagione e la zona geografica (2), il "limite superiore normale" è di 100 Ul/ml di antistreptolisina-o nei bambini in età prescolastica e da 166 a 250 Ul/ml nei bambini in età scolastica e negli adulti giovani (5). In ogni caso, la media può essere fissata attorno a un valore di 200 Ul/ml. Data questa variazione, i titoli sopra il limite superiore possono essere indicativi di un'infezione streptococcica ma, sol tanto si considerarano significativi si se dettecta un incremento di titolo di 2 diluizione o più fra i campioni in una fase acuta o convalescente (2). Dopo un'infezione streptococcica acuta, il titolo di antistreptolisina-o si eleva dopo una settimana e raggiunge il massimo livello dopo 3-5 settimane, e generalmente ridiscende ai valori precedenti all'infezione dopo 6-12 mesi (2). 18 7

9 rheumajet ASO Latex-Schnelltest auf Objektträgern zum qualitativen und semi-quantitativen Nachweis des Antistreptolysin O-Titers durch Agglutination von Latexpartikeln im Serum. Der Nachweis von Antistreptolysin-O im Serum hilft bei der Diagnose von Infektionen durch Streptokokken der Gruppe A. Zusammenfassung Der Gruppe A ß-hämolytische Streptokokke erzeugt verschiedene Toxine, die als Antigene wirken können. Eines dieser Exotoxine ist das Streptolysin-O, das 1932 von Todd entdeckt wurde (1). Der von dem Gruppe A ß-hämolytischen Streptokokken befallene Organismus bildet spezifische Antikörper gegen die erwähnten Exotoxine, wobei besonders das Antistreptolysin-O hervorzuheben ist. Ein hoher Wert an Antistreptolysin-O deutet auf eine kürzliche Infektion durch β-hämolysierende Streptokokken der Gruppe A hin und stellt eine Hilfe bei der Diagnose von akutem rheumatischem Fieber und von Glomerulonephritis als Streptokokken-Folgeerkrankung (2) dar. Das klassische Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysin-O-Titers beruht auf der Hemmwirkung, welche das Serum des Kranken auf das Hämolysevermögen des vorher bestimmten und reduzierten Streptolysins-O (2-6) hat. Die Antigen- Antikörper-Reaktion läuft jedoch unabhängig von der hämolytischen Aktivität des Streptolysins-O ab (7), was die Entwicklung eines qualitativen und semiquantitativen Tests zur Bestimmung des Antistreptolysin-O-Titers durch die Agglutination von Latexpartikeln auf Objektträgern begünstigt. Prinzip Das Latex-Reagenz ist eine Suspension aus Polystyrol-Latexpartikeln einheitlicher Gröβe, die mit rekombinanter Streptolysin-O beschichtet sind. Die Latexpartikel lassen die Antigen-Antikörper-Reaktion sichtbar werden. Wenn im Serum aufgrund von darin vorhandenem Antistreptolysin-O diese Reaktion stattfindet, verliert die Latexsuspension ihre Homogenität und es entsteht eine deutliche Agglutination. Dies ist darauf zurückzuführen, dass das im Serum vorhandene Antistreptolysin-O mit dem an die Latexpartikel gebundenen Streptolysin-O reagiert und eine Gitterstruktur zwischen beiden ausbildet. Wenn das Latex-Reagenz mit dem Serum vermischt wird und das Serum anormal hohe Werte an Antistreptolysin-O aufweist, entsteht eine deutliche Agglutination. Die Ergebnisse werden in IE/ml Antistreptolysin-O angegeben, basierend auf dem Internationalen WHO Standard (8). Bestandteile REF a) Latex Reagenz: 2 x 2,5 ml. Suspension mit rekombinanter Streptolysin-O beschichtete Latexpartikel, in Puffer. Enthält < 0,1% Natriumazid. b) Positive Kontrolle: 1 x 1,5 ml. Verdünntes Kaninchenserum mit > 200 IE/ml Antistreptolysin-O. Gebrauchsfertig. Enthält < 0,1% Natriumazid. c) Negative Kontrolle: 1 x 1,5 ml. Verdünntes, Humanserum mit < 100 IE/ml Antistreptolysin-O. Gebrauchsfertig. Enthält < 0,1% Natriumazid. d) Einmal-Objektträger: 18 Einheiten (x6). Vorsichtsmaßnahmen rheumajet ASO ist ausschließlich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Die Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann auf Blei- oder Kupfer-Rohrleitungen und -Abflüsse reagieren und zu hochexplosiven Metallaziden führen. Beim Entfernen der Reagenzreste muss mit genügend Wasser nachgespült werden. Das gesamte zur Herstellung der negativen Kontrolle dieses Kits verwendete Humanmaterial wurde mit einer von der FDA anerkannten Methode auf HBsAg, HIV 1/2 und HCV Antikörper untersucht und für negativ befunden. ACHTUNG: BIOLOGISCH GEFÄHRLICHES MATERIAL. Da keine Methode eine absolute Erregerfreiheit garantieren kann, müssen die Reagenzien mit Vorsicht gehandhabt werden (9). 8 Conservazione I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta, se conservati a 2-8 C. Non congelare. I reagenti si possono deteriorare per immagazzinaggio inappropriato, soprattutto in caso di temperature estreme. La verifica dei controlli, positivo e negativo, contenuti nel kit, permetterà di rilevare eventuali alterazioni. Il reagente lattice, una volta agitato, deve presentare un aspetto uniforme. Dopo un periodo d immagazzinaggio può apparire una leggera sedimentazione che si deve considerare normale. Il reagente e i controlli contengono conservati ma possono comunque venire contaminati. Usare quindi le normali precauzioni. Il contagocce del reagente dispensa gocce di 50 µl ± 10%. Il contagocce deve essere collocato perpendicolarmente alla superficie per vetrino e lasciar cadere liberamente una goccia. Non usare nessun contagocce diverso da quello fornito, senza verificare le dimensioni della goccia. Materiale necessario non incluso Soluzione salina (0,9% NaCl, solo per il test semiquantitativo), pipette automatiche, agitatore rotante, bastoncini miscelatori e cronometro. Raccolta dei campioni Usare siero fresco. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per non più di 8 giorni. Per tempi più lunghi devono essere congelati (-20 C). Non è necessario inattivare il siero. Come e tutte le prove sierologici, i sieri emolizzati, lipemici o torbidi possono dar luogo a risultati variabili e vanno perciò scartati. Non usare plasma. Procedura Controllo di qualità: Prima di fare un gruppo di determinazioni testare il reagente lattice con i controlli inclusi nel kit. Ogni controllo dovrebbe essere usato utilizzando il TEST QUALITATIVO. La reazione del controllo positivo con il reagente dovrebbe mostrare una chiara agglutinazione, diversa dall aspetto uniforme del controllo negativo. Se non si ottiene questo risultato, scartare il kit. Per garantire il giusto dosaggio del reagente, il dispensatore deve essere messo in posizione verticale. Deve essere dispensata una goccia alla volta. TEST QUALITATIVO Livello di determinazione di 200 UI/ml 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (20-30 C). 2. Mettere 50 µl di campione (o una goccia di controllo) in una sezione del vetrino. 3. Agitare il flacone di reagente e aggiungere una goccia di reagente vicino a quella del campione. 4. Miscelare entrambe le gocce con un agitatore utilizzando l intera superficie della sezione del vetrino. 5. Roteare manualmente il vetrino per 2 minuti oppure su un agitatore automatico a rpm. 6. Controllare la presenza o l assenza di agglutinazione. Livello di determinazione di 100 UI/ml 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (20-30 C). 3. Mettere 100 µl di campione (o due gocce di controllo) in una sezione del vetrino. 3. Agitare il flacone di reagente e aggiungere una goccia di reagente vicino a quella del campione. 4. Miscelare entrambe le gocce con un agitatore utilizzando l intera superficie della sezione del vetrino. 5. Roteare manualmente il vetrino per 4 minuti oppure su un agitatore automatico a rpm. 6. Controllare la presenza o l assenza di agglutinazione. Interpretazione dei risultati Livello di determinazione di 200 UI/ml La presenza di agglutinazione indica un contenuto di antistreptolisina-o nel siero uguale o superiore a 200 Ul/ml. L'assenza di agglutinazione indica un contenuto di antistreptolisina-o nel siero inferiore a 200 Ul/ml. 17

10 rheumajet ASO Test rapido per la determinazione qualitativa e semiquantitativa in siero di antistreptolisina-o mediante agglutinazione di particelle di lattice su vetrino. La determinazione di antistreptolisina-o in siero aiuta nella diagnosi delle infezioni da streptococco del gruppo A. Sommario Lo streptococco ß-emolitico del gruppo A produce varie tossine che possono agire come antigeni. Una di queste esotossine è la streptolisina-o, che fu scoperta da Todd nel 1932 (1). L'organismo invaso dallo streptococco ß-emolitico del gruppo A produce anticorpi specifici contro tali esotossine, tra i quali si distingue la antistreptolisina-o. Un alto livello di antistreptolisina-o indica un infezione recente da streptococco ß-emolitico del gruppo A e può essere di aiuto nella diagnosi della febbre reumatica acuta e della glomerulonefrite post-streptococcica (2). Il procedimento classico per la determinazione del titolo di antistreptolisina-o si basa sull'effetto inibitore che il siero del malato ha sul potere emolitico di una streptolisina-o previamente titolata e ridotta (2-6). Ciononostante, la reazione antigene-anticorpo avviene indipendentemente dall'attività emolitica della streptolisina-o (7), il che facilita la realizzazione di un test qualitativo e semiquantitativo per la determinazione del titolo di antistreptolisina-o mediante agglutinazione di particelle di lattice su vetrino. Principio Il reagente lattice è una sospensione di particelle di lattice di polistirene di dimensioni omogenee sensibilizzate con streptolisina-o ricombinante. Le particelle di lattice mettono in evidenza la reazione antigene-anticorpo. Se, per la presenza di antistreptolisina-o nel siero, si verifica tale reazione, la sospensione di lattice perde il suo aspetto omogeneo e si osserva una chiara agglutinazione. Ciò è dovuto al fatto che la antistreptolisina-o presente nel siero reagisce con la streptolisina-o unita alle particelle di lattice, dando inizio alla formazione di una maglia tra le stesse. Quando si mescola il reagente lattice con il siero, se il siero contiene livelli anormalmente elevati di antistreptolisina-o si verifica una chiara agglutinazione. I risultati sono espressi in UI/ml di antistreptolisina-o basati sullo Standard Internazionale dell OMS (8). Componenti REF a) Reagente lattice: 2 x 2,5 ml. Sospensione di particelle di lattice di polistirene sensibilizzate con streptolisina-o ricombinante, in un tampone. Contiene < 0,1% di sodio azide. b) Controllo positivo: 1 x 1,5 ml. Siero di coniglio diluito contenente più di 200 UI/ml di antistreptolisina-o. Pronto all'uso. Contiene < 0,1% di sodio azide. c) Controllo negativo: 1 x 1,5 ml. Siero umano diluito contenente meno di 100 UI/ml di antistreptolisina-o. Pronto all'uso. Contiene < 0,1% di sodio azide. d) Vetrini monouso: 18 unità (x6). Precauzioni rheumajet ASO è per uso diagnostico IN VITRO. I reagenti di questo kit contengono sodio azide come conservante. La sodio azide può reagire a contatto con tubature e scarichi metallici formando composti altamente esplosivi, perciò lavare abbondantemente con acqua le tubature. Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione del controllo negativo di questo kit è risultato, in base a metodi approvati dalla FDA, negativo per la ricerca di anticorpi anti-hiv 1/2, anti-hcv e HBsAg. ATTENZIONE: MATERIALE POTENZIALMENTE BIOPERICOLOSO. Comunque, poiché nessun metodo oggi conosciuto può garantire la totale assenza di agenti infettivi, ogni reagente del kit si deve trattare con cura (9). Depositare tutti i materiali utilizzati in recipienti idonei per materiale biocontaminante. 16 Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen. Lagerung Bei einer Lagerungstemperatur von 2-8 C bleiben die Reagenzien bis zum auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nicht einfrieren. Die Reagenzien können durch falsche Handhabung, insbesondere bei hohen Temperaturen, verderben. Durch Überprüfung mit den im Kit inbegriffenen, positiven und negativen Kontrollen können evtl. Beeinträchtigungen entdeckt werden. Das Latex-Reagenz muss nach dem Schütteln ein gleichmäßiges Aussehen aufweisen. Nach einer gewissen Lagerungsdauer kann sich eine leichte Ablagerung bilden, die als normal anzusehen ist. Die Reagenz und die Kontrollen enthalten Konservierungsmittel, sind aber weiterhin anfällig auf Kontamination. Mit den üblichen Vorsichtsmassnahmen handhaben. Das Tropfglas des Reagenzes gibt Tropfen zu 50 µl ± 10% ab. Das Tropfglas ist senkrecht zur Objektträgeroberfläche zu halten und ein einziger Tropfen aufzutragen. Es darf kein anderes als das mitgelieferte Tropfglas verwendet werden, ohne zuvor die Tropfengröße zu bestimmen. Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material Normale Kochsalzlösung (0,9% NaCl, nur für die semiquantitative Bestimmung), Automatik-Pipetten, Rotator, Rührstäbchen und Stoppuhr. Probenmaterial Frisches Serum benutzen. Die Seren bei 2-8 C zu lagern. Bei Lagerung über 8 Tagen sollten die Proben bei (-20 C) eingefroren werden. Ein Inaktivieren des Serums ist nicht erforderlich. Wie bei allen Serumtests können hämolysierte, lipämische oder trübe Seren zu falschen Ergebnissen führen und sollten nicht verwendet werden. Kein Plasma verwenden. Durchführung Qualitätskontrolle: Vor Durchführung der verschiedenen Bestimmungsstufen muss eine Überprüfung des Latexreagenz mit jeder der im Kit enthaltenen Kontrollen entsprechend der im Abschnitt QUALITATIVE BESTIMMUNG aufgeführten Schritte vorgenommen werden. Die Reaktion zwischen positiver Kontrolle und Reagenz muss eine eindeutige Agglutination zeigen, die sich von dem homogenen Aussehen der negativen Kontrolle unterscheidet. Andernfalls darf der Kit nicht verwendet werden. Um die richtige Abgabe der Tropfflasche sicherzustellen, muss diese senkrecht gehalten und ein einziger Tropfen fallengelassen werden. QUALITATIVE BESTIMMUNG Nachweisgrenze bei 200 IE/ml 1. Reagenzien und Proben vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen (20-30 C) µl der Probe (oder einen Tropfen der Kontrolle) auf eines der Objektträgertestfelder bringen. 3. Reagenzflasche schütteln und 1 Tropfen Latexreagenz neben den Tropfen der Probe geben. 4. Beide Tropfen mit einem Stäbchen gut mischen und auf der ganzen Testfeldoberfläche verteilen. 5. Objektträger leicht per Hand oder auf dem Rotator ( UPM) während 2 Minuten schwenken. 6. Danach Agglutination ablesen. Nachweisgrenze bei 100 IE/ml 1. Reagenzien und Proben vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen (20-30 C) µl der Probe (oder zwei Tropfen der Kontrolle) auf eines der Objektträgertestfelder bringen. 3. Reagenzflasche schütteln und 1 Tropfen Latexreagenz neben den Tropfen der Probe geben. 4. Beide Tropfen mit einem Stäbchen gut mischen und auf der ganzen Testfeldoberfläche verteilen. 5. Objektträger leicht per Hand oder auf dem Rotator ( UPM) während 4 Minuten schwenken. 6. Danach Agglutination ablesen. Auswertung der Ergebnisse Nachweisgrenze bei 200 IE/ml Eine sichtbare Agglutination weist auf einen Antistreptolysin-O im Serum von 200 IE/ml hin. Die Abwesenheit einer Agglutination zeigt einen Antistreptolysin-O im Serum von < 200 IE/ml. 9

11 Nachweisgrenze bei 100 IE/ml Eine sichtbare Agglutination weist auf einen Antistreptolysin-O im Serum von 100 IE/ml hin. Die Abwesenheit einer Agglutination zeigt einen Antistreptolysin-O im Serum von < 100 IE/ml. POSITIVE ERGEBNISSE: 3+ Große Aggregate auf durchsichtigem Hintergrund. 2+ Mittlere Aggregate auf leichttrübem Hintergrund. 1+ Feine Aggregate auf trübem Hintergrund. NEGATIVE ERGEBNISSE: Abwesenheit von Aggregaten, homogene Suspension. SEMIQUANTITATIVE BESTIMMUNG µl normale Kochsalzlösung auf je eines der Testfelder 2-6 des Objektträgers geben. 2. Mit automatischer Pipette 50 µl Serum auf Testfelder 1 und 2 des Objektträgers geben. 3. Mit der gleichen Pipette Serum und Salzlösung des Testfeldes 2 mehrmals aufziehen und abgeben, bis eine gute Mischung entsteht µl der Mischung von Testfeld 2 nehmen und auf Testfeld 3 überführen. 5. Die beschriebenen Schritte bis Testfeld 6 wiederholen, damit die richtige Mischung der Reagenzien entsteht. Nach Testfeld 6 müssen 50 µl der Mischung verworfen werden. 6. Jede Verdünnung so bewerten, wie im Kapitel QUALITATIVE BESTIMMUNG beschrieben. Caractéristiques fonctionnelles Le réactif rheumajet ASO a été évalué (niveau de détection de 200 UI/ml) par comparaison avec un réactif de latex déjà commercialisé. Un total de 170 échantillons de sérum ont été analysés selon la technique qualitative; la concordance obtenue entre ces deux tests (96,7% de sensibilité et 95,4% de spécificité) a été de 95,9%. Les sérums conflictuels ont fait l objet d une nouvelle analyse en utilisant le réactif de latex commercialisé; la sensibilité a été, ici, de 98,4% et la spécificité, de 98,1%, avec une concordance totale des résultats de 98,2%. Pour l étude de la reproductibilité du réactif, 3 personnes différentes ont vérifié des dilutions doubles sériées d un échantillon présentant un titre élevé, test répété par double pendant 5 jours. Le résultat de cette étude indique que le réactif présente une reproductibilité des résultats (± une dilution) de 100%. Bibliographie Voir "References" à la fin du prospectus. Testfeld NaCl-Lös. µl Serum µl Mischen und überführen µl Verdünnung 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 IE/ml Auswertung der Ergebnisse Der Titer entspricht ungefähr der höchsten Serum-Verdünnung, die noch eine klar sichtbare Agglutination zeigt. Begrenzung der Methode Die Ergebnisse müssen 2 Minuten (4 Minuten mit Nachweisgrenze bei 100 IE/ml) nach Anfang der Reaktion abgelesen werden. Wird diese Zeit überschritten, kann sich eine fehlerhafte Ablesung ergeben. Der Agglutinationsgrad gibt nicht zwangsläufig die Konzentration des Antistreptolysins-O an. Wenn die Konzentration des Antistreptolysins-O 1500 IE/ml übersteigt (750 IE/ml mit Nachweisgrenze bei 100 IE/ml), können aufgrund des Antikörper-Überschusses schwächere Reaktionen beobachtet werden. Falls Verdacht auf Antistreptolysin-O-Konzentrationen von über 2000 IE/ml besteht (1000 IE/ml mit Nachweisgrenze bei 100 IE/ml), müssen die Proben verdünnt werden. Ein erhöhter Antistreptolysin-O-Titer ist nützlich, um die Diagnose einer Gruppe A Streptokokken-Infektion und ihrer Folgen wie etwa starkes rheumatisches Fieber, postinfektiöse Streptokokken-Glomerulonephritis zu stützen. Obgleich bei 80 bis 85% der Patienten ein Anstieg des Antistreptolysin-O-Titers nachgewiesen wurde, darf ein negativer Befund keinesfalls die Diagnose ausschließen (2). Erwartete Werte Obwohl die Normalwerte nach Alter, Jahreszeit und Gebiet (2) schwanken können, beträgt der normale Höchstwert für Antistreptolysin-O bei Kleinkindern 100 IE/ml und bei Schulkindern und jungen Erwachsenen (5) 166 bis 250 IE/ml. Als Durchschnittswert kann man etwa 200 IE/ml angeben. Aufgrund dieser Streuung können über den oberen Grenzwert liegende Titer eine Streptokokken-Infektion anzeigen. Allerdings gelten nur Titerzunahmen von 2 oder mehr Verdünnungen zwischen zwei verschiedenen in der akuten oder Genesungsphase entnommenen Proben als signifikant (2). Nach einer akuten Streptokokken-Infektion erhöht sich der Antistreptolysin-O-Titer nach einer Woche und erreicht nach 3-5 Wochen seinen Höchstwert, um etwa 6 bis 12 Monate nach der Infektion auf die vorherigen Werte abzusinken (2)

12 Niveau de détection de 100 UI/ml La présence d agglutination indique la présence d antistreptolysine-o dans le sérum à une concentration supérieure ou égale à 100 UI/ml. L absence d agglutination indique la présence d antistreptolysine-o dans le sérum à une concentration inférieure à 100 UI/ml. REACTIONS POSITIVES: 3+ Grands agrégats sur fond transparent. 2+ Agrégats modérés sur fond légèrement opaque. 1+ Agrégats fins sur fond opaque. REACTIONS NEGATIVES: Absence d agrégats. Suspension uniforme. TEST SEMI-QUANTITATIF 1. Déposer 50 µl de solution saline sur les sections 2 à 6 de la lame. 2. Déposer à l aide d une pipette automatique 50 µl de sérum sur les sections 1 et 2 de la lame. 3. Avec la même pipette mélanger le sérum et la solution saline de la section 2 plusieurs fois, jusqu à l obtention d un bon mélange. 4. Prélever 50 µl de le mélange obtenu dans la section 2 et les transférer dans la section Répéter l étape antérieure et suivre de suite jusqu à la section 6 de façon à obtenir le bon mélange des réactifs, prélever 50 µl et les jeter. 6. Analyser chaque dilution selon est décrite dans la section TEST QUALITATIF. Charakteristika des Tests Das rheumajet ASO-Reagenz wurde (mit Nachweisgrenze bei 200 IE/ml) im Vergleich mit einem bereits vermarkteten Latex-Reagenz bewertet. Es wurden bei der qualitativen Bestimmung insgesamt 170 Serumproben analysiert, wobei zwischen beiden Tests eine Konkordanz von 95,9% ermittelt wurde (96,7% bei der Sensibilität und 95,4% bei der Spezifität). Die abweichenden Seren wurden noch einmal mit einem anderen vermarkteten Latex-Reagenz analysiert, wobei dann eine Sensibilität von 98,4% und eine Spezifität von 98,1% mit einer Gesamtkonkordanz der Ergebnisse von 98,2% ermittelt wurde. Um die Reproduzierbarkeit des Reagenzes zu prüfen, überprüften 3 verschiedene Personen geometrische Verdünnungsreihen einer Probe mit erhöhtem Titer parallel an 5 verschiedenen Tagen. Das Resultat dieser Studie zeigt, dass das Reagenz eine 100% Reproduzierbarkeit der Ergebnisse (± eine Verdünnung) zeigt. Literatur Siehe Referenzen am Ende des Prospekts. Section Saline µl Sérum µl Mélanger et transférer µl Dilution 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Ul/ml Interprétation des résultats Le titre approximatif correspondra à celui de la dilution la plus élevée de sérum présentant encore une nette agglutination. Limites de la procédure La lecture des résultats doit être faite aux 2 minutes (4 minutes dans le niveau de détection de 100 UI/ml) de le début de la réaction. Une lecture obtenue après cette période peut être incorrecte. L intensité de l agglutination n est pas nécessairement indicative de la concentration d antistreptolysine-o. Si la concentration d antistreptolysine-o est supérieure à 1500 UI/ml, (750 UI/ml dans le niveau de détection de 100 UI/ml) de plus faibles réactions peuvent être obtenues en raison de l excès d anticorps. Si l on s attend des concentrations d antistreptolysine-o supérieures à 2000 UI/ml, (1000 UI/ml dans le niveau de détection de 100 UI/ml) les échantillons doivent être dilués. Un titre élevé d antistreptolysine-o peut servir à appuyer un diagnostic d infection par streptocoque du groupe A et de ses séquelles, rhumatisme articulaire aigu et glomérulo-néfrephrite post-streptocoque. Bien qu une augmentation du titre d antistreptolysine-o ait été confirmée chez 80 à 85% des patients, l obtention d un résultat négatif ne doit pas exclure le diagnostic (2). Valeurs attendues Les valeurs normales peuvent varier avec l âge, l époque de l année et la zone géographique (2). Chez les enfants d âge pré-scolaire, la limite supérieure normale est 100 UI/ml; chez les enfants en âge scolaire ou chez les adultes jeunes elle est entre 166 et 250 UI/ml (5). En tout cas, la moyenne a été établie à moins de 200 UI/ml. Du fait de cette variation, les titres au-dessus de la normale indique une infection à streptocoque, mais seule une augmentation de deux o plusieurs dilutions entre la phase aiguë et la phase de convalescence peut-être considérée comme significative (2). Suite à une infection à streptocoque aiguë, le titre d antistreptolysine-o augmentera en une semaine, atteignant un niveau maximum entre 3 et 5 semaines et retournant au niveau de pré-infection au bout de 6 à 12 mois (2)

13 rheumajet ASO Test rapide pour la détermination qualitative et semiquantitative dans le sérum d antistreptolysine-o par agglutination de particules de latex sur lame. La détermination d antistreptolysine-o dans le sérum aide au diagnostic des infections par streptocoque du groupe A. Sommaire Les streptocoques ß-hémolytiques du groupe A produisent des toxines variées qui peuvent agir comme antigènes. Une de ces exotoxines est la streptolysine-o qui a été découverte par Todd en 1932 (1). Un sujet infecté par des streptocoques ß-hémolytiques du groupe A produira des anticorps contre ces exotoxines, un de ceux-ci est l antistreptolysine-o. Un titre élevé d antistreptolysine-o indique une infection récente par streptocoque ß-hémolytique du groupe A et peut permettre de diagnostiquer le rhumatisme articulaire aigu et la glomérulonéphrite post-streptococcique (2). La procédure usuelle pour la détermination du titre de l antistreptolysine-o est basée sur l effet inhibiteur qu un sérum de patient produit sur le pouvoir hémolytique d une streptolysine-o prétraitée et réduite (2-6). Cependant, la réaction antigène-anticorps a lieu indépendament de l activité hémolytique de la streptolysine-o (7). Cette propriété permet l élaboration d un test qualitatif et semi-quantitatif pour la détermination de l antistreptolysine-o par agglutination de particules de latex sur lame. Principe Le réactif latex est une suspension de particules de latex de polystyrène de dimension uniforme sensibilisées avec de la streptolysine-o recombinant. Les particules de latex permettent une observation visuelle de la réaction antigène-anticorps. Si la réaction a lieu, due à la présence d antistreptolysine-o dans le sérum, la suspension de latex change son apparence uniforme et une agglutination claire devient évidente. Cette modification a lieu car l antistreptolysine-o présente dans le sérum réagit avec la streptolysine-o fixée sur les particules de latex, formant un tissu entre elles. Quand on mélange le réactif latex avec le sérum, si celui-ci contient des titres anormalement élevés d antistreptolysine-o, une agglutination nette apparaît. Les résultats sont exprimés en UI/ml d antistreptolysine-o par rapport à l Étalon International de l OMS (8). Composants REF a) Réactif latex: 2 x 2,5 ml. Suspension de particules de latex de polystyrène sensibilisées avec de la streptolysine-o recombinant, dans un tampon. Contient < 0,1% d azide de sodium. b) Contrôle positif: 1 x 1,5 ml. Serúm de lapin dilué contenant plus de 200 UI/ml d antistreptolysine-o. Prêt à l emploi. Contient < 0,1% d azide de sodium. c) Contrôle négatif: 1 x 1,5 ml. Sérum humain dilué contenant moins de 100 UI/ml d antistreptolysine-o. Prêt à l emploi. Contient < 0,1% d azide de sodium. d) Lames jetables: 18 unités (x6). Précautions rheumajet ASO est destiné à un usage diagnostique IN VITRO. Les réactifs contiennent de l azide sodique comme conservateur. Les azides peuvent réagir avec des canalisations métalliques et former des composants explosifs. Après élimination, rincer abondamment avec de l eau. Tout le matériel d origine humaine utilisé dans la préparation du contrôle négatif de ce coffret a été testé par une méthode validée par le FDA pour la recherche des anticorps anti-hiv 1/2 et anti-hcv ainsi que pour celle de l antigène de surface de l hépatite B. Cette recherche s est avérée négative. ATTENTION: MATÉRIEL À RISQUE BIOLOGIQUE. Cependant aucune méthode n offrant une assurance complète quant à l absence d agents infectieux, les réactifs sont à manipuler avec précaution (9). Déposer tout le matériel utilisé dans des récipients conçus pour le matériel biocontaminant. 12 Conservation Les réactifs resteront stables jusqu à la date de péremption indiquée sur l étiquette, à condition d être conservés à 2-8 C. Ne pas congeler. Les réactifs peuvent être endommagés, spécialement si ils sont exposés à des températures extrêmes. L utilisation des contrôles positif et négatif permet de détecter toute détérioration du réactif. Le réactif latex, une fois mélangé, doit avoir un aspect uniforme. Après une période de conservation, il peut apparaître une légère sédimentation qui doit être considérée comme normale. Le réactif et les contrôles contiennent des conservateurs mais, ils restent néanmoins sensibles à la contamination. Manipuler selon les précautions d usage. Le flacon compte-goutte réactif dispense des gouttes de 50 µl ± 10%. Il doit être tenu perpendiculairement à la surface de la lame et une seule goutte doit être déposée. Ne pas utiliser un autre compte-goutte sans vérifier le volume de la goutte. Matériel nécessaire non fourni Solution saline (0,9% NaCl, uniquement pour le test semiquantitatif), pipettes automatiques, agitateur rotatif, bâtonnets et chronomètre. Prélèvement de l échantillon Utiliser du sérum frais. Les échantillons peuvent être conservés à 2-8 C pendant 8 jours. Pour des périodes plus longues, les échantillons doivent être congelés (-20 C). Il n est pas nécessaire d inactiver le sérum. Comme dans tout test sérologique, les sérums hémolysés, lipémiques ou troubles peuvent présenter des résultats variables et ne doivent pas être utilisés. Ne pas utiliser de plasma. Procédure Contrôle de qualité: Avant de réaliser une série de déterminations, tester le réactif latex avec chaque contrôle, inclus dans le coffret. Les deux contrôles seront utilisés selon les étapes décrites dans le TEST QUALITATIF. La réaction entre le contrôle positif et le réactif doit donner une agglutination nette différente de l apparence uniforme du contrôle négatif. Si ces résultats ne sont pas obtenus, ne pas utiliser le kit. Pour assurer une bonne distribution du réactif, tenir le compte-gouttes de réactif en position verticale et verser une seule goutte. TEST QUALITATIF Niveau de détection de 200 UI/ml 1. Attendre que les réactifs et les échantillons atteignent la température ambiante (20-30 C). 2. Déposer 50 µl de l échantillon (ou une goutte de contrôle) sur une des sections de la lame. 3. Agiter le flacon du réactif et ajouter une goutte de réactif à côté de la goutte d échantillon. 4. Mélanger les deux gouttes avec un bâtonnet en recouvrant toute la surface de la section de la lame. 5. Agiter la lame avec un léger mouvement de rotation, manuellement ou à l aide d un agitateur rotatif ( tpm) pendant 2 minutes. 6. Vérifier la présence ou l absence d agglutination. Niveau de détection de 100 UI/ml 1. Attendre que les réactifs et les échantillons atteignent la température ambiante (20-30 C). 2. Déposer 100 µl de l échantillon (ou deux gouttes de contrôle) sur une des sections de la lame. 3. Agiter le flacon du réactif et ajouter une goutte de réactif à côté de la goutte d échantillon. 4. Mélanger les deux gouttes avec un bâtonnet en recouvrant toute la surface de la section de la lame. 5. Agiter la lame avec un léger mouvement de rotation, manuellement ou à l aide d un agitateur rotatif ( tpm) pendant 4 minutes. 6. Vérifier la présence ou l absence d agglutination. Interprétation des résultats Niveau de détection de 200 UI/ml La présence d agglutination indique la présence d antistreptolysine-o dans le sérum à une concentration supérieure ou égale à 200 UI/ml. L absence d agglutination indique la présence d antistreptolysine-o dans le sérum à une concentration inférieure à 200 UI/ml. 13

14 rheumajet CRP Rapid test for the qualitative and semiquantitative determination of C-reactive protein in serum by agglutination of latex particles on slide. Measurement of C-reactive protein aids in the evaluation of the amount of injury to body tissues. Summary C-reactive protein (CRP) was first described in 1930 by Tillet and Francis who showed that the sera of patients suffering from acute infection precipitated with a non-proteic pneumococcus extract called C polysacaride in the presence of calcium ions (1). The protein which caused this reaction was therefore called C-reactive protein. Later it was shown that C-reactive protein is frequently found in the sera of normal persons in very low concentrations, in most cases not exceeding a level of 6 mg/l (2). However, during the inflammatory process, whether of an infectious or other nature, the titers of C-reactive protein can reach levels that are far above normal values. In these cases C-reactive protein titers increase and decrease more quickly than the red cells sedimentation rate (3-5). The increase of C-reactive protein occurs in a non specific way in different kinds of tissular aggression, as for example in infectious states, rheumatic fever, rheumatoid arthritis, myocardic infarct, malignant tumour, abdominal abscess, peritonitis, burns, etc (3-7). For this reason a high C-reactive protein concentration in serum lacks diagnostic value when the patients illness is not defined. Nevertheless, it is very useful for following-up and monitoring such illnesses, as well as for the differential diagnosis in certain cases. Principle The latex reagent is a suspension of polystyrene latex particles of uniform size coated with the IgG fraction of an anti-human CRP specific serum. Latex particles allow visual observation of the antigen-antibody reaction (CRP-IgG anti-crp). If the reaction takes place, due to the presence of C-reactive protein in the serum, the latex suspension changes its uniform appearance and a clear agglutination becomes evident. This change occurs because the C-reactive protein present in the serum reacts with the IgG coated to the latex particles, starting the formation of a web between them. When the latex reagent is mixed with the serum, if the serum contains approximately more than 6 mg/l of C-reactive protein, a clear agglutination will appear. Results are expressed in mg/l of CRP based on the International Reference Material for Measurement of 14 Human Serum Proteins (CRM 470). Components REF a) Latex reagent: 2 x 2.5 ml. Suspension of polystyrene latex particles coated with rabbit IgG anti-human CRP, in a buffer. Contains < 0.1% sodium azide. b) Positive control: 1 x 1.5 ml. Diluted human serum containing more than 6 mg/l of CRP. Ready to use. Contains < 0.1% sodium azide. c) Negative control: 1 x 1.5 ml. Diluted human serum containing less than 6 mg/l of CRP. Ready to use. Contains < 0.1% sodium azide. d) Disposable slides: 18 units (x6). BIOKIT, S.A Lliçà d Amunt BARCELONA - SPAIN 01/08 20 Precautions rheumajet CRP is intended for IN VITRO diagnostic use. The reagents contain sodium azide as a preservative. Azides may react with metal plumbing forming explosive components. Upon disposal, please flush abundantly with water. Each donor unit used in the preparation of the negative control of this kit tested by an FDA approved method for the presence of HIV 1/2 and HCV antibodies, as well as for HBsAg and found to be negative. 1

15 WARNING: POTENTIALLY BIOHAZARDOUS MATERIAL. Because no test method can offer complete assurance of the absence of infectious agents, the reagents should be handled carefully (8). Dispose all used materials in a suitable biohazardous waste container. Storage The reagents will remain stable until the expiration date shown on the label, if stored between 2-8 C. Do not freeze. The reagents can be damaged by improper handling, especially in extreme temperatures. Checking with the positive and negative controls provided will permit detection of reagent deterioration. The latex reagent, once shaken, must be uniform without visible clumping. When stored a slight sedimentation may occur and should be considered normal. The reagent and the controls contain preservatives, but are still susceptible to contamination. Handle with the normal precautions. The reagent dropper dispenses drops of 50 µl ± 10%. The dropper must be held perpendicular to the slide surface and a single drop allowed to fall. Do not use another dropper without previously checking the volume of the drop. Material required not provided Normal saline (0.9% NaCl, only for semiquantitative test), automatic pipettes, rotator, stirrers and timer. Sample collection Use fresh serum. Samples can be stored at 2-8 C for 8 days. For longer periods, samples should be frozen (-20 C). It is not necessary to inactivate the serum. As in all serological tests, hemolytic, lipemic or turbid sera may cause incorrect results and should not be used. Do not use plasma. Procedure Quality control: Before performing a set of determinations it is advisable to test the latex reagent with each of the controls included in the kit, following the steps outlined in the section QUALITATIVE TEST. The reaction between the positive control and the reagent should show a clear agglutination different from the uniform appearance of the negative control. If these results are not obtained, do not use the kit. To assure proper delivery of the reagent, the reagent dropper must be held vertically and a single drop allowed to fall. References 1. Tillet WS, Francis T. Serological Reactions in Pneumonia with a Non-protein Somatic Fraction of Pneumococcus. J Exp Med 52: , Kindmark CO. The Concentration of C-reactive Protein in Sera from Healthy Individuals. Scand J Clin Lab Invest 29: , Hedlund P. Clinical and Experimental Studies on C-reactive Protein (acute phase protein). Thesis. Acta Med Scand 169: Anderson HC, McCarty M. Determination of C-reactive Protein in the Blood as a Measure of the Activity of the Disease Process in Acute Rheumatic Fever. Amer J Med 8: , Amos RS, Constable TJ, Crokson RA, Crokso, AP, McConkey B. Rheumatoid Arthritis: Relation of Serum C-reactive Protein and Erythrocyte Sedimentation Rates to Radiographic Changes. Br Med J 1: , Smith SJ, Bos G, Esseveld MR, Van Eijk HG, Gerbrandy J. Acutephase Proteins from the Liver and Enzymes from Myocardial Infarction; a Quantitative Relationship. Clin Chim Acta 81: 75-85, Daniels JC, Larson DL, Abston S, Ritzmann SE. Serum Proteins Profiles in Thermal Burns. The Journal of Trauma 14: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC/NIH manual, 4th edition, QUALITATIVE TEST 1. Allow the reagents and samples to reach room temperature (20-30 C). 2. Place 50 µl of the sample (or one drop of control) onto one section of the slide. 3. Shake the reagent vial and add one drop of reagent next to the drop of sample. 4. Mix both drops with a stirrer covering the whole surface of the slide section. 5. Rotate the slide for 2 minutes manually or on a rotary shaker set at rpm. 6. Observe for agglutination Interpretation of the results The presence of agglutination indicates a content of C-reactive protein in the serum equal to or greater than 6 mg/l. The absence of agglutination indicates a content of C-reactive protein in the serum of less than 6 mg/l. POSITIVE REACTIONS: 3+ Large clumping with clear background. 2+ Moderate clumping with fluid slightly opaque in background. 1+ Small clumping with opaque fluid in background. NEGATIVE REACTIONS: No visible clumping, uniform suspension. 2 19

16 TESTE SEMI-QUANTITATIVO 1. Colocar 50 µl de solução salina em cada uma das seções 2 a 6 da lâmina. 2. Com uma pipeta automática, colocar 50 µl de soro nas seções 1 e 2 da lâmina. 3. Com a mesma pipeta, aspirar e expulsar várias vezes o soro e a solução salina contidos na seção 2 até conseguir uma boa mistura. 4. Tomar 50 µl da mistura obtida na seção 2 e transferir para a seção Realizar as mesmas operações descritas anteriormente para conseguir a mistura correta dos reativos até a seção 6, devendo-se desprezar 50 µl. 6. Testar cada diluição tal como se descreve na seção TESTE QUALITATIVO. Seção Salina µl Soro µl Misturar e transferir µl Diluição 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 mg/l Interpretação dos resultados O título aproximado corresponderá à diluição mais alta do soro que ainda apresente aglutinação claramente visível. Limitações do procedimento A leitura dos resultados deve ser efetuada aos 2 minutos após o início da reação. Exceder este período de tempo pode levar a uma incorreta interpretação dos resultados. Concentrações elevadas do fator reumatóide podem causar um falso incremento dos títulos de proteína C-reativa. O grau de aglutinação não é necessariamente indicativo da concentração relativa de proteína C-reativa. Quando a concentração de proteína C-reativa é superior a 200 mg/l podem ocorrer reações mais fracas devido ao excesso de antígeno. Se há suspeita de concentrações de proteína C-reativa acima de 400 mg/l as amostras devem ser diluídas. Valores previstos A presença da proteína C-reativa no soro ou plasma humano vem-se utilizando como um indicador sensível de processos inflamatórios e necróticos. A concentração de proteína C-reativa aumenta em uma grande variedade de doenças: doenças pulmonares, doenças respiratórias e abdominais em fase aguda, doenças renais e das vias urinárias, febre reumática e artrite reumatóide, doenças cardiovasculares, doenças do sistema digestivo, transtornos metabólicos e endócrinos, doenças sangüíneas, algumas doenças virais, tumores malignos e benignos e algumas doenças da pele (3). Diferentes estudos realizados demonstram que a concentração de proteína C-reativa no soro de crianças e adultos saudáveis de ambos sexos pode oscilar entre 0,02 e 13,5 mg/l. Portanto, a proteína C-reativa deve ser considerada como um constituinte normal do soro. Observa-se uma tênue correlação entre a concentração de proteína C-reativa e a idade. Não se observam diferenças significativas entre a concentração de proteína C-reativa existente no soro de homens e no de mulheres não grávidas. O valor médio de proteína C-reativa em pessoas adultas é de 0,47 mg/l (2). Características funcionais O reativo rheumajet CRP foi avaliado por comparação com outros dois reativos de látex comercializados (diluição 1:6 da amostra). Foram analisadas 204 amostras de soro utilizando a técnica qualitativa, obtendo-se uma concordância de 98,5% com cada um dos dois testes. Os resultados discrepantes corresponderam a amostras que estavam próximas ao limite de sensibilidade do reativo. Para estudar a reprodutibilidade do reativo foi avaliado um painel de 10 soros positivos durante 3 dias consecutivos utilizando a técnica semi-quantitativa. Os resultados deste estudo demonstraram uma reprodutibilidade dos resultados (± uma diluição) de 100%. Bibliografia Veja "References" no fim deste folheto. SEMIQUANTITATIVE TEST 1. Place 50 µl of normal saline onto slide sections 2 through Using an automatic pipette, place 50 µl of the serum onto slide sections 1 and Using the same pipette take in and release the serum and the saline solution on section 2 several times until they are well mixed. 4. Take 50 µl of the mixture made in section 2 and transfer it to section Repeat the aforementioned operations to obtain a thorough mixing of reagents, through section 6 thereafter discarding 50 µl. 6. Test each dilution as described in the section QUALITATIVE TEST. Section Saline µl Serum µl Mix and transfer µl Dilution 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 mg/l Interpretation of the results The approximate titer will correspond to the highest serum dilution that still presents a clearly visible agglutination. Limitations of the procedure Reading of the results should be done at 2 minutes from the beginning of the reaction. A reading obtained after this period of time may give false positive results. Elevated concentrations of rheumatoid factor may falsely increase the C-reactive protein titers. The strength of agglutination is not necessarily indicative of relative C-reactive protein concentration. When C-reactive protein exceeds 200 mg/l, weak reactions may occur due to antigen excess. If concentrations higher than 400 mg/l are suspected, samples should be diluted. Expected values The presence of C-reactive protein in a human serum or plasma has long been used as a sensitive indicator of an inflammatory or necrotic process. Levels of C-reactive protein increase in a variety of diseases: pulmonary and acute respiratory diseases, acute abdominal diseases, diseases of the kidney and urinary tracts, rheumatic fever and rheumatoid arthritis, cardiovascular diseases, diseases of the digestive system, metabolic and endocrine disturbances, diseases of the blood, some virus diseases, malignant and benign tumours and a few diseases of the skin (3). C-reactive protein in concentrations of mg/l has been regularly demonstrated in sera obtained from apparently healthy children and adults of both sexes. C-reactive protein must therefore be considered a normal constituent of the serum. A weak positive correlation was found between C-reactive protein concentration and age. No significant difference in C-reactive protein concentration is demonstrable between men and non-pregnant women. The mean value of C-reactive protein in adults is 0.47 mg/l (2). Performance characteristics rheumajet CRP was evaluated by comparison with two other commercially available latex tests (samples 1:6 diluted). A total of 204 serum samples were tested following the qualitative technique. This study demonstrated a 98.5% agreement with either of the other two tests. The discrepant results were obtained with samples near the limit of sensitivity of the reagents. To study the reproducibility of the reagent, a panel of 10 positive serum samples was tested on three consecutive days using the semiquantitative technique. The results of the study indicate that the reagent in-house reproducibility of the results (within one dilution) was 100%. References See "References" at the end of the package insert. 18 3

17 rheumajet CRP Test rápido para la determinación cualitativa y semicuantitativa en suero de la proteína C-reactiva por aglutinación de partículas de látex en porta. La determinación de la proteína C-reactiva ayuda en la evaluación de la magnitud de la agresión de los tejidos corporales. Sumario La proteína C-reactiva (PCR) fue descrita por primera vez por Tillet y Francis en Estos autores comprobaron que los sueros de pacientes afectos de diversos estados infecciosos en fase aguda, precipitaban en presencia de ión calcio, con un extracto no proteico de pneumococo denominado polisacárido C (1). Por ello a la proteína causante de dicha reacción se la denominó proteína C-reactiva. Posteriormente se demostró que la proteína C-reactiva se encuentra normalmente en el suero de individuos sanos en concentraciones muy bajas, no superando en la mayoría de los casos la tasa de 6 mg/l (2). Sin embargo, en la mayoría de procesos inflamatorios, ya sean de origen infeccioso o no, el incremento de la proteína C-reactiva puede llegar a alcanzar títulos muy superiores al valor normal. En estos casos la proteína C-reactiva aumenta más rápidamente que la VSG (velocidad de sedimentación globular) y su valor vuelve a la normalidad antes que la misma (3-5). La elevación de la proteína C-reactiva se produce de forma inespecífica en diversos procesos de agresión tisular como por ejemplo, estados infecciosos, fiebre reumática, artritis reumatoide, infarto de miocardio, tumores malignos, abscesos abdominales, peritonitis, quemaduras, etc (3-7). Por todo ello una elevada concentración de la proteína C-reactiva en suero, carece de valor diagnóstico fuera del contexto clínico del paciente. No obstante, es de gran utilidad para el seguimiento y control evolutivo de dichos procesos, así como para el diagnóstico diferencial de algunas enfermedades. Principio El reactivo látex es una suspensión de partículas de látex de poliestireno de tamaño uniforme sensibilizadas con la fracción IgG de un suero específico anti-pcr humana. Las partículas de látex ponen de manifiesto la reacción antígeno-anticuerpo (PCR-IgG anti-pcr). Si debido a la presencia de proteína C-reactiva en el suero tiene lugar dicha reacción, la suspensión de látex pierde su aspecto uniforme haciéndose evidente una clara aglutinación. Ello se debe a que la proteína C-reactiva presente en el suero, reacciona con la IgG unida a las partículas de látex, iniciando la formación de una malla entre las mismas. Cuando se mezcla el reactivo látex con el suero, si el suero tiene aproximadamente más de 6 mg/l de proteína C-reactiva, se produce una clara aglutinación. Los resultados se expresan en mg/l de PCR basados en la Preparación Internacional de Referencia para 14 Proteínas Séricas (CRM 470). Componentes REF a) Reactivo látex: 2 x 2,5 ml. Suspensión de partículas de látex de poliestireno sensibilizadas con IgG de conejo anti-crp humana, en un tampón. Contiene azida sódica < 0,1%. b) Control positivo: 1 x 1,5 ml. Suero humano diluido que contiene más de 6 mg/l de PCR. Listo para su uso. Contiene azida sódica < 0,1%. c) Control negativo: 1 x 1,5 ml. Suero humano diluido que contiene menos de 6 mg/l de PCR. Listo para su uso. Contiene azida sódica < 0,1%. d) Portaobjetos desechables: 18 unidades (x6). Precauciones rheumajet CRP es sólo para el diagnóstico IN VITRO. Los reactivos contienen azida sódica como conservante. Las azidas pueden reaccionar con tuberías y desagües metálicos dando lugar a compuestos explosivos. Al tirar los restos de reactivos, dejar correr agua suficiente. Todo el material de origen humano usado en la preparación del control negativo de este kit ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV 1/2 y HCV, así como a la del antígeno de superficie de la hepatitis B, por un método aprobado por la FDA. 4 ATENÇÃO: MATERIAL DE RISCO BIOLÓGICO. Dado que nenhum método pode oferecer a total segurança da ausência de agentes infecciosos, os reativos deste kit devem ser manipulados com cuidado (8). Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante. Conservação Os reativos permanecem estáveis até a data de validade indicada na etiqueta, se forem conservados entre 2-8 C. Não congelar. Os reativos podem deteriorar-se se forem armazenados indevidamente, especialmente se forem submetidos a temperaturas extremas. Um teste com os controles positivo e negativo incluídos no kit, permite detectar possíveis alterações. O reativo látex, uma vez agitado, deve apresentar um aspecto homogêneo. Após um período de armazenamento, pode aparecer uma ligeira sedimentação que deve ser considerada normal. O reativo e os controles contêm conservantes, mas apesar disto são susceptíveis de contaminação. Manipular com as precauções habituais. O conta-gotas do reativo dispensa gotas de 50 µl ± 10%. O conta-gotas deve ser colocado em posição perpendicular à superfície da lâmina e deixar cair apenas uma gota. Não utilizar conta-gotas diferente daquele que acompanha o kit, sem antes verificar o tamanho da gota. Material necessário não incluído Solução salina (NaCl 0,9%, somente para a teste semi-quantitativo), pipetas automáticas, agitador rotatório, palitos de madeira e cronômetro. Coleta da amostra Usar soro fresco. As amostras podem ser conservadas por 8 dias entre 2-8 C. Para guardar por um período de tempo mais longo as amostras devem ser congeladas (-20 C). Não é necessário inativar o soro. Como em todos os exames sorológicos, os soros lipêmicos, hemolizados ou turvos podem apresentar resultados pouco fiáveis e não devem ser utilizados. Não utilizar plasma. Procedimento Controle de qualidade: Antes de efetuar uma série de determinações é aconselhável testar o reativo látex com cada um dos controles, incluídos no kit. Os controles devem ser testados seguindo-se o TESTE QUALITATIVO. A reação entre o controle positivo e o reativo deve dar uma clara aglutinação, diferente da aparência uniforme do controle negativo. Se estes resultados não são obtidos, não utilize o kit. Para assegurar uma correta dosagem do reativo o conta-gotas deve ser colocado verticalmente e deixar cair apenas uma gota. TESTE QUALITATIVO 1. Deixar que o reativo e as amostras alcance a temperatura ambiente (20-30 C). 2. Colocar 50 µl de amostra (ou uma gota de controle) em uma das seções da lâmina. 3. Agitar o frasco do reativo e colocar uma gota do reativo junto à gota de amostra. 4. Misturar ambas gotas com um palito, cobrindo-se toda a superfície da seção da lâmina. 5. Agitar a lâmina com um suave movimento de rotação, seja manualmente ou com um agitador rotatório ( rpm), durante 2 minutos. 6. Observar a presença ou ausência de aglutinação. Interpretação dos resultados A presença de aglutinação indica um conteúdo de proteína C-reativa no soro igual ou superior a 6 mg/l. A ausência de aglutinação indica um conteúdo de proteína C-reativa no soro inferior a 6 mg/l. REAÇÕES POSITIVAS: 3+ Agregados grandes sobre fundo transparente. 2+ Agregados moderados sobre fundo ligeiramente opaco. 1+ Agregados finos sobre fundo opaco. REAÇÕES NEGATIVAS: Ausência de agregados, suspensão uniforme. 17

18 rheumajet CRP Teste rápido para a determinação qualitativa e semi-quantitativa da proteína C-reativa em soro por aglutinação de partículas de látex em lâmina. A determinação da proteína C-reativa ajuda na avaliação da dimensão da agressão nos tecidos corporais. Sumário A proteína C-reativa (PCR) foi descrita pela primeira vez por Tillet e Francis em Estes autores comprovaram que os soros dos pacientes afetados por diversos tipos de infecções em fase aguda, precipitavam com um extrato não proteico de pneumococo, denominado polissacarídeo C, em presença de íons cálcio (1). Por esta razão, a proteína responsável pela mencionada reação foi denominada proteína C-reativa. Posteriormente, demonstrou-se que a proteína C-reativa está normalmente presente no soro dos indivíduos sãos em concentrações muito baixas, não superando, na maioria dos casos, o índice de 6 mg/l (2). Não obstante, na maioria dos processos inflamatórios de origem infecciosa ou não, o incremento da proteína C-reativa pode chegar a alcançar títulos muito superiores ao valor normal. Nestes casos, a proteína C-reativa aumenta mais rapidamente que a VSG (velocidade de sedimentação globular) e seu valor volta ao normal antes que a mesma (3-5). A elevação de proteína C-reativa pode ocorrer de forma inespecífica em diversos processos de lesão tissular como, por exemplo, estados infecciosos, febre reumática, artrite reumatóide, infarto do miocárdio, tumores malignos, abscessos abdominais, peritonite, queimaduras, etc. (3-7). Por isto, uma alta concentração de proteína C-reativa no soro, não tem valor como diagnóstico fora do contexto clínico do paciente. No entanto, é de grande utilidade para o seguimento e controle evolutivo dos referidos processos, além de servir para o diagnóstico diferencial de algumas doenças. Princípio O reativo látex é uma suspensão de partículas de látex de poliestireno de tamanho uniforme recobertas com a fração IgG de um soro específico anti-pcr humana. As partículas de látex permitem visualizar a reação antígeno-anticorpo (PCR-IgG anti-pcr). Se a proteína C-reativa está presente no soro, sucederá a mencionada reação, a suspensão de látex perderá seu aspecto homogêneo, evidenciando-se uma clara aglutinação. Isto é assim porque a proteína C-reativa presente no soro reage com a IgG unida às partículas de látex, iniciando-se a formação de uma malha entre as mesmas. Quando o reativo látex se mistura com o soro, se este contém aproximadamente 6 mg/l de proteína C-reativa ou mais, ocorrerá uma clara aglutinação. Os resultados são expressados em mg/l de PCR com base na Preparação Internacional de Referência para 14 Proteínas Séricas (CRM 470). Componentes REF a) Reativo látex: 2 x 2,5 ml. Suspensão de partículas de látex de poliestireno sensibilizadas com IgG de coelho anti-pcr humana, em um tampão. Contém azida sódica < 0,1%. b) Controle positivo: 1 x 1,5 ml. Soro humano diluído que contém mais de 6 mg/l de PCR. Pronto para uso. Contém azida sódica < 0,1%. c) Controle negativo: 1 x 1,5 ml. Soro humano diluído que contém menos de 6 mg/l de PCR. Pronto para uso. Contém azida sódica < 0,1%. d) Lâminas descartáveis: 18 unidades (x6). Precauções rheumajet CRP é para o diagnóstico IN VITRO. Os reativos deste kit contém azida sódica como conservante. A azida sódica pode reagir com encanamentos e ralos de chumbo ou cobre, originando azidas metálicas altamente explosivas. Ao descartar os restos de reativos, fazê-lo em abundante volume de água. Todo o material de origem humana utilizado na preparação do controle negativo deste kit fora testado e apresentara resultado negativo para a presença de anticorpos contra os vírus HIV 1/2 e hepatite C como também para o antígeno de superfície da hepatite B, utilizando um método aprovado pelo FDA. 16 ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO. Ya que ningún método puede ofrecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, los reactivos deben ser manejados con precaución (8). Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Conservación Los reactivos permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8 C. No congelar. Los reactivos pueden deteriorarse por almacenamiento indebido, especialmente a temperaturas extremas. La comprobación con los controles positivo y negativo incluidos en el kit, permitirá detectar posibles alteraciones. El reactivo látex, una vez agitado, debe presentar un aspecto uniforme. Después de un período de almacenamiento puede aparecer una ligera sedimentación que debe considerarse normal. El reactivo y los controles contienen conservantes, pero a pesar de ello son susceptibles de contaminación. Manejar con las precauciones habituales. El gotero del reactivo dispensa gotas de 50 µl ± 10%. El gotero debe colocarse perpendicular a la superficie del porta y dejar caer una gota libremente. No usar otro gotero distinto al suministrado, sin comprobar el tamaño de la gota. Material necesario no incluido Solución salina (0,9% NaCl, sólo para el test semicuantitativo), pipetas automáticas, agitador rotatorio, palillos mezcladores y cronómetro. Recolección de la muestra Usar suero fresco. Las muestras pueden ser conservadas durante 8 días entre 2-8 C. Si es por un período de tiempo más largo las muestras deben ser congeladas (-20 C). No es necesario inactivar el suero. Como en todas las pruebas serológicas, los sueros hemolizados, lipémicos o turbios pueden causar resultados incorrectos y no deben utilizarse. No utilizar plasma. Procedimiento Control de calidad: Antes de realizar una serie de determinaciones es aconsejable controlar el reactivo látex con cada uno de los controles incluidos en el kit. Ambos controles deberán utilizarse siguiendo los pasos descritos para el TEST CUALITATIVO. La reacción entre el control positivo y el reactivo debe dar una clara aglutinación distinta de la apariencia uniforme del control negativo. Si no se obtienen dichos resultados, no utilice el kit. De cara a asegurar una correcta dosificación del reactivo, el gotero debe colocarse verticalmente y dejar caer una sola gota libremente. TEST CUALITATIVO 1. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente (20-30 C). 2. Dosificar 50 µl de muestra (o una gota de control) en una de las secciones del portaobjetos. 3. Agitar el vial del reactivo y añadir una gota del reactivo junto a la gota de muestra. 4. Mezclar ambas gotas con un palillo cubriendo toda la superficie de la sección del portaobjetos. 5. Agitar el portaobjetos con un suave movimiento de rotación ya sea manualmente o en un agitador rotatorio ( rpm) durante 2 minutos. 6. Observar la presencia o ausencia de aglutinación. Interpretación de los resultados La presencia de aglutinación indica un contenido de proteína C-reactiva en el suero igual o superior a 6 mg/l. La ausencia de aglutinación indica un contenido de proteína C-reactiva en el suero inferior a 6 mg/l. REACCIONES POSITIVAS: 3+ Agregados grandes sobre fondo transparente. 2+ Agregados moderados sobre fondo ligeramente opaco. 1+ Agregados finos sobre fondo opaco. REACCIONES NEGATIVAS: Ausencia de agregados, suspensión uniforme. 5

19 TEST SEMICUANTITATIVO 1. Dosificar 50 µl de solución salina en cada una de las secciones 2 a 6 del portaobjetos. 2. Dosificar con una pipeta automática, 50 µl de suero en las secciones 1 y 2 del portaobjetos. 3. Con la misma pipeta aspirar y expulsar varias veces el suero y la solución salina contenidas en la sección 2 hasta lograr una buena mezcla. 4. Tomar 50 µl de la mezcla realizada en la sección 2 y transferirlos a la sección Realizar las mismas operaciones descritas anteriormente para lograr la mezcla correcta de los reactivos hasta la sección 6 y desechar entonces 50 µl. 6. Comprobar cada dilución como está descrito en el apartado TEST CUALITATIVO. Sección Salina µl Suero µl Mezclar y transferir µl Dilución 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 mg/l Interpretación de los resultados El título aproximado corresponderá al de la dilución más alta de suero que aún presente aglutinación claramente visible. Limitaciones del procedimiento La lectura de resultados deben efectuarse a los 2 minutos de haberse iniciado la reacción. El exceder este tiempo puede inducir a la interpretación errónea de los mismos. Concentraciones elevadas de factor reumatoide pueden aumentar falsamente los títulos de proteína C-reactiva. El grado de aglutinación no es necesariamente indicativo de la concentración de proteína C-reactiva. Cuando la concentración de proteína C-reactiva sea superior a 200 mg/l, pueden observarse reacciones más débiles debido al exceso de antígeno. Si se sospechan concentraciones de proteína C-reactiva superiores a 400 mg/l, las muestras deben diluirse. Valores previstos La presencia de proteína C-reactiva en el suero o plasma humano, se ha venido utilizando como un indicador sensible de procesos inflamatorios y necróticos. Los niveles de proteína C-reactiva aumentan en una gran variedad de enfermedades: enfermedades pulmonares, enfermedades respiratorias y abdominales en fase aguda, enfermedades renales y del tracto urinario, fiebre reumática y artritis reumatoide, enfermedades cardiovasculares, enfermedades del sistema digestivo, trastornos metabólicos y endocrinos, enfermedades de la sangre, algunas enfermedades víricas, tumores malignos y benignos, y algunas enfermedades de la piel (3). Diferentes estudios realizados demuestran que la concentración de proteína C-reactiva en el suero de niños y adultos sanos de ambos sexos puede oscilar entre 0,02 y 13,5 mg/l. Por tanto, la proteína C-reactiva debe pues ser considerada un constituyente normal del suero. Se ha observado una débil correlación entre la concentración de proteína C-reactiva y la edad. No se han observado diferencias significativas entre la concentración de proteína C-reactiva presente en el suero de hombres y en el de mujeres no embarazadas. El valor promedio de proteína C-reactiva en adultos es de 0,47 mg/l (2). Características funcionales El reactivo rheumajet CRP se evaluó por comparación con dos reactivos de látex ya comercializados (dilución 1:6 de la muestra). Se analizaron un total de 204 muestras de suero utilizando la técnica cualitativa, obteniéndose un 98,5% de concordancia con cada uno de los dos tests. Los resultados discrepantes, correspondieron a muestras que se encontraban cerca del límite de sensibilidad del reactivo. Para estudiar la reproducibilidad del reactivo se evaluó un panel de 10 sueros positivos durante 3 días consecutivos utilizando la técnica semicuantitativa. El resultado de este estudio indica que el reactivo muestra una reproducibilidad de los resultados (± una dilución) del 100%. Bibliografía Ver "References" al final del folleto. TEST SEMIQUANTITATIVO 1. Mettere 50 µl di soluzione salina nelle sezioni del vetrino da 2 a Con una pipetta automatica mettere 50 µl di siero nelle sezioni 1 e 2 del vetrino. 3. Con la stessa pipetta miscelare il siero con la salina nella sezione 2 fino ad ottenere una buona miscelazione. 4. Prendere 50 µl di questa miscela dalla sezione 2 e trasferirlo nella sezione Ripetere le operazioni precedentemente descritte per ottenere una corretta miscelazione dei reagenti fino alla sezione 6, quindi scartare 50 µl. 6. Misurare ogni diluizione come descritto nella sezione TEST QUALITATIVO. Sezione Saline µl Siero µl Mescolare e trasferire µl Diluizione 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 mg/l Interpretazione dei risultati Il titolo approssimativo corrisponderà alla diluizione di siero più alta che presenti ancora una chiara agglutinazione. Limitazioni della procedura La lettura dei risultati deve essere effettuata agli 2 minuti di l'inizio della reazione. Trascorso questo tempo si possono avere interpretazioni erronee. Elevate concentrazioni di fattore reumatoide possono dare falsi aumenti dei titoli di proteina C reattiva. Il grado di agglutinazione non è necessariamente indicativo della concentrazione di proteina C reattiva. Se la concentrazione di proteina C reattiva è superiore a 200 mg/l si possono osservare reazioni più deboli a causa dell'eccesso di antigene. Se si sospetta l'esistenza di concentrazioni di proteina C reattiva superiori a 400 mg/l, diluire i campioni. Valori attesi La presenza di proteina C reattiva nel siero o nel plasma umano è stata utilizzata abitualmente come indicatore sensibile dell'esistenza di processi infiammatori e necrotici. I livelli di proteina C reattiva aumentano in un gran numero di affezioni: malattie polmonari, malattie respiratorie e addominali in fase acuta, malattie renali e del tratto urinario, febbre reumatica e artrite reumatoide, malattie cardiovascolari, malattie dell'apparato digestivo, disordini metabolici ed endocrini, malattie del sangue, alcune malattie virali, tumori maligni e benigni e alcune malattie della pelle (3). Vari studi svolti mostrano che le concentrazioni di proteina C reattiva nel siero di bambini e adulti sani di entrambi i sessi possono oscillare tra 0,02 e 13,5 mg/l. Quindi la proteina C reattiva va considerata come un componente normale del siero. È stata osservata una debole correlazione tra la concentrazione di proteina C reattiva e l'età. Non sono state osservate differenze significative relative alla concentrazione di proteina C reattiva nel siero di uomini e in quello di donne non in stato di gestazione. Il valore medio di proteina C reattiva negli adulti è di 0,47 mg/l (2). Caratteristiche di funzionalità Il reagente rheumajet CRP è stato analizzato mediante confronto con altri due reagenti di lattice reperibili in commercio (diluizione del campione 1:6). Complessivamente, sono stati inclusi nello studio 204 campioni di siero utilizzando il test qualitativo: la percentuale di risultati analoghi è stata del 98,5%. I risultati non concordanti corrispondevano a campioni prossimi alla soglia di sensibilità del reagente. Per esaminare la riproducibilità del reagente, è stato esaminato un campione rappresentativo di 10 sieri positivi per 3 giorni consecutivi, mediante il test semiquantitativo. Il risultato della ricerca indica che il reagente mostra una riproducibilità dei risultati (± una diluizione) del 100%. Bibliografia Vedi "References" alla fine del prospetto. 6 15

20 ATTENZIONE: MATERIALE POTENZIALMENTE BIOPERICOLOSO. Comunque, poiché nessun metodo oggi conosciuto può garantire la totale assenza di agenti infettivi, ogni reagente del kit si deve trattare con cura (8). Depositare tutti i materiali utilizzati in recipienti idonei per materiale biocontaminante. Conservazione I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta, se conservati a 2-8 C. Non congelare. I reagenti si possono deteriorare per immagazzinaggio inappropriato, soprattutto in caso di temperature estreme. La verifica dei controlli, positivo e negativo, contenuti nel kit, permetterà di rilevare eventuali alterazioni. Il reagente lattice, una volta agitato, deve presentare un aspetto uniforme. Dopo un periodo d immagazzinaggio può apparire una leggera sedimentazione che si deve considerare normale. Il reagente e i controlli contengono conservati ma possono comunque venire contaminati. Usare quindi le normali precauzioni. Il contagocce del reagente dispensa gocce di 50 µl ± 10%. Il contagocce deve essere collocato perpendicolarmente alla superficie per vetrino e lasciar cadere liberamente una goccia. Non usare nessun contagocce diverso da quello fornito, senza verificare le dimensioni della goccia. Materiale necessario non incluso Soluzione salina (0,9% NaCl, solo per il test semiquantitativo), pipette automatiche, agitatore rotante, bastoncini miscelatori e cronometro. Raccolta dei campioni Usare siero fresco. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per non più di 8 giorni. Per tempi più lunghi devono essere congelati (-20 C). Non è necessario inattivare il siero. Come e tutte le prove sierologici, i sieri emolizzati, lipemici o torbidi possono dar luogo a risultati variabili e vanno perciò scartati. Non usare plasma. Procedura Controllo di qualità: Prima di fare un gruppo di determinazioni testare il reagente lattice con i controlli inclusi nel kit. Ogni controllo dovrebbe essere usato utilizzando il TEST QUALITATIVO. La reazione del controllo positivo con il reagente dovrebbe mostrare una chiara agglutinazione, diversa dall aspetto uniforme del controllo negativo. Se non si ottiene questo risultato, scartare il kit. Per garantire il giusto dosaggio del reagente, il dispensatore deve essere messo in posizione verticale. Deve essere dispensata una goccia alla volta. TEST QUALITATIVO 1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (20-30 C). 2. Mettere 50 µl di campione (o una goccia di controllo) in una sezione del vetrino. 3. Agitare le flacone di reagente e aggiungere una goccia di reagente vicino a quella del campione. 4. Miscelare entrambe le gocce con un agitatore utilizzando l intera superficie della sezione del vetrino. 5. Roteare manualmente il vetrino per 2 minuti oppure su un agitatore automatico a rpm. 6. Controllare la presenza o l assenza di agglutinazione. Interpretazione dei risultati La presenza di agglutinazioni indica un contenuto di proteina C reattiva nel siero uguale o superiore a 6 mg/l. L'assenza di agglutinazioni indica un contenuto di proteina C reattiva nel siero inferiore a 6 mg/l. REAZIONI POSITIVE: 3+ Aggregati grandi su fondo trasparente. 2+ Aggregati moderati su fondo leggermente opaco. 1+ Aggregati fini su fondo opaco. REAZIONI NEGATIVE: Assenza di aggregati, sospensione omogenea. 14 rheumajet CRP Latex-Schnelltest auf Objektträgern zum qualitativen und semi-quantitativen Nachweis von C-reaktiven Protein durch Agglutination von Latexpartikeln im Serum. Der Nachweis des C-reaktiven Proteins hilft bei der Bestimmung des Ausmaßes der Gewebeschäden. Zusammenfassung Das C-reaktive Protein (CRP) wurde erstmals 1930 von Tillet und Francis beschrieben. Diese Autoren stellten fest, dass die Seren von Patienten, die unter akuten Entzündungszuständen litten, in Gegenwart eines Kalzium-Ions eine Präzipitationsreaktion mit dem Polysaccharid des Pneumokokkenstammes C ausführen (1). Deshalb nannte man den Verursacher dieser Reaktion C-reaktives Protein. Später wurde nachgewiesen, dass das C-reaktive Protein normalerweise im Serum gesunder Individuen in sehr geringen Konzentrationen vorkommt, wobei es meistens nicht den Wert von 6 mg/l überschreitet (2). Bei den meisten entzündlichen Prozessen, unabhängig davon, ob es sich um infektiöse handelt oder nicht, kann die Zunahme des C-reaktiven Proteins jedoch Titer erreichen, die weit über dem Normalwert liegen. In diesen Fällen nimmt das C-reaktive Protein schneller als die GSG (Globulare Sedimentationsgeschwindigkeit) zu und sein Wert normalisiert sich schneller wieder als diese (3-5). Die Erhöhung des C-reaktiven Proteins tritt in unspezifischer Weise bei verschiedenen Prozessen zellulärer Aggression wie etwa Infekten, rheumatischem Fieber, rheumatoider Arthritis, Myokardinfarkt, bösartigen Tumoren, Bauchabszessen, Peritonitis, Verbrennungen usw. (3-7) auf. Aus allen diesen Gründen hat eine erhöhte Konzentration von C-reaktivem Protein losgelöst vom Krankheitsbild des Patienten keinen diagnostischen Wert. Dennoch ist sie ausgesprochen hilfreich bei der Begleitung und Kontrolle des Verlaufs der genannten Prozesse sowie für die Differentialdiagnose einiger Krankheiten. Prinzip Das Latex-Reagenz ist eine Suspension aus Polystyrol-Latexpartikeln einheitlicher Größe, die mit der IgG-Fraktion eines spezifischen humanen Anti-CRP-Serums beschichtet sind. Die Latexpartikel lassen die Antigen-Antikörper-Reaktion (CPR-IgG-Anti-CPR) sichtbar werden. Wenn im Serum aufgrund des darin vorhandenen C-reaktiven Proteins diese Reaktion stattfindet, verliert die Latexsuspension ihre Homogenität und es entsteht eine deutliche Agglutination. Dies ist darauf zurückzuführen, dass das im Serum vorhandene C-reaktive Protein mit dem an die Latexpartikel gebundenen IgG reagiert und eine Gitterstruktur zwischen beiden ausbildet. Wenn das Latex-Reagenz mit dem Serum vermischt wird und das Serum wenig mehr als 6 mg/l C-reaktiven Proteins aufweist, entsteht eine deutliche Agglutination. Die Ergebnisse werden in mg/l CRP angegeben, basierend auf dem Internationalen Referenzmaterial für die Bestimmung von 14 Proteinen im Serum (CRM 470). Bestandteile REF a) Latex Reagenz: 2 x 2,5 ml. Suspension von Polystyrol-Latex-Partikeln beschichtet mit Anti-Human-CRP-IgG der Kaninchen, in Puffer. Enthält < 0,1% Natriumazid. b) Positive Kontrolle: 1 x 1,5 ml. Verdünntes Humanserum mit > 6 mg/l CRP. Gebrauchsfertig. Enthält < 0,1% Natriumazid. c) Negative Kontrolle: 1 x 1,5 ml. Verdünntes Humanserum mit < 6 mg/l CRP. Gebrauchsfertig. Enthält < 0,1% Natriumazid. d) Einmal-Objektträger: 18 Einheiten (x6). Vorsichtsmaßnahmen rheumajet CRP ist ausschließlich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt. Die Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Natriumazid kann auf Blei- oder Kupfer-Rohrleitungen und -Abflüsse reagieren und zu hochexplosiven Metallaziden führen. Beim Entfernen der Reagenzreste muss mit genügend Wasser nachgespült werden. 7

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