T. 15 INFECCIONES VÍRICAS DESTACADAS II. INFECCIÓN POR V.I.H. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA 1. VIH. ESTRUCTURA y CICLO VITAL

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1 T. 15 INFECCIONES VÍRICAS DESTACADAS II. INFECCIÓN POR V.I.H. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA 1. VIH. ESTRUCTURA y CICLO VITAL 2. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓN VIH: A) PRUEBAS DE SCREENING Ó CRIBADO DE ANTICUERPOS FRENTE AL VIH. PRUEBAS DE 4ªGENERACIÓN HIV Ag/Ac. PRUENAS RÁPIDAS B) PRUEBAS DE CONFIRMACION DE ANTICUERPOS 3. QUÉ ES SER SEROPOSITIVO. 4. DIAGNÓSTICO MOLECULAR. CARGA VIRAL 5. LOS CD4 EN LA INFECCIÓN VIH/SIDA 6. CLÍNICA. CLASIFICACIONES DE LA INFECCIÓN VIH-SIDA. ESQUEMA EVOLUCIÓN NATURAL DE LA INFECCIÓN 7. ANEXOS. S. Diagnósticas de SIDA. Profilaxis post exposición de VIH y Hepatitis B 1

2 1. VIH. ESTRUCTURA Descubrimiento del virus. En 1983, en el Instituto Pasteur de París, un equipo dedicado a la investigación de la relación entre retrovirus y cáncer dirigido por J.C. Chermann, F. Barré- Sinoussi y L. Montagnier, encontró un candidato al que denominó lymphadenopathy-associated virus (virus asociado a la linfoadenopatía, LAV). En 1984 el equipo de R. Gallo (Instituto Nacional del Cáncer EEUU. Fue tras escuchar una conferencia del biólogo David Baltimore cuando Gallo comenzó a interesarse por los estudios en retrovirus), descubridor del HTLV, único retrovirus humano conocido entonces, confirmó el descubrimiento, pero llamando al virus human T lymphotropic virus type III (virus linfotrópico T humano tipo III ó HTLV-III). Se produjo una disputa sobre quién descubrió el virus VIH en la que quedó claro que Gallo había descrito el virus sólo después de haber recibido muestras de los franceses. Como parte de la resolución del conflicto, el virus adquirió su denominación definitiva, human immunodeficiency virus (HIV) En 2002 en una serie de artículos publicados en la revista Science, Gallo y Montagnier comparten los diferentes roles que cada uno tuvo en el descubrimiento de virus de VIH por lo que Montagnier y Gallo se pueden consideran co-descubridores ó co-identificadores. Hoy en día es generalmente aceptado que el grupo de Montagnier fue el descubridor del virus del VIH, aunque el grupo de Gallo es reconocido como parte fundamental para que este descubrimiento se llevase a cabo y la demostración de que era la causa principal en el desarrollo del sida. Hay que considerar que en 2008 Montagnier obtuvo el Premio Nobel de Medicina, junto a Françoise Barré-Sinoussi por el descubrimiento del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), causante del SIDA (también lo recibió Harald zur Hausen por su descubrimiento del virus de papiloma humano, VPH), con lo cual se ha interpretado que el Comité de Selección no consideró la participación de Gallo en el descubrimiento del virus. 2

3 ESTRUCTURA El VIH, acrónimo de Virus de Inmunodeficiencia Humana, es el agente infeccioso determinante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida ó SIDA. Según el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) el VIH se incluye en el género Lentivirus, encuadrado en la subfamilia Orthoretrovirinae de la familia Retroviridae. El virión (partícula infectante) del VIH difiere en su estructura de los previamente conocidos de otros retrovirus. Mide unos 120 nm de diámetro y es aproximadamente esférico Su genoma se basa físicamente en dos copias de ARN monocatenario positivo (su secuencia es como la del ARN mensajero correspondiente) arropadas por proteínas y encerradas dentro de una cápside troncocónica, a su vez rodeada por una envoltura de bicapa lipídica, obtenida de la membrana plasmática de la célula huésped, pero dotada de proteínas propias. Dentro de la envoltura hay también enzimas propias del virus, incluidas dentro de la cápside una transcriptasa inversa, reversa ó retrotranscriptasa RT, una integrasay una proteasa. La RT es necesaria para la retrotranscipción, la síntesis de ADN tomando el ARN vírico como molde y la integrasa para que el ADN así fabricado se integre en el genoma humano convirtiéndose en provirus.dirige la síntesis tanto de ARN vírico como de proteínas estructurales del VIH La proteasa es la enzima que corta las cadenas de proteínas para prepararlas para el ensamblaje de las partículas virales 3

4 CICLO VITAL VIH La Glucoproteína de la membrana de envoltura GP120 es la que se une al receptor celular CD4 para la fijación ó adsorción. Penetra por fusión de membranas La retrotranscriptasa RT ó Transcriptasa reversa ó inversa es la enzima que hace la copia del ARN viral en ADN viral. El ADN viral se integra en el genoma de la célula huésped gracias a la enzima Integrasa. Dirige la síntesis tanto de ARN vírico como de proteínas estructurales del VIH La proteasa es la enzima que corta las cadenas de proteínas par prepararlaspara el ensamblaje de las partículas virales Varias proteínas de la estructura del virus tienen interés porque van a constituir marcadores serológicos de la infección. La envoltura se basa en una bicapa lipídica, lo mismo que cualquier membrana biológica, y sus componentes estructurales básicos proceden de la membrana plasmática de la célula parasitada. Pero la envoltura porta además regularmente espaciadas 72 espículas ó protuberancias, que son complejos proteicos integrados en la membrana formados por proteínas virales codificadas por el gen env. Cada espícula está formada por una pieza de la proteína gp41, integral en la membrana, y una cabeza externa formada por la proteína gp120, esencial para el acoplamiento con el exterior de ciertas células previo a su invasión. Entre los dos componentes de las espículas existe una unión no covalente Las proteínas gp41 y gp120 se sintetizan como una sola poliproteína, gp160, con la información del gen env antes de que sea cortada por una proteasa de la célula. La proteína p24 forma la cápside. 4

5 La proteína p17 constituye la matriz, una estructura situada bajo la envoltura, a la que estabiliza. Las proteínas p6 y p7 (ó p9) forman la nucleocápside 2. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR EL VIH: A) PRUEBAS DE CRIBADO DE ANTICUERPOS FRENTE AL VIH PRUEBAS DE 4ªGENERACIÓN HIV Ag/Ac PRUEBAS RÁPIDAS B) PRUEBAS DE CONFIRMACION DE ANTICUERPOS El diagnóstico serológico del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) trasciende en importancia a otros diagnósticos de laboratorio por la gravedad de la enfermedad que este virus produce, la existencia hoy en día de tratamientos mucho más eficaces que los iniciales y el conocimiento que tienen los médicos y sanitarios sobre esta infección. Además, buena parte de ese conocimiento ha tenido una gran difusión entre la población general, sobre todo el referido a los mecanismos de transmisión y a las posibilidades diagnósticas. EL MÉTODO MÁS COMÚNMENTE EMPLEADO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCIÓN POR VIH ES EL CRIBADO DE ANTICUERPOS EN MUESTRAS DE SUERO A) PRUEBAS DE CRIBADO DE ANTICUERPOS FRENTE AL VIH La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha definido de manera clara y sucinta cuáles son los objetivos de las pruebas de detección de anticuerpos frente al VIH. La mayoría de casos o situaciones en la práctica diaria del laboratorio puede ser incluida en uno de los objetivos contemplados en la tabla En todo caso, las pruebas habituales de detección de anticuerpos frente al VIH constituyen un primer escalón en el diagnóstico de la infección por este virus y se aplican en la práctica clínica a un gran número de sueros. Las pruebas de detección habituales han experimentado un considerable desarrollo y mejoras desde su desarrollo inicial. Básicamente las mejoras han afectado, principalmente, a) AL ANTÍGENO O ANTÍGENOS UTILIZADOS EN EL ENSAYO y b) AL PRINCIPIO TÉCNICO en el que se fundamentan dichas reacciones. 5

6 a) AL ANTÍGENO O ANTÍGENOS UTILIZADOS EN EL ENSAYOLa mayoría de las primeras técnicas utilizaron antígenos virales crudos más o menos purificados, denominados lisados virales. Estos antígenos contenían gran cantidad de proteínas procedentes del sistema celular en el que se había cultivado el virus. La evolución de los antígenos incluidos en las pruebas de detección ha permitido, por una parte, incrementar la sensibilidad sin merma de la especificidad y, por otra, ha hecho posible la detección de anticuerpos frente a tipos y subtipos del VIH que escapaban a los equipos de diagnóstico habituales. En la tabla 2 aparece la evolución de los antígenos que se han ido incorporando a los equipos de detección de anticuerpos VIH. b) PRINCIPIO TÉCNICO en el que se fundamentan las pruebas Respecto al PRINCIPIO TÉCNICO que emplean, la gran mayoría están basadas en distintas modalidades de ENZIMOINMUNOANÁLISIS ó EIA como ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana VIH. Según esta técnica, proteínas recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra epítopos en estas proteínas víricas. Estos tipos de pruebas han sufrido también variaciones tecnológicas, siendo una de las más empleadas la utilización de substratos fluorescentes que han dado lugar a las pruebas denominadas ELFA enzyme-linked fluorescent assay y MEIA microparticle enzyme immunoassay La última aportación ha sido EIA de cuarta generación: la DETECCIÓN SIMULTÁNEA DEL ANTÍGENO P24 Y DE ANTICUERPOS, lo que acorta el período ventana. Diversos trabajos publicados ponen de manifiesto un adelanto entre una a dos semanas en la detección serológica de la infección, aspecto a considerar si tenemos en cuenta que en ese período la infectividad es más elevada Generalmente se tarda entre 2 y 8 semanas tras la infección en desarrollar anticuerpos detectables, y casi todas las personas los han generado a los 3 6

7 meses de la práctica de riesgo. Se considera Periodo ventana, el tiempo que una persona infectada tarda en desarrollar Anticuerpos frente al virus, un tiempo de espera de 3 meses es válido para el 97% de las personas infectadas. Tres meses después de haberse expuesto al VIH la mayoría de las personas pueden confiar en el resultado de la prueba. No obstante en algunos casos se puede tardar más. Por esto, en algunos casos concretos, como las personas con prácticas de riesgo reiteradas o una historia clínica incompatible con el resultado de la prueba, el médico valorará si está indicado repetirla a los 6 meses. Un resultado negativo a lo 6 meses descarta la posibilidad de infección. Con los análisis EIA de cuarta generación, que detectan no sólo anticuerpos, sino también el antígeno del virus, un resultado negativo es altamente confiable, 95%, a las 24 semanas ó 28 días y definitivo a las seis semanas ó 45 días de la situación de riesgo. EIA ó Inmunoensayo de 4ª generación MEIA para screening con detección cualitativa simultánea de Anticuerpos para el VIH tipo 1 y/o tipo 2 y Antígeno p24 del VIH en plasma ó suero humano: C) Las denominadas PRUEBAS RÁPIDAS han experimentado un desarrollo importante; los antígenos que emplean son similares a los ELISA y ELFA y el tiempo en el que se puede obtener un resultado oscila entre 5 y 20minutos. En los últimos años, han aparecido pruebas rápidas basadas en el principio de la inmunocromatografía capilar ó de flujo lateral que han mejorado de forma importante la sensibilidad y la especificidad. 7

8 Su uso puede estar indicado para situaciones de emergencia (accidente por exposición ocupacional, accidente por exposición sexual, diagnóstico de emergencia por patología aguda que sugiere SIDA, etc ) ó en población con acceso inadecuado a los métodos de screening Hay diversos diseños de Prueba rápida ICT para anticuerpos: Prueba rápida Inmunocromatografica para detección de Ac en cassette: Como Uni-Gold Recombigen HIV Test: La prueba para VIH Uni-Gold es un ensayo para detectar anticuerpos contra los tipos 1 y 2 del VIH en suero, plasma o sangre. Es un inmunoensayo rápido, en el cual se inmovilizan Antígenos de VIH ( proteínas recombinantes que representan las regiones inmuno dominantes de las proteínas de la envoltura de VIH-1 y VIH-2, las glicoproteínas gp41, gp120 (VIH-1) y la glicoproteína gp36 (VIH-2)), en la región ó línea de Test de la tira de nitrocelulosa. Una banda de color rosa/roja en la región de test del dispositivo es indicativa de una reacción positiva. Una segunda banda de color rosa/roja en la región de control del dispositivo e indica comportamiento adecuado de reactivos del kit Prueba rápida ICT para determinación ó screening de Anticuerpos antihiv- 1/2 en tarjeta 8

9 Test ó Prueba rápida OraQuick AC VIH 1/2 9

10 Fundamento: Los Ac humanos y Ac de VIH, si están presentes, retienen las partículas coloidales de orolas partículas de oro coloidal que contienen los anticuerpos de VIH se ligan al antígenode HIV en la línea de Test T Las partículas de oro coloidales quecontienen los anticuerpos Humanos se ligan a los Anticuerpos Anti-humanos en la línea de control C Los remanentes de partículas de oro coloidal son mcapturados y retenidos en la almohadilla absorbente La última aportación es las Pruebas rápidas de 4ª generación para la Determinación simultánea de Anticuerpos anti VIH y Antígeno P24. La detección simultánea de dos marcadores hace al test capaz de detectar la infección por VIH varios días antes que los test rápidos de 3ª generación detección solo de anticuerpos. La prueba en tarjeta Alere Determine HIV 1/2 Ag/Ab Combo The Alere Determine HIV-1/2 Ag/Ab Combo test enables simultaneous separate detection of HIV p24 antigen (Ag), and antibodies (Ab) for HIV-1 and HIV-2 in human serum, plasma or whole blood. The simultaneous detection of two marker types reduces the "window period", making the test capable of detecting HIV infection several days earlier than third generation antibody only rapid tests. 10

11 B) PRUEBAS DE CONFIRMACION DE ANTICUERPOS La trascendencia de la infección por el VIH hace necesaria la confirmación de los resultados positivos obtenidos en las pruebas de detección primaria de anticuerpos La técnica más ampliamente utilizada es el Western Blot ó WB, (utiliza un amplio contenido de antígenos del VIH con respecto a las pruebas de detección primaria de anticuerpos)de tal forma que los resultados del WB son considerados el estándar de confirmación de la presencia de los anticuerpos anti-vih. Existen sistemas que incorporan en un extremo diferenciado de la tira un péptido sintético específico del VIH-2 (gp36) Existen distintos criterios de positividad propuestos por organismos o sociedades involucrados en el diagnóstico del VIH (tabla 4). De ellos, el de la Organización Mundial de la Salud (OMS) es el más específico cuando se manejan sueros de diversa procedencia poblacional. 11

12 Los informes clínicos de los resultados de estas pruebas deben expresar: Los sueros se consideran positivos cuando cumplen el criterio de positividad adoptado por el laboratorio, negativos cuando no se observa ninguna banda de reactividad, e indeterminados cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad, se aconseja un seguimiento o la realización de pruebas adicionales como análisis del RNA viral en plasma. Los resultados indeterminados de la prueba WB son la mayor fuente de ansiedad en pacientes y los que pueden llegar a generar desconcierto en los responsables del diagnóstico. Las causas de estas reactividades anormales en la prueba WB son muy variadas: personas con factor reumatoide en el suero, lupus eritematoso, hiperbilirrubinemias, infección por otros retrovirus, parasitosis y por otras causas. Para minimizar los problemas debidos a resultados indeterminados observados en el WB se han desarrollado técnicas de immunoblot con péptidos recombinantes o pruebas de LIA. Éstas tienen una lectura más estructurada que se puede hacer por densitometría en algunos casos, obviando los problemas de subjetividad en la apreciación de la intensidad de las bandas. 3. QUÉ ES SER SEROPOSITIVO Cuando una persona presenta anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana se dice que es seropostiva frente a dicho virus. Esto quiere decir que el individuo está infectado con el VIH y por lo tanto lo puede trasmitir a otras personas. La seropositividad no significa que se padece de SIDA, ni predice la evolución hacia la enfermedad. Todo sujeto seropositivo permanece infectado, por ello 12

13 debe tomar precauciones que disminuyan los riesgos de evolución hacia el SIDA y eviten que otras personas se expongan y se infecten con el virus. 4. DIAGNÓSTICO MOLECULAR. CARGA VIRAL Es el nombre que reciben los procedimientos empleados para medir de un modo aproximado la cantidad del VIH circulante que se encuentra en el plasma o la cuantificación del RNA vírico existente en una muestra (usualmente plasma). Para ello se emplean técnicas de biología molecular, o diagnóstico genético, que tienen su fundamento en la llamada PCR o"reacción en Cadena de la Polimerasa"(Polymerase Chain Reaction) cuantitativa La técnica que más se está utilizando en nuestro país es la RT-PCR. RT- PCR: AMPLICOR HIV-1 MONITOR (Roche Diagnostics) 13

14 AMPLICOR MONITOR para VIH-1 es una prueba de amplificación in vitro de ácidos nucleicos para la cuantificación del ARN del VIH-1 en plasma humano. Esta prueba puede utilizarse, junto a los datos clínicos y otros marcadores analíticos, como un indicador del pronóstico de la enfermedad. El resultado de un test de carga viral se describe como el número de 'copias' de ARN del VIH por mililitro (copias/ml). Generalmente, copias/ml o menos se considera una carga 'baja' y copias/ml o más se considera 'alta'. Las INDICACIONES de la carga viral son fundamentalmente: 1) Predecir la progresión clínica ó curso de la infección VIH-SIDA, es el mejor indicador.cuanto mayor sea la carga viral, más probabilidad hay de que las células T CD4 que combaten la infección desciendan con rapidez y mayor es el riesgo de desarrollar síntomas en unos pocos años. 2) Monitorizar el tratamiento con antirretrovirales: a) Cuándo se debe iniciar el tratamiento. b) Cuándo están siendo eficaces los antirretrovirales. El descenso de la carga viral VIH tras el tratamiento con antirretrovirales se considera que es un mejor marcador para valorar el beneficio de la terapia que el aumento de los CD4 c) Cuándo están fracasando (resistencias) y se deben cambiar 3) Estimar el riesgo de transmisión, especialmente la materno-fetal. 14

15 5. LOS CD4 EN LA INFECCIÓN VIH/SIDA La determinación del porcentaje de linfocitos CD4 suele realizarse por citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos. La cifras absoluta y porcentaje normales de linfocitos CD4 oscilan entre / l y 51 5% respectivamente. Existe una buena relación entre el número absoluto y el porcentaje de CD4 en los pacientes con infección VIH/SIDA; los que tienen menos del 14% de CD4 tienen menos de 200 CD4/ l; entre el 14-28% tienen entre 200 y 500 y los que tienen más del 28% tienen más de 500 linfocitos CD4/ l. La monitorización de las cifras absolutas de linfocitos CD4 es en la actualidad uno de los marcadores biológicos de referencia en el control de la infección VIH/SIDA: sirve como marcador inmunológico para establecer profilaxis de las infecciones oportunistas y como control, junto con la carga viral, de los tratamientos antirretrovirales (inicio y eficacia). 6. CLÍNICA. CLASIFICACIONES DE LA INFECCIÓN VIH-SIDA. ESQUEMA EVOLUCIÓN NATURAL DE LA INFECCIÓN a) MECANISMO DE TRANSMISIÓN 3 formas: 1. Sexual 2. Sanguínea, Sangre y derivados. 3. Vertical ó materno-fetal 15

16 b) ETAPAS: Hay tres Etapas en la Infección por HIV 1. INFECCIÓN AGUDA 2. LATENCIA CLÍNICA 3. SIDA definido por la disminución de CD4+ y la aparición de cuadros clínicos diagnósticos de SIDA con Infección por VIH demostrada c) CLASIFICACIÓN de los CDC de la infección por VIH-1 y la definición de caso de SIDA Clasificación CDC (1993) Categorías 1, 2 y 3 Según cifra de linf CD4 (ó %de linfo. totales) Categoría 1: Más de 500 / microlitro (> 28%) Categoría 2: Entre 499 y 200 / microlitro (28-14%) Categoría 3: Menos de 199 / microlitro (< 14%) Categorías clínicas A, B y C La categoría clínica A se aplica a la Infección Aguda ó primaria (fiebre, malestares musculares, inflamación de los ganglios ó Linfadenopatía, sudoración nocturna, diarrea, náuseas y vómitos, poco específico, 2-6 semanas tras exposición ) y a los pacientes asintomáticos con o sin linfoadenopatía generalizada persistente. La categoría clínica B se aplica a los pacientes que han presentado síntomas relacionados con la infección por el VIH pero que no se encuadren dentro de la categoría clínica C. La categoría clínica C se aplica a los pacientes que han presentado alguno de los cuadros incluidos en la definición de SIDA (situaciones clínicas Anexo) 1) EVOLUCIÓN NATURAL DE LA INFECCIÓN Curso típico de la infección por VIH. Los detalles, en particular los plazos, varían ampliamente de un infectado a otro. En azul, evolución del recuento de linfocitos T CD4+. En rojo, evolución de la carga viral 16

17 ANEXOS Situaciones clínicas diagnósticas de SIDA 01. Candidiasis traqueal, bronquial o pulmonar 02. Candidiasis esofágica 03. Coccidioidomicosis generalizada 04. Criptococosis extrapulmonar 05. Criptosporidiasis con diarrea de más de 1 mes 06. Infección por citomegalovirus de un órgano diferente al hígado, bazo o ganglios linfáticos 07. Retinitis por citomegalovirus CMV 08. Encefalopatía por VIH 09. Infección por el virus del herpes simple que cause úlcera mucocutánea de más de 1 mes de evolución o bronquitis, neumonitis o esofagitis. 10. Histoplasmosis diseminada 11. Isosporidiasis crónica 12. Sarcoma de Kaposi 13. Linfoma de Burkitt o equivalente 14. Linfoma inmunoblástico o equivalente 15. Linfoma cerebral primario 16. Infección por MAI o M kansasii diseminada o extrapulmonar 17. Tuberculosis extrapulmonar o diseminada 18. Infección por otras micobacterias, diseminada o extrapulmonar 19. Neumonía por P carinii 20. Leucoencefalopatía multifocal progresiva 21. Sepsis recurrente por especies de Salmonella que no sean S typhi 22. Toxoplasmosis cerebral 23. Wasting syndrome (síndrome de desgaste) 24. Carcinoma de cérvix invasivo 25. Tuberculosis pulmonar 26. Neumonía recurrente Ninguna de estas infecciones o neoplasias son indicativas de SIDA si no están asociadas a una seropositividad VIH demostrada. 17

18 PROFILAXIS POST-EXPOSICIÓN VHI TARGA: Terapia Antiretroviral de Gran Actividad.Régimen de medicamentos muy potentes contra el VIH que pueden aplicarse en la hora siguiente al incidente y que siguen ejerciendo su efecto durante las primeras 72 horas (su eficacia va disminuyendo con cada hora transcurrida desde el evento). Este tratamiento puede evitar que la persona se vuelva seropositiva al VIH Vacuna MVA-B. Un grupo de investigación español del CSIC, ha presentado una posible vacuna contra el VIH, La vacuna MVA-B se denomina así por su composición a partir del virus Vaccinia Modificado de Ankara (MVA) y la letra B procede del subtipo de VIH contra el que lucha, el más prevalente en Europa. PROFILAXIS POSTEXPOSICIÓN HEPATITIS B 18

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