Aplicaciones y Tendencias en secuenciación de ADN

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Eugenia Pinto Ortiz
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2 Aplicaciones y Tendencias en secuenciación de ADN Agus%n Arasanz Duque Unidad de Genómica Centres Cien%fics i Tecnològics Universidad de Barcelona

3 Aplicaciones y Tendencias en secuenciación de ADN Introducción Técnicas de secuenciación y aplicaciones: 1ª Generación: Sanger 2ª Generación: Secuenciación masiva en paralelo 3ª Generación: Molécula Única Tendencias

aplicaciones: 1ª Generación: Sanger 2ª Generación:

4 Introducción: ADN *ADN Almacena información estructural i funcional de los organismos vivos. Cambios en la secuencia = mutaciones. Puede dar lugar a enfermedades. Secuencia de cada Organismo es única. Se puede identificar individuos y compararlos La longitud depende de la complejidad del organismo: Homo sapiens: 3000 x 10 6 = 3 Gb Mycoplasma genitalium: 580 X 10 3 = 0,58 Mb 4 de 29

5 Introducción: Pasos previos al Análisis de ADN 1. Obtención de la muestra 2. Aislamiento 3. Amplificación 4. Control de Can4dad y Calidad 5 de 29

6 Introducción: Secuenciación ADN Descifrar el orden de los nucleótidos de un fragmento de ADN 6 de 29

7 Introducción: Historia Secuenciación ADN 7 de 29

8 Secuenciación ADN: Tecnología Primera generación: Sanger / Método de terminación de cadena Terminadores (dd NTP) Electroforesis capilar 1975-> Segunda generación: Secuenciación masiva en paralelo / NGS Alto rendimiento. Clonación in vitro Lecturas cortas > Tercera generación: Secuenciación de molécula única Molécula simple No amplificación > 8 de 29

masiva en paralelo / NGS Alto rendimiento.

9 Primera generación Sanger / Método de terminación de cadena Reactivos (PCR) Ciclos de PCR: Desnaturalización 96º Anillamiento 37-55º Elongación 60º DNA dntp ddntp TAQ polymerase Buffer Primer Premio Nobel DNA Pol 3 PRIMER COMPLEMENTARY CHAIN TEMPLATE 3 5 dntp F. Sanger 5 3 PRIMER COMPLEMENTARY CHAIN TEMPLATE DNA Pol STOP 3 5 ddntp 9 de 29

polymerase Buffer Primer Premio Nobel 1980 5 DNA Pol 3 PRIMER COMPLEMENTARY CHAIN

10 Secuenciación Sanger / método de terminación de cadena 1. Reacción de secuencia (PCR) 1. Denaturaliza@on (96 C) 2. Annealing (50 C) 3. Extension (60 C) 35 Ciclos DNA dntp ddntp TAQ polymerase Buffer Primer 2. Electroforesis capilar 10 de 29

11 Secuenciación Sanger / método de terminación de cadena Electroforesis capilar automatizada Separación de los fragmentos DNA por electroforesis capilar Detección por fluorescencia. Rendimiento: Run: 384 muestras 12 runs por día. Longitud de fragmentos: 800 bp. Rendimiento por run: 300kb Logros: Proyecto Genoma Humano (3000*10 6 pb, genes). 10 años y 3B $ 11 de 29

Rendimiento: Run: 384 muestras 12 runs por día. Longitud de fragmentos: 800 bp.

12 Secuenciación Sanger / método de terminación de cadena y Electroforesis capilar Aplicaciones Ejemplo: Genomic analysis of the PRM1 gene (protamina1) Causa genética de infertilidad en el hombre 12 de 29

13 Secuenciación Sanger: Proyectos a gran escala The Human Genome Project ( ) Human genome pb genes EXPENSIVE AND LONG PROCESS 70B USD >10 YEARS 13 de 29

14 2ª Generación Sanger (a) vs Secuenciación Masiva en Paralelo (b) The ability to process millions of sequence reads in parallel rather than 384 at a time. NGS fragment libraries do not need vector based cloning and E. coli based amplification stages used in capillary sequencing. Shorter Read Lengths. Reduce time and cost. High throughput: Sanger: <300kb NGS: > 500Mb Nature Biotechnology 26, (2008) Published online: 9 October 2008 doi: /nbt1486

coli based amplification stages used in capillary sequencing. Shorter Read Lengths. Reduce time and cost.

15 Secuenciación Masiva en Paralelo / NGS 1. Fragmentación y selección de tamaño del ADN 2. Ligación de adaptadores en los extremos. Librería 3. Clonación masiva en una superficie sólida (millones de fragmentos a la vez). 4. Secuenciación por síntesis de cada fragmento en paralelo PCR en emulsión (Roche/Life Technologies) Roche Illumina PCR en Clústers (Illumina) Life Technologies 15 de 29

Clonación masiva en una superficie sólida (millones de fragmentos a la vez). 4.

16 Secuenciación Masiva en Paralelo: Tecnología 16 de 29

17 Secuenciación masiva en paralelo: Tecnología Illumina MiSeq Hi Seq Roche Life Technologies ABI SOLID 454 FLX+ GS Junior Ion Proton Ion Torrent 17 de 29

18 Secuenciación masiva en paralelo: Aplicaciones Tipo de estudio? Secuenciación de novo. Resecuenciación. Exoma. Transcriptoma. Expresión génica Metagenómica. Amplicones Busqueda de marcadores moleculares Diagnóstico Interacción DNA- Proteina (Chip-seq) Presupuesto? Tamaño del proyecto y/o número de muestras necesarias? Que tecnología escoger para mi proyecto Longitud de las secuencias Profundidad de cobertura (Coverage). Rendimiento 18 de 29

Amplicones Busqueda de marcadores moleculares Diagnóstico Interacción DNA- Proteina (Chip-seq) Presupuesto?

19 Secuenciación masiva en paralelo: Aplicaciones Estudios donde la longitud de secuencia si que importa Secuenciación de novo (mejor ensamblaje) Metagenómica (mejor clasificación taxonómica) Haplotipos y mutaciones estructurales (mejor detección) Detección de polimorfismos CNV s Amplicones (mejor diseño) Facilita el análisis bioinformático Roche 800 pb! 454 FLX+ GS Junior 19 de 29

Haplotipos y mutaciones estructurales (mejor detección) Detección de polimorfismos CNV s

20 Secuenciación masiva en paralelo: Aplicaciones Estudios donde la profundidad de cobertura (coverage) es esencial Resecuenciación (mejora la fiabilidad) Expresión génica (permite distinguir diferentes niveles de expresión) Exomas (Permite detectar variaciones poco frecuentes) Detección de polimorfismos SNP s > X 5000! Illumina MiSeq Life Technologies Ion Proton Hi Seq 2000 Ion Torrent 20 de 29

diferentes niveles de expresión) Exomas (Permite detectar variaciones poco frecuentes) Detección

21 Secuenciación masiva en paralelo: Aplicaciones Rendimiento Tecnología Plataforma # Reads (Mill.) Read longitud (bp) Total output (Gb) Coste por base Técnica Roche GS FLX $$$ GS Junior $$$ empcr, SBS, light detection Illumina Life Technolgies HiSeq x $ Bridge PCR, SBS, MiSeq 12 2x200 8 $$ fluororphore Ion PGM $$ Ion Proton $ empcr, SBS, ph change 21 de 29

22 Secuenciación masiva en paralelo / NGS Ejemplo: Transcriptoma - Sparus aurata CCiT-UB- Unidad de Genómica Tecnolologia 454FLX ROCHE Extracción del RNA (Usuario) Pool from multiple tissues (Usuario) RNA cdna + Normalization (Unidad de Genomica CCiTUB) Diseño Experimental Resultado 7500 *Análisis Bioinformático incluido

23 Secuenciación masiva en paralelo / NGS Ejemplo: Metagenomica (16S) CCiT-UB- Unidad de Genómica Tecnolologia GS JUNIOR 4 Soil DNA Samples + 4 primer-mid S 4 Amplicon-MID 1 region Diseño Experimental Resultado 1000 *Análisis Bioinformático incluido

24 3era Generación Secuenciación Molécula Única vs Secuenciación Masiva en Paralelo Desde Objetivo: Secuenciación de Genomas grandes en poco tiempo y menor coste SMP Ventajas: No requiere amplificación previa Se secuencia a partir de una única molécula. Requiere menor cantidad de muestra inicial Fragmentos más largos (Pac Bios) Resultado obtenemos a tiempo real. Desventajas: Elevado coste de las plataformas Elevado coste por base Ratio de error elevado Tecnología no madura. Poca oferta. Molécula Única 24 de 29

25 Secuenciación de Molécula Única: Tecnología Helicos BioSciences Single-molecule sequencing (tsms ) Pacific Biosciences The technology, denoted Single-molecule Real Time Sequencing-by-synthesis (SMRT ) Fragmentación la DNA/ RNA. (Fragmentos entre bases) Fragmentación: (Fragmentos entre 3-25kb) Se añaden Colas de PoliA Circularización del DNA Hibridación con poli T s de la placa. DNA polimerasa se fija en el fondo de los micropocillos. Nucleótidos marcados con fluorescencia. Solo se ilumina el el fondo del orificio detectando el nucleótido marcado que se incorpora. Detección es a Tiempo Real 25 de 29

26 Secuenciación de Molécula Única: Tecnología Oxford Nanopore: Características Mide corriente a través de nanoporos que es captada por un sensor. Cada Nt (A,T,G,C) produce una intensidad diferente. Secuencias largas. Tiempo real. Coste muy reducido Secuenciadores USB Aun en fase de pruebas! 26 de 29

27 Secuenciación Molécula Única: Aplicaciones Estudios donde la largada de secuencia es importante Fragmentos de 3 kb! Ensamblaje de Genomas completos Mutaciones estructurales Haplotipos Variaciones de número de copias. (CNV s) Estudios donde la profundidad de cobertura sea lo esencial Pacific Biosciences Resecuenciación Exomas Expresión génica Polimorfismos puntuales. (SNP s) Molécula Única Helicos Biosciences 27 de 29

28 Tendencias Secuenciadores portatiles: Nanopore technologies Secuenciación a tiempo real sin requerir amplificación. Bajo coste (1 genoma humano < 1000 $) Menor requerimiento de técnicos especialistas Objetivo: Incluir la secuenciación en el diagnóstico clínico Medicina personalizada 28 de 29

29 PREGUNTAS? Muchas Gracias por su asistencia! CCIT-UB Unidad de Genómica (Campus Diagonal) Amaya Amador Agustín Arasanz Berta Fusté Ramón Seminago Jaume Comas* de 29

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