Miel de abejas - Determinación de Clostridium sulfitoreductores

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1 Vencimiento consulta pública: PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA NCh3123.c2007 Miel de abejas - Determinación de Clostridium sulfitoreductores - Método de recuento Preámbulo El Instituto Nacional de Normalización, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparación de las normas técnicas a nivel nacional. Es miembro de la INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos organismos. Este proyecto de norma se estudió a través del comité técnico Miel, dentro del marco del proyecto BID-ATN/ME-8532-RG, para establecer el método de ensayo de determinación de Clostridium sulfito-reductores. Por no existir Norma Internacional, en la elaboración de este proyecto de norma se ha tomado en consideración la norma IRAM 15964:2002 Miel - determinación de Clostridium sulfito-reductores - Método de recuento y antecedentes presentados por el Comité. El proyecto de norma NCh3123 ha sido preparado por la División de Normas del Instituto Nacional de Normalización. El Anexo A no forma parte del proyecto de norma, se inserta sólo a título informativo. I

2

3 Vencimiento consulta pública: PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA NCh3123.c2007 Miel de abejas - Determinación de Clostridium sulfitoreductores - Método de recuento 1 Alcance y campo de aplicación Esta norma establece el método para la determinación y recuento de Clostridium sulfitoreductores en la miel de abeja. 2 Referencias normativas Los documentos referenciados siguientes son indispensables para la aplicación de esta norma. Para referencias con fecha, sólo se aplica la edición citada. Para referencias sin fecha se aplica la última edición del documento referenciado (incluyendo cualquier enmienda). NCh426/2 Agua grado reactivo para análisis - Especificaciones - Parte 2: Análisis físicoquímico y microbiológico de agua potable, aguas crudas y aguas residuales. NCh617 Miel de abejas - Método de muestreo. 3 Términos y definiciones Para los propósitos de esta norma, se aplica la definición siguiente: Clostridium sulfito-reductores: bacterias pertenecientes al género Clostridium, que tienen la capacidad de reducir el sulfito a sulfuro y de producir esporas. Esto último le confiere una gran resistencia 1

4 4 Principio del método Detección y recuento de las bacterias clostridium utilizando un medio de cultivo que contiene sulfito de sodio, estas bacterias ejercen una acción sulfito-reductora sobre el sulfito de sodio reduciéndolo a sulfuro. El sulfuro reacciona con el citrato férrico, formando un precipitado de sulfuro de hierro alrededor de las colonias, lo que permite contarlas. 5 Aparatos Los equipos que correspondan deben tener mantenimiento, calibración y/o verificación vigente. 5.1 Balanza de precisión, con resolución de 0,01 g. 5.2 Estufa de cultivo. 5.4 Baño de agua termorregulado, controlado a 80ºC ± 1ºC. 5.5 Material volumétrico clase A, según corresponda. 5.6 Medidor de ph, de ± 0,1 unidad de ph a 25ºC. 5.7 Tubos de ensayo, de vidrio de 90 mm x 12,5 mm. 5.8 Membrana filtrante (MF), Millipore HAWP o similar. 5.9 Sistema de cultivo en anaerobiosis, tipo Gaspak (con autogeneración de dióxido de carbono). 6 Reactivos y medios de cultivo 6.1 Agua para análisis, clase 2 según NCh426/ Parafina sólida, estéril. NOTA - Esterilizar la parafina sólida en una estufa a 160ºC durante 2 h. 6.3 Agar sulfito-polimixina-sulfadiazina Composición 2 Peptona de caseína Extracto de levadura Citrato férrico Sulfito de sodio anhidro Sulfato de polimixina B Sulfadiazina de sodio Agar Agua para análisis 15 g 10 g 0,50 g 0,50 g 0,01 g 0,12 g 14 g Completar hasta ml

5 6.3.2 Preparación Disolver los componentes por calentamiento. Ajustar el ph a 7,0 ± 0,1. Distribuir 15 ml del medio en cada uno de los tubos de 90 mm x 12,5 mm. Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 2ºC durante 15 min. Enfriar rápidamente a la salida del autoclave. 6.4 Medio de cultivo tripcasa-peptona, glucosa-extracto de levadura-extracto de carne (medio TPGYB) Composición Tripticasa Peptona Dextrosa Extracto de levadura Extracto de carne Tioglicolato de sodio Agua para análisis 50 g 5 g 4 g 20 g 10 g 1 g Completar hasta ml Preparación Mezclar los componentes y ajustar el ph a 7,4 ± 0,2 con solución de hidróxido de sodio 5 N. Distribuir el medio de cultivo en recipientes de dilución de 110 ml a 150 ml con tapones a rosca. Dejar en autoclave a 121ºC ± 2ºC durante 15 min. Si el medio no se utiliza el día que se autoclava, la solución se debe desaerear de la manera siguiente: Colocar en vapor a 100ºC en el autoclave durante 10 min o ubicar los recipientes de dilución en agua hirviendo, sumergidos aproximadamente 6 cm, durante 10 min. 6.5 Tween Solución de hidróxido de sodio 5 N 7 Preparación de la muestra 7.1 Preparación de las muestras diluidas Pesar 25 g de muestra de miel (o jarabe) en un recipiente estéril cubierto con un film. Agregar 100 ml de solución de agua destilada estéril con 1% en masa de Tween 80 y mezclar hasta que la solución se observe homogénea. 3

6 7.2 Activación de la espora, filtración e incubación Transferir 125 ml de la suspensión a un tubo de centrífuga de 300 ml. Mantener en un baño de agua a 65ºC durante 30 min, centrifugar y filtrar a través de una membrana filtrante. Mantener el sedimento temporalmente a 4ºC y filtrar. Después de filtrar, enjuagar el recipiente de dilución y, a través de un embudo, enjuagar a través de cada MF con 5 ml de agua para análisis fría y estéril. Transferir la MF a un recipiente de flujo laminar con 110 ml de medio de tripticasa-peptona-glucosa-extracto de levadura-extracto de carne (TPGYB). Agregar cuidadosamente el sedimento obtenido de la centrifugación al recipiente de dilución que contiene el medio TPGYB y el filtro. Cubrir lo anterior con 10 ml a 15 ml de parafina sólida fundida mediante pipeta e incubar a 35ºC durante siete días. Controlar los recipientes diariamente. Ante el signo de crecimiento vigoroso, abrir las tapas suavemente para prevenir una presión interna muy alta. 8 Procedimiento 8.1 Investigación y recuento de Clostridium sulfito-reductores Realizar la detección y el recuento de las bacterias Clostridium sulfito-reductores realizando las alternativas siguientes: a) investigar la presencia de formas vegetativas y esporuladas, conjuntamente (ver 8.2); b) investigar, solamente la presencia de formas esporuladas. NOTAS 1) Lograr la detección utilizando un medio de cultivo en cuya fórmula interviene el sulfito de sodio en los que, por la capacidad de estos microorganismos para reducir tal sustancia, se produce sulfuro de hierro al actuar sobre el compuesto de hierro. La presencia de sulfuro de hierro se pone de manifiesto por la aparición del color negro de las colonias. 2) El cultivo de los Clostridium exige una atmósfera exenta de oxígeno, la cual se consigue mediante: - la regeneración de los medios de cultivo antes de ser sembrados; - el cultivo en anaerobiosis mediante la utilización de sistemas para anaerobios (ver 5.9), por la obturación del medio sembrado con una capa de parafina estéril y por la siembra del medio en profundidad. 8.2 Investigación y recuento de unidades de colonias de Clostridium sulfitoreductores Una vez licuado y regenerado el medio de cultivo (ver 6.3), se enfría entre 47ºC y 50ºC Efectuar una serie de diluciones decimales de la muestra preparada según 7.1 y, por duplicado, se siembra 1 ml de cada dilución, con pipeta estéril en los tubos que contiene el medio acondicionado previamente. 4

7 8.2.3 Realizar una siembra introduciendo la pipeta con el inóculo hasta el fondo del tubo y depositar lentamente de abajo hacia arriba Una vez realizada la siembra en cada tubo y con cada dilución, obturar con una capa de parafina estéril. Una vez solidificado el medio en posición vertical, se llevan los tubos a la estufa dentro del sistema para anaerobios Incubar a 36ºC ± 1ºC entre 24 h y 28 h. Contar el número de colonias negras crecidas y multiplicar por el factor de dilución del tubo, para obtener el recuento total de unidades formadoras de colonias de formas vegetativas y esporas de Clostridium sulfitoreductores conjuntamente, por gramo o mililitro de muestra Expresión de los resultados Contar las colonias presentes en cada tubo y obtener el valor medio de los duplicados, en gramos o en mililitro de muestra. El medio utilizado es selectivo para gérmenes sulfito-reductores. El sulfito de sodio, por la acción sulfito reductora de la mayor parte de los Clostridium se reduce a sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro, se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. La sulfadiazina sódica es selectiva e inhibe el crecimiento de bacterias gramnegativas. 8.3 Investigación y recuento de formas esporuladas de Clostridium sulfitoreductores Generalidades Para obtener únicamente las formas esporuladas de Clostridium sulfito-reductores, aprovechando su termorresistencia, calentar a 80ºC la muestra preparada según 7.1, la suspensión madre o las diluciones decimales, según corresponda. De esta manera se destruyen las formas vegetativas Destrucción de formas vegetativas Calentar 5 ml de cada una de las diluciones decimales en tubos de ensayo en un baño de agua regulado a 80ºC durante 5 min. Enfriar inmediatamente los tubos con dilución en agua corriente Regeneración del medio de cultivo Expulsar el oxígeno fundiendo el medio de cultivo utilizado (ver 6.3) y regenerar calentando en agua hirviendo durante 10 min. Después enfriar hasta alcanzar entre 47ºC y 50ºC, mediante un chorro de agua en la pared de los tubos. 5

8 8.3.4 Determinación A partir de la serie de diluciones decimales, calentadas a 80ºC durante 5 min y por duplicado, sembrar 1 ml de cada dilución, con pipeta estéril, en tubos con el medio de cultivo licuado, regenerado y atemperado. Sembrar introduciendo la pipeta en cada dilución hasta el fondo del agar y depositar el inóculo lentamente de abajo hacia arriba. Cubrir la superficie con una capa de parafina estéril fundida. Una vez solidificado el medio, incubar en estufa a 46ºC en anaerobiosis, durante 24 h y 48 h. Dejar enfriar y contar el número de colonias negras crecidas en el agar Expresión de los resultados El valor medio del número de colonias obtenidas en los duplicados (ver 8.3.4) se multiplica por el factor de dilución del tubo y este resultado indica el número de unidades formadoras de colonias (UCF) de esporas de Clostridium sulfito-reductores por gramo o por mililitro de muestra. 10 Informe de resultados El informe de resultados debe incluir, a lo menos, la información siguiente: Nombre y dirección del laboratorio donde se efectuaron los ensayos. Nombre y dirección del solicitante. Identificación de la muestra. Fecha y sistema de muestreo. Fecha de recepción de la muestra. Fecha y hora de inicio y término de ensayo de la muestra. Identificación del método utilizado. Resultados. Nombre y firma del responsable. Sistema de calidad del laboratorio, si existe (por ejemplo: ISO 17025). 6

9 Anexo A (Informativo) Bibliografía [1] ISO 7937:1997 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for enumeration of Clostridium perfringens. Colony-count technique. [2] Microbiología Alimentaria - Investigación y recuento de formas esporuladas de Clostridium sulfito reductores. Autor: Pascual Anderson Editorial Acribia. Zaragoza, España. [3] Laboratory Procedure - Health protection Bramch (Ottawa) - MFCP Detección de Clostridium botulinum in honey and syrups. August

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