Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos.

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1 Método para la determinación de Salmonella spp. en alimentos. OBJETIVOS Aplicar adecuadamente la técnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para la detección del género Salmonella. Explicar el fundamento de todas las etapas del método de detección de Salmonella en alimentos. GENERALIDADES Al inicio del siglo XIX, patólogos clínicos en Francia documentaron la asociación de la ulceración intestinal humana con un agente contagioso; la enfermedad fue denominada como fiebre tifoidea y posteriormente investigadores Europeos aislaron y caracterizaron al bacilo tifoideo responsable de ésta, mientras que en los Estados Unidos, Salmon y Smith en 1885, aislaron de carne de puerco a Bacillus cholerae-suis, ahora conocido como Salmonella enterica serovar Cholaraesius. Salmonella spp. es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este género son capaces de moverse por medio de flagelos perítricos, existen variantes no móviles, S. enterica serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, así como cepas no móviles debido a la presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de Salmonella son quimioorganótrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las vías fermentativa y respiratoria. Las bacterias crecen óptimamente a 37 C y pueden catabolizar la D- glucosa y otros carbohidratos con producción de ácido y gas. Estos microorganismos son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como única fuente de carbono, generalmente producen ácido sulfhídrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayoría de estas características se utilizan para la identificación bioquímica de cepas aisladas de Salmonella. De acuerdo con la definición contemporánea, una cepa de Salmonella típica produce ácido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azúcares, pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa en éste medio, o en medios sólidos selectivos tales como verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entérico de Hektöen. Las especies típicas de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rápida reacción alcalina por la descarboxilación de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad genética observada en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenérico de plásmidos lo cual ha reducido los biotipos típicos de Salmonella. En muestras clínicas y de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rápidamente en KCN. Esta situación ha llevado a reevaluar el esquema de identificación del género, e

2 incluso a utilizar tecnologías moleculares para establecer loci genéticos y/o productos únicos para el género Salmonella. La identificación bioquímica de Salmonella se realiza generalmente junto con una confirmación serológica. Esta técnica laboriosa implica la aglutinación de los antígenos superficiales bacterianos con anticuerpos específicos para el género. Estos incluyen los lipopolisacáridos (LPS) somáticos (O) en la superficie externa de la membrana externa, los antígenos asociados con los flagelos perítricos (H) y el antígeno capsular (Vi), este último presente solamente en Salmonella serovar Typhi, Paratyphi C y Dublín. La amplia distribución de Salmonella spp. en el medio ambiente, aunada a las prácticas agrícolas utilizadas en la industria cárnica, pesquera, de moluscos, láctea y el reciclaje de la materia prima como alimento para ganado, ha favorecido la continua permanencia de este patógeno humano en la cadena alimenticia. El sector avícola se sitúa como la principal fuente de Salmonella spp. y enmascara la importancia como vehículos de infección de las carnes de puerco, de res, de cordero, leche y sus derivados. Las frutas y verduras han ganado notoriedad en años recientes como fuentes de salmonelosis humana. Esto se presenta como una consecuencia de diversos factores como: la fertilización de sembradíos con lodos sin tratamiento o efluentes de drenajes potencialmente contaminados con Salmonella spp. resistente a antibióticos, la irrigación de los campos y el lavado de frutas y verduras con aguas contaminadas, la manipulación excesiva por los trabajadores, la exposición a la contaminación ambiental de especies y condimentos durante el secado y la resistencia del microorganismo a valores de ph bajos. El desarrollo incompleto del sistema inmune en recién nacidos e infantes, el abatimiento en la respuesta inmunológica en individuos de la tercera edad, y la baja producción de ácidos gástricos en estos sectores de la población facilita la colonización intestinal y distribución sistémica del microorganismo. Se ha demostrado que la ingesta de solamente algunas células de Salmonella pueden ser infecciosas. La dosis infectiva en humanos fluctúa entre 1 a 10 células. La composición química del alimento es otro factor determinante en la salmonelosis además de la heterogeneidad inmunológica en la población humana y la virulencia de las cepas infectivas. Un denominador común de los alimentos involucrados, es la presencia de un alto contenido de grasa en alimentos como el chocolate, el queso y la carne. Se ha sugerido que las células de Salmonella englobadas en las micelas lipídicas pueden resistir el efecto lítico de los ácidos gástricos. Las infecciones por Salmonella en humanos pueden originar varias condiciones clínicas, incluyendo fiebre entérica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistémicas por microorganismos no tifoides. La fiebre entérica es una infección grave asociada con las cepas tifoidea y paratifoidea, las cuales están particularmente bien adaptadas para invadir y sobrevivir en los tejidos del huésped. Las manifestaciones clínicas de la fiebre entérica aparecen después de un periodo de incubación de 7 a 28 días y pueden incluir diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal, dolor de

3 cabeza, y debilitamiento. El diagnóstico de la enfermedad radica en la detección del agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la sintomatología clínica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infección sistémica. En países subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibióticos ha originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad cuando se presenta un brote de este tipo. La infección en humanos con Salmonella spp. no tifoide provoca enterocolitis, ésta aparece de 8 a 72 h después de tener contacto con el patógeno invasivo. La condición clínica es auto limitante y la evacuación de heces típicas diarreicas no sanguinolentas y dolor abdominal se presentan a los 5 días. El tratamiento solo implica reemplazo de fluidos o electrolitos. El uso de antibióticos está contraindicado ya que prolonga la sobrevivencia y la excreción intermitente del microorganismo. Este microorganismo se identificó originalmente en hospitales y laboratorios clínicos y los métodos empleados para su detección, se adaptaron posteriormente al análisis de alimentos. Las modificaciones a los métodos, consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes, debido al proceso al que se somete el alimento (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio. Para diferentes tipos de alimentos, existen distintos protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos. FUNDAMENTO La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos: Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas, logrando de esta manera una condición fisiológica estable. Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. Selección en medios sólidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas. Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

4 Serotipificación, es una técnica inmunológica (antígeno-anticuerpo) que permite la identificación específica de un microorganismo. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES NOTA Los medios de cultivo que a continuación se presentan son los utilizados en el procedimiento general. Para los medios de cultivo utilizados durante preenriquecimientos específicos consultar las modificaciones en el inciso matraz Erlenmeyer de 500 ml de capacidad, conteniendo ml de caldo lactosado a. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 ml de caldo selenito-cistina b. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 ml de caldo tetrationato b. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 ml de caldo Vassiliadis- Rappaport b. 1 caja de Petri estéril con 20.0 ml de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) c. 1 caja de Petri estéril con 20.0 ml de agar bilis verde brillante (VB) c. 1 caja de Petri estéril con 20.0 ml de agar entérico de Hektöen (HE) c. 1 caja de Petri estéril con 20.0 ml de agar sulfito de bismuto (SB) c. 1 caja de Petri estéril con 20.0 ml de agar para Salmonella y Shigella (SS) c. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm conteniendo 3.0 ml de agar hierro-triple azúcar (TSI) o agar hierro Kligler (KIA) solidificado e inclinado d. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 ml de agar hierro-lisina (LIA) inclinado d. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 ml de caldo urea o caldo Surraco e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 ml de caldo urea rápido (puede utilizarse en sustitución del caldo urea o Surraco) e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 ml de medio sulfuro-indol-manitol (SIM) e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 ml de agar citrato de Simmons inclinado e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 ml de caldo manitol e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 ml de caldo malonato e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 ml de caldo rojo de metilo-voges Proskauer (RM-VP) e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 5.0 ml de caldo soya tripticaseína e. 2 cajas de Petri con 20.0 ml de agar infusión cerebro corazón e.

5 SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES 1 frasco gotero con solución salina isotónica estéril d. 1 frasco gotero con solución de verde brillante al 0.1% b 1 frasco gotero con solución yodo yoduro de potasio b 1 frasco gotero con solución salina formalizada e. 1 frasco gotero con reactivo de Kovac s f. 1 frasco gotero con solución de rojo de metilo r. 1 frasco gotero con solución reactivo de Voges-Proskauer N 1 (VP1; solución etanólica de alfa-naftol al 5% P/V) f. 1 frasco gotero con solución reactivo de Voges-Proskauer N 2 (VP2; hidróxido de potasio al 40% P/V) f. Juego de colorantes para la tinción de Gram d. BIOLÓGICOS Suero anti Salmonella O (somático) polivalente d. Suero anti Salmonella H (flagelar) polivalente d. Suero anti Salmonella Vi d. MATERIAL Y EQUIPO Balanza granataria a. 1 caja de Petri de vidrio estéril a. 1 bolsa de stomacher o un vaso de licuadora estéril a. Utensilios necesarios para la manipulación de muestras: cucharas, cuchillos, tenedores, estériles a. Stomacher o motor para licuadora a. Pipetas de vidrio de 1 ml, estériles con filtro de algodón b. a, b, c, d, e, f Pipetas Pasteur estériles Asa microbiológica c, d, e. Mecheros de Bunsen a, b, c, d, e. Portaobjetos d. Pipetas Pasteur estériles con filtro de algodón d, e. Microscopio óptico d, e. Incubadora a 35 C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1 C a, b, c, d, e. Incubadora a 42 C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1 C b.

6 NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica. c Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. d Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica. e Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica. f Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.

7 DETERMINACIÓN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS Incubar h a 37 C Pesar 25 g de muestra en condiciones de asepsia Homogeneizar con 225 ml de solución diluyente según el tipo de muestra Siembra con asa bacteriológica en caldo tetrationato o Vassiliadis y Caldo Selenito cistina Incubar h a 37 C Incubar h a 37 C Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (XLD, SS. Hecktoen, VB, Sulfito bismuto) Incubar h a 37 C Búsqueda de colonias típicas. Consultar cuadro 1 Realizar bioquímicas presuntivas Kligler y LIA Resultados característicos

8 Confirmación serológica Resultados positivos para Salmonella Incubar h a 37 C Siembra de bioquímicas complementarias: malonato citrato, RM-VP, urea, SIM, manitol

9 PROCEDIMIENTO El siguiente método se basa en el análisis de 25.0 g de la muestra, que se considera como una unidad analítica, en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción de 1:9 en el medio de preenriquecimiento. La mínima muestra recomendada es de 25.0 g, es decir, una unidad analítica. Para algunos casos donde el riesgo es mayor, se utilizan dos unidades analíticas (50.0 g) o más. 1. Preenriquecimiento Procedimiento general para la preparación de muestras NOTA IMPORTANTE El presente procedimiento se basa en la técnica general para la detección de Salmonella en alimentos. Sin embargo, deben consultarse los siguientes incisos para realizar las modificaciones pertinentes al preenriquecimiento dependiendo del alimento a analizar, los cuales se presentan en el complemento de la presente práctica. 1. Pesar en una bolsa de Stomacher estéril, en área aséptica 25.0 g de muestra a analizar. 2. Verter ml de caldo lactosado estéril en la bolsa. 3. Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg a velocidad media en el Stomacher. 4. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura ambiente con la tapa perfectamente cerrada. 5. Mezclar bien y determinar el ph de la muestra con papel ph. 6. Ajustar si es necesario, a un ph de con NaOH 1N o HCl 1N estériles. 7. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz 8. Incubar la muestra homogénea a 35 2 C durante 24 h. 2. Enriquecimiento selectivo. 1. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente. 2. Transferir 1.0 ml del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de 1 ml, estéril) a un tubo con 10.0 ml de cada uno de los siguientes medios de enriquecimiento: Caldo tetrationato (antes de su uso, deberá activarse añadiendo al medio base 0.2 ml de solución yodo-yoduro de potasio y 0.1 ml de solución de verde brillante al 0.1 %) Caldo selenito cistina

10 Caldo Vassiliadis-Rappaport (en sustitución del caldo tetrationato) 3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para alimentos altamente contaminados deberán incubarse los medios de enriquecimiento a 42 C por el mismo periodo 3. Aislamiento diferencial. NOTA La metodología descrita en esta sección deberá realizarse para cada uno de los caldos de enriquecimiento descritos en el inciso 2, es decir para los cultivos desarrollados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo Vassiliadis- Rappaport. 1. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado. 2. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiológica estéril y sembrar en estría por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los siguientes medios selectivos: a) Agar XLD b) Agar VB c) Agar HK d) Agar SB e) Agar SS f) Agar Mac Conkey 3. Incubar las cajas ya sembradas en posición invertida a 35 2 C durante 24 2 h. 4. Observar las características macroscópicas de las colonias en los medios sólidos selectivos. 5. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de acuerdo con las características específicas de desarrollo en cada uno de los medios (Consultar el Cuadro 1). 6. Almacenar en refrigeración de 5 a 8 C, las placas con medios selectivos por si es necesario tomar más colonias. 7. Realizar una tinción de Gram a las colonias sospechosas. 8. Registrar las características morfológicas tanto macroscópicas como microscópicas; anotando la forma de la colonia, su color, color del medio circundante, morfología al Gram, etc. 9. Realizar una purificación de las colonias seleccionadas, sembrando nuevamente en estría por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri conteniendo un medio idéntico del que se tomó la colonia. 4. Pruebas bioquímicas preliminares NOTA

11 Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analítica (25.0 g). Seleccionar colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento Agar triple azúcar hierro o agar Kligler hierro 1. Registrar las características del medio TSI o KIA antes de la inoculación (color del medio). 2. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) o agar de Kligler (KIA) inclinado. 3. Incubar el medio TSI o KIA a 35 2 C durante 24 h. 4. Consultar el Cuadro 2 para la interpretación de los resultados Agar lisina hierro. 1. Hacer la misma operación que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la asada de la misma colonia con la que se sembró en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA). 2. La interpretación de resultados puede ser consultada en el Cuadro Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI (o KIA) y LIA para realizar las pruebas bioquímicas complementarias. 4. Los cultivos desarrollados en TSI o KIA que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA típicos deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestre reacciones atípicas en ambos medios. 5. Pruebas bioquímicas complementarias 5.1. Caldo urea (convencional) 1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den la prueba negativa Caldo urea (rápida) 1. Con asa bacteriológica estéril, tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular tubos de caldo urea (rápida). 2. Incubar a C durante 2 h en baño de agua.

12 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den la prueba negativa Agar citrato de Simmons 1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular por estría en el tubo con agar citrato de Simmons. 2. Incubar a 35 2 C durante 96 2 h. 3. Interpretar los resultados (Consultar Cuadro 2) Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad) 1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular por punción vertical en el tubo con medio de SIM. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 h. 3. Para verificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento de 0.2 a 0.3 ml de reactivo de Kovac s. 4. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2) Caldo RM-VP (Rojo de metilo-voges Proskauer) 1. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular el tubo con caldo RM-VP Prueba de Voges-Proskauer (VP) 1. Para la prueba de Voges-Proskauer incubar a 35 2 C durante 48 2 h. 2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estéril un mililitro de cultivo. 3. Adicionar a este cultivo, 0.6 ml de reactivo de VP1 (alfa-naftol etanólico al 5 %), agitar y agregar 0.2 ml del reactivo VP2 (hidróxido de potasio al 40%). 4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional). 5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto que la reacción se lleve a cabo en presencia de oxígeno. 6. Interpretar los resultados después de 2 h. de incubación a temperatura ambiente (Consultar Cuadro 2) Prueba de Rojo de Metilo 1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 2 C el resto del medio RMVP durante 48 h más (96 h. de incubación en total a partir de la inoculación del medio RMVP). 2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora de rojo de metilo. 3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar Cuadro 2).

13 5.6. Caldo malonato (para confirmar la presencia de S. arizonae) 1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA e inocularlo en el tubo que contiene caldo malonato. 2. Incubar a 35 2 C durante 40 2 h. 3. Interpretar los resultados después de incubar (Consultar Cuadro 2) Caldo manitol 1. Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo que contiene caldo manitol. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). NOTA Las pruebas bioquímicas se pueden interpretar en el Cuadro 2, sin embargo se sugiere que se consulten otras referencias, además de las ya expresadas aquí, con el fin de determinar la especie del género en cuestión, esto quiere decir que no necesariamente se encuentre en el alimento analizado la Salmonella, pero sí puede encontrarse otra Enterobacteria, el que es indispensable identificar. En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioquímicas más generales de Salmonella. 6. Identificación serológica Investigación de los antígenos somáticos de Salmonella (suero anti Salmonella O polivalente). 1. Colocar con una asa bacteriológica, dos gotas separadas de solución salina estéril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación. 2. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI/KIA o LIA. 3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella O polivalente y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. 4. Agitar inclinando la lámina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto. 5. Observar bajo una buena iluminación y sobre un fondo oscuro la reacción. 6. Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva. 7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretación de los resultados.

14 NOTAS La suspensión del cultivo en la que no se adicionó el suero anti Salmonella O polivalente se considerará como el control negativo para poder interpretar el resultado. Cuando la aglutinación es positiva con el suero anti Salmonella O polivalente, puede determinarse el subgrupo empleando sueros inmunes para los diferentes subgrupos (los mas frecuentes son B, C, D y E). Si la aglutinación con el suero anti Salmonella O polivalente es negativa, utilizar el suero anti Salmonella Vi polivalente y efectuar la prueba en las mismas condiciones ya descritas. Si hay aglutinación con Vi calentar a ebullición y repetir nuevamente la prueba con el suero anti Salmonella O polivalente Investigación de los antígenos flagelares de Salmonella (suero anti Salmonella H polivalente). 1. Para ensayo el antígeno flagelar en el mismo día, inocular el crecimiento del cultivo de TSI/KIA o LIA en agar infusión cerebro corazón (BHI). 2. Incubar a 35 C durante 4 a 6 h. 3. Para ensayo del antígeno flagelar al día siguiente inocular una asada del cultivo desarrollado en el tubo de TSI o KIA, en un tubo de 13 x 100 mm conteniendo 5.0 ml de caldo soya tripticaseína. 4. Incubar a 35 2 C durante 24 h. 5. Adicionar al cultivo (ya sea de agar infusión cerebro corazón o caldo soya tripticaseína), 2.5 ml de solución salina formalizada. 6. Colocar 0.5 ml del suero antiflagelar H polivalente en un tubo de ensayo para serología (12 x 75 mm). 7. Adicionar 0.5 ml del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 5 de este inciso). 8. Preparar un control de solución salina mezclando 0.5 ml de solución salina formalizada con 0.5 ml del antígeno formalizado. 9. Incubar las mezclas en baño de agua a una temperatura entre 48 y 50 C. 10. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora. 11. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la muestra de prueba pero no en el control. 12. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. 13. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica. 14. La interpretación de los resultados se puede observar en el Cuadro 3.

15 CUADRO 1. Colonias típicas de Salmonella spp. en medios sólidos selectivos. MEDIO SELECTIVO Agar Verde Brillante (VB) Agar Sulfito Bismuto (SB) Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) Agar para Salmonella y Shigella (SS) Color antes de la inoculación Oscuro, color marrón Opaco, verde pálido Claro, color rojo brillante Claro, color rosa Características coloniales de Salmonella spp. Rosas o rojas pueden ser transparentes, rodeadas de medio enrojecido. Las bacterias fermentadoras de lactosa son amarillas Café, grises o negras; con o sin brillo metálico. Algunas veces presencia de halo café o negro. Rosas o rojas pueden ser transparentes, con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras Translúcidas en ocasiones opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas Agar entérico Hektöen Oscuro, color verde Verdes o azul verdes con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras

16 CUADRO 2. Reacciones bioquímicas de Salmonella. Medio Resultado a Color antes de Kligler: Fermentación Glucosa Kligler: Fermentación Lactosa Kligler: Producción de H 2 S Agar LIA: Lisin descarboxilasa Color después de inocular/incubar inocular/incubar + Naranja Fondo tubo amarillo Crecimiento - c Naranja Pico de flauta naranja. Crecimiento + Naranja Ennegrecimiento Crecimiento + Púrpura tenue Púrpura intenso Crecimiento Agar LIA: H 2 S + Púrpura tenue Ennegrecimiento Crecimiento Agar LIA: + Púrpura tenue Fondo tubo amarillo Fermentación Crecimiento Glucosa Caldo Surraco: Ureasa Caldo Surraco: Fermentación sacarosa Medio SIM: Movilidad - Rosa mexicano Rosa-violeta Crecimiento - Rosa Amarillo Crecimiento + d Amarillo tenue. Semisólido, translúcido Medio SIM: Indol - Amarillo tenue. Semisólido, translúcido Medio SIM: H 2 S + Amarillo tenue. Semisólido, translúcido Caldo RMVP: Prueba + Amarillo tenue, de rojo de metilo translúcido Caldo RMVP: Prueba - Amarillo tenue, Voges-Proskauer translúcido Crecimiento en superficie y picadura, turbiedad/difusión fuera de picadura Con reactivo Kovac s: Formación de anillo rojo en superficie Ennegrecimiento Crecimiento Con indicador rojo de metilo: Rojo Con reactivos VP1 y VP2: Anillo rojizo Agar Citrato V a+ Verde Azul Simmons Crecimiento Caldo malonato - c Verde Azul Caldo manitol rojo + Rojo Amarillo fenol Caldo dulcitol rojo + b Rojo Amarillo fenol Caldo KCN - Sin desarrollo Desarrollo Caldo manitol rojo + Rojo Amarillo fenol Observación microscópica Bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados a +,90% o más positivos en 1 ó 2 días;- 90% o más negativos en 1 ó 2 días; v, variable. b La mayoría de los cultivos de S. arizonae son negativos. c La mayoría de los cultivos de S. arizonae son positivos.

17 d Excepto S. entérica serovar Pullorum y S. entérica serovar Gallinarum y cepas con flagelos disfuncionales

18 CUADRO 3. Reacciones serológicas de Salmonella. Reacciones bioquímicas Reacciones serológicas Interpretación Típica Antígeno O, Vi o H Positivo Cepas consideradas como Salmonella Típica Todas las reacciones positivas Típica No probada Puede ser Salmonella Reacciones atípicas Antígeno O, Vi o H Positivo Reacciones atípicas Todas las reacciones negativas No debe ser considerada Salmonella RESULTADOS 1. Interpretación de resultados. Consultar los resultados obtenidos en los cuadros para la identificación de los géneros y especies de las bacterias investigadas. 2. Informe de resultados. Reportar presencia o ausencia de Salmonella spp. o la especie identificada en 25.0 g o ml de alimento, o en la cantidad de muestra inicialmente pesada (mayor a 25.0 g o ml). COMPLEMENTO Preenriquecimientos específicos en diversos grupos de alimentos para la detección de Salmonella spp. (continúa de inciso 1) 1.2. Preenriquecimiento para huevo en polvo, claras de huevo en polvo, huevos líquidos pasteurizados y congelados, fórmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo como harinas para hot cakes, galletas, donas, biquets y pan. Si el alimento está congelado, no descongelar sino hasta el momento del análisis. Descongelar en un baño de agua a 45 C agitando continuamente en un lapso de 15.0 min. aproximadamente, o bien se somete a una temperatura entre 2 y 5 C durante 18.0 h.

19 Productos líquidos Realizar el preenriquecimiento como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) Productos en polvo 1. Pesar 25.0 g de muestra y transferirla a una porción del caldo lactosado (aproximadamente 15.0 ml), para permitir la humectación lenta del alimento. 2. Homogeneizar poco a poco con una varilla de vidrio estéril y agregar más caldo lactosado hasta completar ml 3. Continuar igual que el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.3. Preenriquecimiento para productos no pasteurizados congelados de huevo 1. Descongelar la muestra como se indica en Pesar asépticamente y por duplicado 25.0 g de muestra. 3. Colocar una de las muestras en un matraz que contenga ml de caldo selenito cistina 4. Colocar la segunda muestra en un matraz que contenga ml de caldo tetrationato, sin verde brillante. 5. Ajustar si es necesario el ph a con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N. 6. Al matraz que contiene el caldo tetrationato, adicionarle 2.25 ml de verde brillante al 0.1% y 4.5 ml de solución yodo-yoduro. Mezclar bien. 7. Incubar a 35 C durante 18 a 24 h, o en caso de tratarse de alimentos fuertemente contaminados incubar a 42 C por el mismo periodo Productos que contienen huevo en su formulación: (pastas para sopa, rollos chinos, etc.); ensaladas preparadas (jamón, huevos, pollo, atún, pavo); frutas frescas, congeladas o secas; crustáceos (camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas) y pescado 1. Preferentemente no descongelar la muestra antes de su análisis, si esto es necesario, proceder igual que en el inciso Pesar 25.0 g de muestra y adicionar ml de caldo lactosado estéril. 3. Licuar el alimento durante 2.0 min. 4. Transferir la mezcla homogeneizada en el matraz que contenía el medio de preenriquecimiento. 5. Continuar con la incubación como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.5. Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada.

20 1. Seguir el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla lentamente a un matraz Erlenmayer con ml de solución verde brillante al 0.1%, procurando que el polvo quede en la superficie del líquido y se hidrate suavemente. 2. Dejar la mezcla en reposo por 60 min. 3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.6. Queso 1. Preenriquecer como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando solución amortiguadora de peptona como medio de cultivo Caseína 1. Seguir la metodología señalada en el procedimiento general (inciso 1.1.). 2. Licuar durante 2 min. 3. Ajustar cuidadosamente el ph a Coco 1. Proceder como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), ajustar el ph a Adicionar hasta un máximo de 2.25 ml de tergitol aniónico 7 estéril (121 1 C/15 min.) y mezclar bien. También puede utilizarse tritón X-100 estéril. Usar la cantidad necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mínimo para que se inicie la formación de espuma. Puede ser para el tritón X-100 de dos a tres gotas. 3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) Levadura seca 1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando como medio de preenriquecimiento caldo soya tripticaseína estéril. 2. Mezclar para formar una suspensión homogénea 3. Ajustar el ph a Terminar el procedimiento como se indica en el inciso Levadura seca inactiva.

21 1. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso Levadura seca activa 1. Mezclar la muestra incubada (inciso 1.9.) 2. Transferir 1.0 ml a cada tubo de 10.0 ml de caldo tetrationato (con 0.2 ml de solución yodo-yoduro de potasio y 0.1 ml de solución de verde brillante al 0.1%) y 10.0 ml de caldo lauril-triptosa. 3. Incubar los medios de enriquecimiento a 35 C por 24 h 2 h Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso) Productos procesados térmicamente y productos secos. 1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta la homogeneización. 2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. 3. Después de reposar, mezclar bien y ajustar el ph a Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las similares proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco (inciso 1.8.) La cantidad de los mismos dependerá en gran medida de la composición del alimento. Los detergentes no serán necesarios en los productos glandulares en polvo. 5. Incubar las muestras como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) Productos crudos o altamente contaminados. 1. Pesar porciones de 25.0 g de producto por duplicado en dos vasos para licuadora o en dos bolsas de Stomacher. 2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y pesar directamente el producto en matraces Erlenmayer estériles de 500 ml. 3. Adicionar ml de caldo selenito-cistina o 225.o ml de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra pesada. 4. Licuar por dos min. y pasar asépticamente a matraces Erlenmayer de 500 ml. 5. Dejar reposar y ajustar el ph a Adicionar al caldo tetrationato, 2.25 ml de solución de verde brillante 0.1% y 4.5 ml de solución yodo-yoduro de potasio 7. Mezclar el matraz con los reactivos añadidos. 8. Incubar como se describe en el procedimiento general (inciso 1.1.).

22 9. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2. para muestras en general Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate) 1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra en un vaso de licuadora o bolsa de Stomacher, y agregar ml de leche descremada reconstituida estéril. 2. Licuar por dos min. 3. Continuar igual que en el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta después de ajustar el ph. 4. Adicionar 0.45 ml de la solución de verde brillante al 0.1% y mezclar bien. 5. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) Especias Pimienta negra, pimienta blanca, semilla de apio, comino, perejil seco, romero, tomillo, chile en polvo, páprika o pimentón, ajonjolí, hojuelas de vegetales (vegetales secos) 1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra y verter en un matraz Erlenmeyer con tapón de rosca de 500 ml con ml de caldo soya tripticaseína estéril y mezclar bien. 2. Continuar con el procedimiento como en el inciso Ajo en polvo u hojuelas; cebolla en polvo u hojuelas 1. Pesar asépticamente 25.0 g de la muestra y verter en un recipiente de tapón de rosca de 500 ml con 225.o ml de caldo soya tripticaseína estéril adicionado con sulfito de potasio y mezclar bien. 2. Continuar con el procedimiento general (inciso 1.1.) Pimienta de Jamaica (Pimienta Inglesa), clavo de especia, canela y orégano 1. No se conoce un método para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias. Diluir por lo tanto más allá de su poder de toxicidad. 2. Examinar la pimienta, canela y orégano en una proporción 1:100 muestra/caldo, y el clavo a 1:1000 muestra/caldo. 3. Continuar con el procedimiento descrito en el inciso Gelatina

23 1. Pesar asépticamente 25.0 g de muestra en un recipiente de boca ancha y tapón de rosca de 500 ml. 2. Adicionar ml de caldo lactosado estéril con 5.0 ml de solución acuosa de gelatinasa al 5.0% y mezclar bien. 3. Dejar reposar 60 min. 4. Continuar como en el procedimiento general (inciso 1.1.) BIBLIOGRAFÍA Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA Bienes y Servicios. Método para la determinación de Salmonella en alimentos. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. D Aoust J., Maurer J. & Bailey J.S. (2001). Salmonella Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. Doyle M., Beuchat L.R. & Montville T.J. (Eds.) 2d. ed. ASM Press USA: Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9 th ed. Arlington, VA: AOAC. Andrews W.H., Flowers R.S., Silliker J., & Bailey S. (2001) Salmonella. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington: International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed.

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