11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N 15/35,C12N 7/01

Transcripción

1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N /3,C12N 7/01 A61K 39/13,C12N 1/21 C12N /,C12Q 1/70 C07K 14/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Clonado del ADN de virus de anemia de los pollos. k Prioridad: NL k 73 Titular/es: Leadd B.V. Wassenaarseweg Al Leiden, NL k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Noteborn, Matheus, Hubertus, Maria y De Boer, Gerben, Foppe k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Durán Moya, Carlos ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Clonado del ADN de virus de anemia de los pollos Sector técnico al que pertenece la invención La presente invención pertenece al sector de la ingeniería genética (manipulación de genes) por medio de tecnología de ADN (y ARN) recombinantes, diagnóstico e inmunización/vacunación. Más en particular, la invención se refiere a la detección, clonado y análisis de secuencia del genoma del ADN del Virus de Anemia de Pollos (CAV) y aplicaciones posibles de la invención. Antecedentes de la invención El virus CAV, que no ha sido clasificado hasta el momento provoca anemia infecciosa en los pollos. El virus fue aislado en primer lugar en Japón en 1979 y recibió sunombreacausadelagraveanemia provocada en polluelos (Yuasa y otros, 1979). Los otros síntomas de infección CAV son la atrofia del tuétano de los huesos y la destrucción de linfocitos en el timo. También se producen lesiones en el bazo yenelhígado. Los polluelos de un día de edad son los más susceptibles. En estos animales se observa letargia, anorexia y una anemia transitoria desde los 4 a los 7 días después de inoculación de CAV y aproximadamente la mitad de los animales mueren entre 2 y 3 semanas después de la infección. Al aumentar la edad también aumenta la resistencia natural. Cuando tiene lugar la infección a la edad de siete días, los polluelos solamente desarrollan anemia transitoria después de la infección, y cuando tiene lugar la infección con animales de 14 días de edad no aparece anemia. La protección contra la infección CAV y lossíntomas de la enfermedad CAV se basa principalmente en los mecanismos de defensa inmunológica humoral. Vielitz (1989) desarrolló un método práctico, bastante efectivo, de prevención por medio de exposición controlada con suspensiones de hígado infectado por CAV en capas, adquiriendo así los animales descendientes inmunidad materna. En Alemania este método de inmunización es utilizado en la práctica, pero no parece estar completamente libre de riesgos. Experimentos llevados a cabo con animales en granjas de aves aisladas por el Centraal Diergeneeskundig Instituut (CDI) de Lelystad han confirmado el valor de la protección de los anticuerpos maternos. En este caso, se llevó a cabo exposición controlada con CAV multiplicado en cultivos de tejidos. La presencia de anticuerpos maternos contra CAV impidió por completo la replicación del CAV después de la infección de polluelos de un día de edad procedentes de madres vacunadas de esta forma. Los síntomas de CAV no tuvieron lugar tampoco. La protección pasiva fue obtenida también en descendientes de capas inmunizadas y, asimismo, después de inyección de polluelos específicamente libres de patógenos (SPF) con extractos de yema de huevo procedentes de huevos de las mismas capas inmunizadas. La protección pasiva con respecto a la infección CAV por la administración de anticuerpos CAV duró hasta una edad de 4 semanas. Entonces la protección pasiva se observó que era incompleta. Estos experimentos demostraron que los anticuerpos maternales producidos por vacunación de las madres juegan un importante papel en la prevención en la práctica. También se ha demostrado por vía experimental que en polluelos que sobreviven la infección CAV tiene lugar una disminución pasajera de una población específica de linfocitos del timo (Jeurissen y otros, 1989). Esta atrofia del timo es la posible causa del CAV que provoca inmunodepresión, resultando en que las vacunaciones específicas son menos eficaces, por ejemplo, contra la Enfermedad de Newcastle, habiéndose aislado CAV varias veces en grupos de aves con fuertes bajas debido a la enfermedad de Marek, enfermedad de Gumboro (Virus de la Enfermedad Bursal Infecciosa, IBDV; Yuasa y otros, 1980) y en animales con la Enfermedad de Ala Azul ( Blue Wing ), en asociación con reovirus (Engström, 1988a, Engström y otros, 1988b). Con infecciones dobles experimentales se han demostrado las propiedades de refuerzo del CAV con respecto a otros virus de pollos (por ejemplo, Virus de la Enfermedad de Marek, MDV, De Boer y otros, 1989a). Recientemente se ha observado una reacción de inoculación fuertemente incrementada en nuestros propios experimentos después de vacunación mediante aerosol con vacuna de la Enfermedad de Newcastle e infección simultánea CAV. Por lo tanto, CAV conduce a efectos aumentativos e inmunosupresivos de otras infecciones víricas. Estas características de CAV provocan probablemente en la práctica una incidencia incrementada de focos de enfermedades virulentas. El CAV parece que está extendido por todo el mundo. Un considerable tiempo después de que se habían iniciado las investigaciones sobre CAV en Japón, se llevaron a cabo los primeros aislamientos de CAV en Europa, a saber en Alemania por Von Blow (1983) y más adelante por McNulty y otros (1990) 2

3 en el Reino Unido. En Holanda los primeros aislamientos de CAV procedentes de materiales de USA, Israel y de Túnez fueron llevados a cabo por De Boer y otros (1988). La literatura disponible indica que los aislados pertenecen a un serotipo pero varios aislados tienen que ser comprobados en cuanto a su relación mutua y posibles diferencias de patogenicidad (McNulty y otros, 1990). La extensión del CAV dentro de un grupo de aves tiene lugar probablemente por infección a través de las heces y del aire. La transmisión vertical del virus a la descendencia, no obstante, juega también un importante papel en la epidemiología de CAV. En diferentes países se ha demostrado la presencia de CAV serológicamente. En condiciones de cultivo de tejidos el CAV es difícil de multiplicar. El CAV provoca hasta el momento solamente un efecto citopatológico (CPE) en líneas de células limfoblastoides transformadas MDV procedentes de linfomas de la enfermedad de Marek (células MDCC-MSB1) o bien líneas de células linfoblastoides transformadas del Virus de Leucemia Avian (ALV) procedentes de leucosis linfoide (células 14-X; Yuasa, 1983). Un estudio reciente de Todd y otros (1990) describe partículas de virus (en material CAV purificado) quetienenundiámetro de 23, nm que concentran una densidad de 1,33-1,34 g/ml en un gradiente de CsCl. El virus tiene un polipéptido predominante (Mr: 0.000) y un genoma circular de una sola hebra de ADN con una longitud de 2,3 kilobases. Dos virus pequeños, el Circovirus Porcino y un virus asociado con Psittacine Beak y Enfermedad de las Plumas ( Feather Disease ), se parecen al CAV en lo que respecta al ADN circular con una sola hebra, pero tienen un genoma más pequeño y un diámetro de partículas de virus más pequeño (Ritchie y otros, 1989; Tischer y otros, 1982). Se ha aceptado durante un largo tiempo que el CAV pertenecía a los parvovirus. Si bien la mayor parte de los parvovirus son virus con ADN de una sola hebra, poseen ADN lineal, un genoma más grande y probablemente asimismo otra composición de polipéptidos víricos. Breve descripción de la invención Se acepta en general que los componentes celulares involucrados en la replicación y transcripción de un virus son solamente funcionales si el ADN tiene forma de doble hebra. Un virus que tenga ADN circular con una sola hebra puede presentarse en una célula en una fase en la que consiste en ADN de doble hebra. Los presentes inventores han utilizado este hecho. Los presentes inventores han caracterizado el ADN de doble hilera de CAV con una longitud de 2,3 pares de kilobases en células 14-X y MDCC-MSB1 infectadas con CAV y clonadas en plc-h. El ADN fue secuenciado por completo (ver figura 1). En una prueba de diagnóstico por medio de CAV- ADN clonado y marcado, se pudieron demostrar los ácidos nucleicos de CAV en preparados de cultivos de virus, de hígado y de tejidos. Se observó que el CAV clonado tenía todas las características biológicas y patogénicas del CAV de tipo salvaje, tanto en cultivos de tejidos como en pruebas de animales. Los experimentos PCR y de hibridación demostraron que el genoma completo clonado de CAV es representativo de CAV real. Por medio de análisis Southern con sondas de ADN marcadas 32 Psedemostró que todos los aislados reales contenían moléculas de ADN de 2,3 kb. Los análisis de enzimas de restricción demuestran que el ADN de CAV clonado se corresponde con el ADN de los aislados reales. En un ensayo de transferencia por zonas ( dot blot ) se demostró que con ADN clonado de CAV marcado con digoxigenina se hibridiza específicamente con ADN de los diferentes aislados reales. En experimentos PCR utilizando oligonucleótidos cuya secuencia fue derivada de la secuencia de CAV clonado (figura 4) se amplificó específicamente o se reconoció ADN de CAV. Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona en un primer aspecto un método para la producción de Virus de Anemia de Pollos en forma de doble hebra, comprendiendo las fases de aislar ADN de bajo peso molecular a partir de células infectadas de CAV, fraccionando dicho ADN de bajo peso molecular sobre agarosa/bromuro de etidio, comparando dicho modelo de fraccionamiento con el modelo de fraccionamiento de la misma célula no infectada, aislando el ADN presente en la célula infectada solamente y comprobando que se trata de ADN con doble hebra por análisis de enzimas de restricción. Una realización preferente de la presente invención comprende un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia nucleótida específica de CAV que corresponde o que es complementaria con la secuencia nucleótida mostrada en la figura 1, una secuencia nucleótida homóloga de aquélla, como mínimo al %, o una parte de la misma. 3

4 Este aspecto de la invención consiste en un ácido nucleico seleccionado entre ADN y ARN, en cualquier manifestación posible, es decir, tanto en forma de ADN o ARN desnudo o en forma de ADN o ARN acumulados de cualquier manera (es decir, en proteínas o en partículas de virus) o conectados con otra materia (por ejemplo, con un portador o con un material que funcione como marcador). El ADN puede ser un ADN de hebra única o de doble hebra y puede ser tanto lineal como de forma circular. Es característica de los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la invención, la presencia en ellos de una secuencia nucleótida específica de CAV. Esta secuencia específica de CAV no necesita cubrir todo el genoma de CAV y, desde un punto de vista práctico, solamente una parte específica será necesaria y deseable para la mayor parte de las aplicaciones. Una primera posibilidad preferente es una secuencia nucleótida específica de CAV que se corresponde o que es complementaria con una secuencia nucleótida que codifica para una proteína CAV y que se presenta en un genoma CAV o una parte del mismo. ADN recombinante que comprende dicha secuencia de codificación puede ser utilizado, por ejemplo, para detectar el ARN del mensajero de CAV en una muestra o puede ser utilizado, por ejemplo, dentro del ámbito de un proceso para la producción de proteínas de CAV o partes del mismo. Las palabras partes de la misma en principio comprenden cualquier parte que pueda ser designada como específica de CAV. A nivel de las proteínas esto será un epítopo para la mayor parte de aplicaciones, es decir, un determinante antigénico reconocible por anticuerpos. Los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la invención pueden comprender también una secuencia nucleótida no derivada de genoma de CAV. Esta secuencia nucleótida no derivada de genoma de CAV puede ser formada, por ejemplo, por una secuencia nucleótida derivada de un vector de expresión procariótica o eucariótica. De este modo, la invención comprende la posibilidad de una inserción de una secuencia específica de CAV en un vector (vírico o no vírico) apropiado para la expresión en organismos eucarióticos o en un plásmido adecuado para su expresión en bacterias. Además, es también posible que, como secuencia nucleótida no derivada de genoma CAV, los ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la presente invención comprendan una secuencia nucleótida que no se presenta en el genoma CAV, poseyendo una función reguladora. No obstante, los términos secuencia nucleótida no derivada de genoma de CAV puede consistir también en una secuencia nucleótida que codifica para (parte de) una proteína distinta de proteína de CAV, si el ADN recombinante se tiene que utilizar para producir una proteína híbrida o proteína de fusión en la que una proteína de CAV funciona como portadora para un epítopo o una proteína que no es CAV o, inversamente, una proteína que no es CAV funciona como portadora para un epítopo de una proteína CAV. Si un ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención debe ser utilizado dentro del ámbito de los procesos para detectar ADN o ARN complementarios en una muestra, puede ser necesaria la presencia de una etiqueta. Una etiqueta utilizada para estos propósitos es un marcador adecuado para su utilización con ADN o ARN que posibilita o facilita la detección del ADN o ARN marcado. Las personas especializadas en la materia conocerán muchos tipos de marcadores adecuados para esta finalidad, tales como radioisótopos (por ejemplo, 32 P), moléculas de enzimas (por ejemplo, peroxidasas), haptenos (por ejemplo, biotina), substancias fluorescentes, tintes, pigmentos (por ejemplo, fósforos inorgánicos), y marcadores en partículas (por ejemplo, partículas de oro o de selenio). En un segundo aspecto la invención se refiere a la utilización de ácidos nucleicos recombinantes tal como se ha definido anteriormente, en particular a efectos de diagnóstico, inmunización o vacunación o para la producción de proteínas CAV o no CAV. Más particularmente se refiere, por ejemplo, a la utilización de ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la invención tales como sondas específicas CAV o cebador en un proceso de detección de ADN o ARN de CAV, por ejemplo en un proceso de transferencia por zonas ( slot blotting ) ADN/ARN, transferencia Southern, transferencia Northern, hibridación in situ, amplificación de ADN por medio de PCR, mapa S1 y extensión de cebador, extendiéndose asimismo la invención a un conjunto o juego de diagnóstico para la detección de ADN o ARN de CAV en un proceso tal como transferencia por zonas ADN/ARN, transferencia Southern, transferencia Northern, hibridación in situ, ampliación de ADN por medio de PCR,mapa S1 o extensión de cebador, cuyo juego o conjunto de diagnóstico contiene información genética recombinante de acuerdo con la invención en forma de sonda o cebador específico para CAV. La invención también se refiere a la utilización de ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la in- 4

5 2 3 vención como vacuna de virus vivo para conseguir protección contra CAV u otro patógeno, extendiéndose asimismo la invención a una preparación de vacuna para inmunización contra CAV u otro patógeno, cuyo preparado comprende información genética recombinante de acuerdo con la invención y opcionalmente uno o varios portadores y coadyuvantes adecuados para vacunas de virus vivos. La utilización de información genética recombinante de acuerdo con la invención en un proceso para la producción de una proteína CAV, una parte de la misma por traslación in vitro o in vivo, queda también comprendida en la invención. Lo mismo se puede decir de una célula procariótica o eucariótica conteniendo información genética recombinante, tal como se ha definido anteriormente y, en particular, células procarióticas o eucarióticas capaces de expresar, como mínimo, una proteína o una parte de proteína codificada por información genética recombinante de acuerdo con la invención. Estas diferentes posibilidades se explicarán de manera extensa más adelante en esta descripción. Un aspecto siguiente de la invención se refiere a una proteínadecavounapartedelamismaobtenida por traslación in vitro de una información genética recombinante de acuerdo con la invención, comprendiendo una secuencia nucleótida que codifica para la proteína de CAV o una parte de la misma, así como proteína CAV o parte de la misma obtenidas por aislamiento de una célula procariótica o eucariótica que contienen información genética recombinante de acuerdo con la invención, comprendiendo una secuencia nucleótida que codifica para la proteína CAV o parte de la misma y que es capaz de su expresión. Asimismo, a nivel de proteínas, la invención se extiende a las diferentes aplicaciones, en particular, en la utilización de una proteína o parte de proteína CAV de acuerdo con la invención a efectos de diagnóstico, inmunización o vacunación o para la producción de anticuerpos específicos CAV. Más en concreto, la presente invención comprende la utilización de una proteína CAV o parte de la misma, tal como se ha definido anteriormente, como reactivo que une los anticuerpos específicos CAV en un proceso de inmunoensayo para detectar anticuerpos específicos CAV, por ejemplo transferencia de inmunoperoxidasa, ensayo ELISA o ensayo de inmunofluorescencia y, de manera correspondiente, un equipo de diagnóstico para detectar anticuerpos específicos de CAV en un proceso de inmunoensayo tal como transferencia de inmunoperoxidasa, ensayo ELISA o de inmunofluorescencia, cuyo juego o equipo de diagnóstico contiene una proteína o parte de proteína CAV de acuerdo con la invención como reactivo que se une a anticuerpos específicos de CAV. La utilización de una proteína o parte de proteína CAV, tal como se ha definido anteriormente, en un proceso para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales específicos de CAV, pertenece también a las posibilidades comprendidas dentro del ámbito de la invención. Todas estas aplicaciones se explicarán de manera más extensa a continuación, en la descripción. Ejemplos Análisis de ADN de bajo peso molecular aislado de células infectadas por CAV. 4 0 El genoma de CAV aislado a partir de un preparado de virus purificado se demostró que era una molécula circular de hebra única de ADN con una longitud aproximada de 20 bases (Todd y otros, 1990). La expectativa de los inventores era que en células infectadas con CAV también se presentaba además de la molécula circular de hebra única de ADN del virus una molécula circular de doble hebra de ADN de CAV. El ADN de doble hebra puede ser cortado con enzimas de restricción y, por lo tanto, puede ser clonado de forma directa en contraste con ADN de hebra única. En vista de ello, se examinó si en la fracción de bajo peso molecular de células infectadas con CAV se presentaba un producto de ADN que no existía en células no infectadas. El ADN de bajo peso molecular fue aislado a partir de células MDCC-MSB1 y 14-X infectadas con CAV y a partir de células 14-X no infectadas. El ADN fue fraccionado sobre un gel de agarosa/bromuro de etidio. Se apreció en el gel una banda muy débil de ADN con una longitud (medida) de unos 3 pares de kilobases (kbp). Este producto de ADN específico estaba ausente en el ADN aislado de células no infectadas. En el experimento siguiente se hizo más probable que el ADN específico se encontraba solamente presente en las células infectadas con CAV. Se separó ADN aislado de células infectadas según longitud por medio de un gel de agarosa. Se aisló ADN con una longitud de 2,7-3, kbp. Esta fracción de ADN tendrá que contener el ADN específico del virus además de otro ADN celular. El ADN aislado fue

6 marcado radioactivamente e hibridizado con transferencia Southern de un ADN de bajo peso molecular procedente de células infectadas con CAV y procedente de células no infectadas. A la altura de 3 kbp un producto de ADN hibridizó en las manchas de células infectadas con CAV, lo cual no existía en las manchas de ADN de células no infectadas. La longitud de 3 kbp fue determinada con marcadores de ADN consistiendo en moléculas lineales de ADN de doble hilera. El comportamiento de una molécula circular de ADN de doble hilera en un gel de agarosa es distinto del de los fragmentos de ADN lineales. El ADN de 3 kbp procedente de células infectadas con CAV podría ser una forma lineal de ADN que, en realidad, tiene una longitud de 2,3 kbp. Si el ADN circular de doble hebra es digerido con una enzima de restricción que corta solamente una vez en la molécula de ADN, se debe formar una molécula lineal de ADN poseyendo una longitud (medida) de 2,3 kbp. Que esta suposición es correcta fue demostrado al incubar separadamente ADN de bajo peso molecular aislado a partir de células infectadas 14-X con CAV con seis distintas enzimas de restricción (BamHI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, y XbaI). Un ADN de bajo peso molecular de transferencia Southern aislado de células 14-X infectadas con CAV y cortadas con las enzimas de restricción antes mencionadas fue hibridizado con la anterior sonda de ADN marcada radioactivamente. Esto demostró que el tratamiento con enzimas de restricción BamHI, EcoRI, PstI, y XbaI tenía como resultado una molécula de ADN con una longitud medida de 2,3 kbp. El ADN de células no infectadas incubado con BamHI no contenía este producto de ADN. La enzima de restricción HindIII cortó dos veces el ADN, mientras que Kpn1 no provocó corte. Se puede llegar a la conclusión de los experimentos anteriores que en células con ADN de bajo peso molecular, infectadas con CAV, se presenta una molécula circular de ADN de 2,3 kbp que no existe en células no infectadas y que éste es el genoma de CAV en forma de una molécula circular de ADN de doble hebra. El clonado y subclonado de ADN de CAV de doble hebra es un vector bacteriano. Se incubaron separadamente células 14-XS infectadas con CAV con ADN de bajo peso molecular, con BamHI, BcoRI, PstI y XbaI. El ADN fue separado sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión. De los cuatro preparados de ADN se aisló lamolécula de ADN de 2,3 kbp. El vector de clonado plc-h fue digerido separadamente con las mismas cuatro enzimas de restricción con las cuales se efectuó el corte del ADN de bajo peso molecular. El vector lineal fue tratado con fosfatasa alcalina de intestino de vaca. Cada uno de los fragmentos de ADN de 2,3 kbp fue ligado en el correspondiente sitio de la enzima de restricción de plc-h. Los productos de ligado fueron transfectados en la cepa HB1 de E. coli. Los cuatro clonados proporcionaron plásmidos que contenían ADN insertado con una longitud aproximada de 2,3 kbp. Un análisis adicional de enzimas de restricción demostró que,comomínimo, 7 plásmidos contenían el mismo fragmento de ADN. El lugar de integración del vector, no obstante, fue diferente a causa de la utilización de diferentes enzimas para abrir la molécula circular. Por medio de las enzimas de restricción BamHI EcoRI, PstI y XbaI, se determinó un mapa de enzimas de restricción de los cuatro clones del ADN de CAV. Se marcaron radioactivamente cuatro distintos plásmidos de ADN de CAV y se hibridaron con transferencias Southern de ADN digerido con BamHI aislado de células infectadas y no infectadas con CAV. Todos los clones comprobados hibridaron solamente con la molécula de ADN de 2,3 kbp presente en el ADN de las células infectadas con CAV. Actividad biológica de dos clones de ADN de CAV. Los dos clones plc-h/cav-ecori y plc-h/cav-psti de CAV fueron digeridos con enzimas de restricción de manera que el ADN del CAV fue cortado por completo con respecto al vector. Las moléculas de ADN de CAV lineales fueron tratadas con T 4 -ADN ligasa. Los ADN lineales de CAV fueron transformados de esta forma en circulares. El ADN de CAV clonado tenía ahora la forma circular de doble hebra poseída también por el tipo salvaje de ADN de CAV en células infectadas. Se transfectaron células MDCC-MSB1 y 14-X con los ADN clonados circulares de CAV. Para el clon plc-h/cav-ecori se observó un efecto citopatogénico (CPE) muy claro en ambos tipos de células. El clon plc-h/cav-psti provocó uncpeclaroencélulas MDCC-MSB1 y un CPE menos claro en células 14-X. No obstante, los sobrenadantes de células 14-X transfectadas con plc-h/cav-psti provocaron un CPE claro en células MDCC-MSB1. Las transfecciones con ADN aislado de células infectadas con CAV provocaron 6

7 también un CPE claro en células MDCC-MSB1, mientras que en células 14-X se pudo apreciar un CPE menos claro. No se obtuvo CPE después de transfección de células MDCC-MSB1 o 14-X con el ADN del vector plc-h Un análisis Southern mostró que en lisados de células MDCC-MSB1 y 14-XS infectadas con virus (paso 6), obtenidos por ADN de CAV clonado, se encontraba presente ADN de CAV. Una prueba de neutralización con células MDCC-MSB1 mostró que el CPE provocado por el ADN clonado en las células transfectadas era el resultado de infección CAV. Los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el CAV impidieron el CPE de células MDCC-MSB1 infectadas con progenie CAV de células transfectadas. Se inyectaron polluelos de un día de edad por vía intramuscular con sobrenadante de células transfectadas. En el pollo, los sobrenadantes provocaron la misma imagen clínica que el CAV de tipo salvaje; apareciendo crecimiento retardado de las diferencias en el peso corporal total, tuétano óseo pálido y valores reducidos del hematocrito (anemia), atrofia del timo (agotamiento de una población específica de células T) y mortalidad. Los sobrenadantes de células transfectadas con ADN del vector no provocaron síntomas de enfermedad en los polluelos de control. Análisis de secuencia del genoma de ADN de CAV de doble hebra. El genoma completo de doble hebra del ADN de CAV fue secuenciado por completo por medio del método Sanger (Sanger y otros, 1977) y el método Maxam-Gilbert. Por medio de los cebadores de secuenciado M13 y M13-inverso, se determinó la secuencia ADN de aproximadamente 20 bases de los clones 4 plc-h/cav (BamHI, EcoRI; PstI; XbaI). A continuación el genoma del CAV fue subclonado. De los cinco subclones distintos del genoma de ADN de CAV se determinó la secuencia de ADN por el método de Sanger y por medio de los cebadores M13 y/o el método de Maxam-Gilbert. De este modo se determinó la secuencia de ADN de ambas hebras del genoma de CAV. La longitud del ADN del CAV (doble hebra) es de 2319 bp. La primera base del sitio EcoRI del genoma circular de CAV se numera +1. La secuencia de la hebra de ADN que contiene la mayor parte de los marcos de lectura abiertos más grandes se muestra en la figura 1 y se denomina hilera (+). La composición de las bases de esta hilera es: 2, % adenina, 28,7% citosina; 27,7 % guanina, 18,1% timina. Los estudios por ordenador de posibles homologías del genoma de CAV con secuencias de virus ya conocidos mostraron que el ADN no había sido descrito anteriormente y que no formaba parte de grupos de virus descritos anteriormente. La hipótesis inicial de que el CAV es un parvovirus no es aceptable en lo que respecta a la secuencia y forma del genoma del ADN de CAV (circular). Por medio de estudios de ordenador se caracterizó la organización del genoma de CAV. Los marcos de lectura abiertos, elementos promotores/intensificadores, la señal y lugar de poliadenilacióny el origen de replicación son objeto de predicción. La figura 2 muestra los marcos de lectura abiertos de predicción, superando 0 bases, para ambas hebras de ADN del CAV. La figura 2A muestra los marcos de lectura abiertos empezando con el codon ATG. El codon ATG es el codon de iniciación más frecuentemente utilizado para las proteínas. Es notable que una de ambas hebras de ADN codifica para 3 proteínas que tienen una longitud de 449 aminoácidos (1,6 kda), 216 aminoácidos (24 kda), y 121 aminoácidos (13,3 kda). Todd y otros (1990) demostraron la existencia de una proteína de 0-kDa en el CAV purificado. Si todos los marcos de lectura abiertos son realmente utilizados, aproximadamente el 80 % del genoma del virus es trasladado a la proteína. Algunas regiones, incluso doblan. Es completamente posible que 3 marcos de lectura abiertos sean trasladados desde 1 ARN. El inicio de predicción de la molécula de ARN se encuentra en la posición (34) y la poli(a) adición en la posición (2317). La única señal poli(a) se encuentra en la posición (2287) de la hebra más. Es improbable que los marcos de lectura abiertos sean utilizados en otra hebra de ADN porque esta hebra carece de algunas secuencias de regulación esenciales. Las figuras 2B y 2C muestran marcos de lectura abiertos utilizando respectivamente CTG y GTG como codon inicial. No obstante, se describe solamente para algunas proteínas que estos codones iniciales son realmente utilizados (Hann y otros, 1988). Los estudios mediante ordenador de similitudes entre las proteínas separadas de CAV y proteínas ya conocidas proporcionaron solamente homologías limitadas en secuencias presentes en los programas disponibles. De acuerdo con ello, es difícil predecir a que tipo de proteína se parecen las proteínas de CAV. Una calificación relativamente alta fue la realizada por las proteínas cápsidas víricas, de unión de 7

8 ADN y de coagulación de la sangre. Los resultados no se indican en esta descripción. 2 La expresión de proteínas está regulada por elementos promotores/intensificadores (Jones, 1990). Un promotor eucariótico está posicionado principalmente justamente antes del inicio del transcripto. La secuencia de CAV contiene más arriba del lugar de terminación los elementos generales: secuencia TATA, secuencia SP1 y secuencia CAAT. La secuencia y la posición de estas secuencias corresponde de manera excelente a las descritas en la mayor parte de promotores eucarióticos (Tabla 1). Alrededor de la posición (28) pueden existir lugares de unión para los diferentes factores de transcripción: CREB, MLTF, GT, y PEA-1. Un gen eucariota contiene también elementos intensificadores que determinan la intensidad del intensificador eucariota. Son posibles elementos intensificadores las cinco repeticiones directas todas las cuales tienen una longitud de 21 nucleótidos y que están situadas entre las posiciones (144) y (2). Todas las repeticiones tienen 19 nucleótidos idénticos. Solamente los últimos dos nucleótidos son distintos. La repetición (1) es idéntica con (2), y (3) es igual a (). Las repeticiones (1), (2) y (3) están situadas una al lado de la otra, igual que las (4) y (). Situado entre las repeticiones (3) y (4) se encuentra una fractura de 12 nucleótidos. Un estudio por ordenador muestra que ningún intensificador descrito (eucariota) contiene todas las secuencias encontradas para los probables elementos intensificadores de CAV. Todas las repeticiones directas contienen un elemento ATF que puede ser involucrado en el incremento de la transcripción de los ARN de CAV. Las repeticiones directas contienen dos veces la secuencia CATCC y dos veces la secuencia CAGCC. La última secuencia se solapa con la secuencia CAAT. Estas cuatro secuencias tienen solamente 1 falta de correspondencia con la secuencia CACCC descrita por β-globina (Tabla 1). La figura 3 muestra que aproximadamente entre las posiciones () y (13) y entre las posiciones (2180) y (2270) de la hebra de ADN más se encuentran presentes estructuras en forma de horquilla del pelo muy grandes en la forma de ADN (hebra única) de CAV. Las estructuras de horquilla de pelo en el ADN pueden quedar involucradas en la replicación del ADN del CAV. Las estructuras de horquilla de pelo entre las posiciones (2180) y (2270) pueden encontrarse presentes no solamente en el ADN del CAV sino también en el ARN del CAV y es probable que jueguen un papel en la estabilidad del ARN del CAV. Diferentes formas de ADN de células infectadas con CAV Cuatro diferentes moléculas de ADN de CAV son visibles en una transferencia Northern de un preparado de ADN de células infectadas por CAV. El ADN fue hibridado con ADN marcado radioactivamente del clon plc-h/cav-ecori. Las moléculas de ADN de CAV son, teniendo en cuenta sus longitudes medidas y formas en un gel de agarosa no desnaturalizante y susceptibilidad a (s1) nucleasa, respectivamente círculos abiertos de doble hebra (3 kbp), ADN de doble hebra superarrollado (2 kbp), ADN de hebra única de forma circular (0,8 kbp) y ADN lineal de hebra única (1, kbp). En algunos casos, el ADN de doble hebra lineal del CAV es también visible (2,3 kbp). Todd y otros (1990) han medido una longitud de 0,8 kbp para el ADN de hebra única, circular, procedente de CAV aislado en base a la movilidad electroforética en un gel de agarosa no desnaturalizante. Detección del ADN de CAV en preparados de virus. Se aisló ADN total a partir de CAV y se purificó de acuerdo con el método descrito por Von Blow (1989). El preparado de ADN fue analizado en un ensayo Southern y fue marcado con una sonda de ADN de CAV conteniendo la totalidad de la secuencia de CAV clonada. El ADN aislado procedente de CAV purificado contiene una molécula de ADN que tiene una longitud de 0,8 kbp, medida en un gel de agarosa no desnaturalizante. En un análisis Southern de ADN aislado de CAV purificado con oligonucleótidos derivados de la secuencia de ADN de CAV clonada como sondas, se demostró que la hebra de ADN menos queda comprendida o encerrada en el virus. De esto se puede llegar a la conclusión de que el ADN de hebra única del CAV de la cápsida es la hebra menos. Análisis Southern de ADN procedente de aislamientos de CAV reales. Se prepararon preparaciones de ADN procedentes de aislados de CAV obtenidos a partir de pollos de grupos en los que se presentaba la enfermedad de Marek de modo extenso. Los preparados de ADN procedentes de aislados de CAV obtenidos en 12 empresas de Holanda fueron recogidos de manera no selectiva a partir de una colección de muestras. Solamente en el caso de una empresa se informó de una mortalidad más elevada debido a la enfermedad de Marek. Además, un aislado de CAV se originó a partir de un grupo de cobayas. Los aislados de CAV examinados por los inventores se obtuvieron 8

9 principalmente después de haber comprobado la atrofia del timo por examen por los Servicios Sanitarios de Animales. Con el objeto de estudiar el grado de similitud entre ADN de CAV clonado (plc-h/cav-ecori) y ADN de diferentes aislamientos reales de CAV se infectaron células MDCC-MSB1 con cepas de CAV aisladas. Se realizó un análisis Southern. Todos los preparados de ADN contenían moléculas de ADN que específicamente hibridaban con ADN de CAV clonado marcado con 32 P. Las moléculas de ADN de los diferentes aislamientos reales de CAV tienen longitudes que se corresponden con las del CAV clonado y son de doble hebra o de hebra única. Los análisis de transferencia Southern llevados a cabo directamente sobre muestras de tejidos de pollos infectados con CAV reales se observó que contenían moléculas de ADN que hibridaban con plc-h/cav-ecori marcado. Análisis de enzima de restricción de ADN procedente de aislamientos reales de CAV La similitud de ADN de diferentes aislamientos reales de CAV con el genoma de CAV clonado fue examinada adicionalmente por medio de análisis de enzima de restricción. Los preparados de ADN de los aislamientos CAV y de CAV clonado se cortaron separadamente con siete enzimas de restricción. Las enzimas BamHI, BgII, SstI, y XbaI demostraron el corte de todos los ADN de forma idéntica. El ADN de la mayor parte de aislamientos reales contenía dos sitios AccI y dos sitios HindIII, mientras que el ADN de solamente unos pocos aislamientos contenía el sitio EcoRI. La figura resume los mapas de enzimas de restricción del CAV clonado y los diferentes aislamientos reales. Para cada sitio de enzima de restricción el número de aislamientos reales que contienen el sitio relevante se han indicado con corchetes. Reacción de la cadena de polimerasa (PCR) de ADN de aislamientos reales de CAV. Los oligonucleótidos CAV-1 y CAV-2 (figura 4) derivados de la secuencia de ADN de CAV clonada fueron sintetizados. Se llevó a cabo un PCR utilizando estos oligonucleótidos sintéticos para detectar específicamente ADN de CAV en la realidad. Se amplificaron ADN aislado de células MDCC-MSB1 infectadas con los diferentes aislamientos de CAV y ADN aislado de diferentes células no infectadas. Después de la amplificacióndeladn,eladnfueseparadoelectroforéticamente según longitud en un gel de agarosa/bromuro de etidio. Una banda amplificada de 186 bp (es decir, el valor teórico esperado) era visible en todas las muestras de ADN de células infectadas con diferentes aislamientos de CAV. La banda específica no se encontraba presente después de amplificación de ADN aislado procedente de células no infectadas. Las bandas de ADN amplificadas de todos los aislamientos reales muestran una proporción idéntica de emigración en el gel de agarosa. Este resultado implica que no hay grandes delecciones o inserciones en esta parte del genoma de los diferentes aislamientos reales de CAV. Un análisis Southern con el oligonucleótido CAV-3 (figura 4) marcado con 32 Pmostró que el ADN amplificado en 186 bp es específico de CAV y que ninguna otra banda de ADN hibridiza con la sonda CAV-3. Se examinó la susceptibilidad de detección del PCR de CAV. Se aisló ADN procedente de células infectadas con CAV, se diluyó paso a paso, se amplificó y se analizó sobre un gel de agarosa/bromuro de etidio. Después de amplificación de las muestras conteniendo una cantidad de ADN correspondiente a la cantidad de ADN aproximadamente en 0 células infectadas con CAV, se detectó un fragmento de ADN de 186 bp específico de CAV. No obstante, si el ADN amplificado era sometido a análisis Southern con ADN de CAV-3, marcado con 32 P, se encontraba una cantidad de ADN correspondiente al ADN de la célula I dando como resultado una banda de ADN específica de CAV claramente visible. El PCR de CAV es un método de detección muy sensible que es específico para los aislamientos de CAV examinados hasta este momento. El análisis de transferencia por ranura ( slot ) de ADN de aislamientos reales de CAV son sondas de ADN de CAV marcado con digoxigenina. Además del PCR,se desarrolló un ensayo para la detección de ADN de aislamientos reales de CAV. Esta prueba no utiliza sondas radioactivas. El inserto de ADN de CAV del clon plc-h/cav-ecori fue marcado con preparados de 11-dUTP-dioxigenina. Preparados de ADN procedentes de células MDCC- MSB1, infectadas separadamente con los diferentes aislamientos de CAV, fueron transferidos sobre un filtro y analizados en cuanto a su capacidad de hibridar con la sonda de ADN marcada con digoxigenina. Los preparados de ADN procedentes de células MDCC-MSB1 infectadas con los diferentes aislamientos de CAV hibridizan con la sonda de ADN marcada con digoxigenina, mientras que el ADN de cultivos celulares no infectados no hibridiza. Esta prueba utilizando un ADN de CAV marcado no radioactivamente es apropiado, por lo tanto, para la detección de ADN de aislamientos reales de CAV. 9

10 Aplicaciones ADN. 2 Secuencias de CAV de, por ejemplo, el plásmido plc-h/cav-ecori ADN o parte del mismo, se pueden utilizar para demostrar ADN de CAV y/o ARN en preparados a examinar, para objetivos de investigación y diagnóstico. El ADN puede ser marcado radioactivamente o de otras formas, por ejemplo, con biotina/digoxigenina. Por medio de transferencias slot ADN/ARN, análisis Southern/Northern e hibridación in vitro, se puede determinar la presencia de ácidos nucleicos de CAV. Partes de las secuencias de CAV utilizadas en este caso son también oligómeros de ADN. Los oligómeros derivados de secuencias de CAV del clon plc-h/cav-ecori se pueden utilizar en una Reacción en Cadena de Polimerasa para localizar concentraciones muy reducidas de ADN/ARN de CAV. El PCR es un método muy sensible, frecuentemente utilizado para la detección de virus. Son posibles en la práctica juegos de diagnóstico basados en las aplicaciones anteriormente indicadas. Para objetivos de investigación son importantes técnicas tales como mapas (S1) y extensión de cebador con fragmentos de ADN de CAV. Mediante estos dos métodos se puede cuantificar y caracterizar adicionalmente el ARN del CAV. Se pueden estudiar oligómeros en configuración antisentido para estudiar las funciones de los genes. Éstos pueden servir también como modelo para estudiar nuevos métodos de inhibición de la replicación de virus. Se puede utilizar ADN de CAV como portador en la transfectación para pequeños fragmentos de genes, particularmente si las características patogénicas han sido eliminadas por delección en el genoma de CAV. Los oligómeros de CAV en configuración antisentido se pueden expresar en vectores del virus, lo cual posibilita el estudio de la replicación CAV u otras funciones de los genes en animales vivos o in vitro. ARN Fragmentos de ADN de CAV clonados en vectores Sp6/T7 tienen como resultado productos de ARN de CAV. Los ARN de CAV obtenidos por transcripción in vitro se pueden utilizar para síntesis in vitro/in vivo de proteínas de CAV. De este modo, moléculas de ARN, por ejemplo, en un extracto de germen de trigo, se pueden trasladar en proteínas (traslación in vitro). Las proteínas de CAV obtenidas por una traslación in vitro pueden ser utilizadas a continuación, por ejemplo, para el trazado o detección de anticuerpos dirigidos contra CAV en el suero de pollos (ver más adelante). Las moléculas de ARN de CAV pueden asimismo ser forzadas hacia adentro de células por microinyección para su traslación en su interior en proteínas. De este modo, los efectos de las proteínas de CAV se pueden estudiar a nivel celular. También se pueden analizar las interacciones proteína/proteína y/o proteína/adn. También se pueden utilizar los ARN de CAV como sondas para detectar ácidos nucleicos de CAV en los preparados. Los análisis pueden ser llevados a cabo por medio de transferencia slot, análisis Southern, Northern e hibridación in situ. Estos métodos pueden ser utilizados para desarrollar pruebas de diagnóstico para CAV. Proteínas Todas las proteínas de CAV pueden ser expresadas en sistemas procariotas o eucariotas. Esto requiere que los marcos de lectura abiertos que se han encontrado, sean clonados con un vector de expresión adecuado. Para el sistema bacteriano existe un vector de expresión basado en el promotor (T7) adecuado para la expresión de marcos de lectura abiertos de CAV. El sistema de baculovirus, levadura y el sistema CHO-dhfr son posibles sistemas de expresión eucariota. También se pueden escoger para ello vectores virales, tales como vectores de retrovirus. Las proteínas de CAV o epítopos situados en las mismas pueden ser utilizados para detectar anticuerpos dirigidos contra CAV. Así pues, se pueden detectar pollos infectados con CAV. Las proteínas de CAV oepítopos situados sobre las mismas se pueden utilizar en inmunoensayos, tales como transferencias por inmunoperoxidasa, ensayos ELISA y ensayos de inmunofluorescencia.

11 2 Las proteínas de CAV o epítopos situados sobre las mismas pueden ser utilizados para proporcionar inmunidad humoral y/o relacionada con las células contra CAV. Las proteínas de CAV obtenidas por expresión en sistemas eucariotas y procariotas vector/huésped pueden ser utilizadas para su utilización en vacunas de subunidades. Por medio de las proteínas de CAV o epítopos situados sobre aquéllas, se pueden obtener anticuerpos específicos de CAV que posibilitan el trazado de proteínas de CAV en preparados de pollos infectados con CAV (ver más adelante). Anticuerpos En una serie de pruebas de infección en polluelos se pudo confirmar que algunos anticuerpos maternos pueden proporcionar una protección pasiva efectiva contra la infección por CAV. Los anticuerpos maternos fueron transmitidos a los polluelos por vía natural y también por medio de inyección de polluelos recién nacidos con anticuerpo de CAV conteniendo extractos de yema de huevo. También se consiguió protección pasiva contra infección por CAV por inyección de extractos de yema de huevo de huevos procedentes de ponedoras que habían sido infectadas por CAV justamente antes del período de puesta de huevos. La vacunación de ponedoras con proteínas CAV expresada en uno de los sistemas de expresión anteriores tendrá como resultado la formaciónde anticuerpos maternos. Los pollosjóvenes de estas ponedoras serán protegidos contra infección por CAV. Se pueden desarrollar pruebas de diagnóstico en base a los anticuerpos contra CAV. Se pueden utilizar tanto cuerpos policlonales como monoclonales para ello. Por medio de los anticuerpos específicos CAV se pueden examinar preparados para la presencia de proteínas de CAV. Las aplicaciones antes mencionadas de los anticuerpos de CAV son posibles para los anticuerpos de acuerdo con la invención, obtenidos por procesos tal como se han descrito, de igual manera que para anticuerpos de CAV naturales. Vacunas contra virus vivos Dotando al sistema inmune de proteínas víricas por medio de un vector de virus vivo, existen probabilidades de una respuesta inmune mejor que una vacuna subunitaria. Uno o varios marcos de lectura abiertos de CAV (en todo o en parte) pudieron ser clonados en vectores de virus vivos. En las aves se pueden utilizar solamente vectores de virus vivos que, en sí mismos, muestran una buena aplicación en el sistema aviar. Se pueden escoger como vectores para aplicación en los pollos, por ejemplo, el virus de la viruela de las aves, vectores retrovíricos, vectores de herpesvirus (serotipos de herpesvirus aviares 1, 2 y 3) y virus de la laringotraqueitis infecciosa y posiblemente también adenovirus tales como CELO. La inmunización con vectores de virus vivos tal como se han indicado protege contra CAV y el virus portador. Por aplicación de una o más deleciones en el genoma de CAV se pueden desarrollar vacunas que inmunizan contra infección por CAV en polluelos jóvenes. Cuando se aplican las deleciones el carácter patogénico de la infección por CAV debe ser eliminado pero las características replicantes y, por lo tanto inmunizantes, deben ser conservadas. El genoma de CAV puede ser transformado por sí mismo como vector de virus vivo para la expresión de antígenos de otros virus. Esto requiere que el genoma de CAV sea cambiado de manera tal que además o en vez de las proteínas CAV se expresen virus de proteínas extraños. Los vectores de CAV pueden ser construidos por lo tanto de manera tal que tiene lugar la protección contra virus extraños sola o asimismo contra CAV, dependiendo de la expresión de las proteínas víricas por el vector recombinante en el animal vacunado. Las vacunas de CAV producidas en forma de vacuna subunitaria, una vacuna de deleción o un fragmento de gen en otro vector de virus se utilizarán principalmente para la vacunación de ponedoras. No obstante, la vacunación de pollos de poca edad, por ejemplo en combinación con vacunación contra la enfermedad de Marek, sigue siendo también una utilización posible de la invención. Elementos intensificador/promotor. 11

12 2 Los elementos promotores e intensificadores de CAV pueden ser clonados en vectores de ADN. Bajo la regulación del promotor/intensificador de CAV, se pueden expresar proteínas de CAV o proteínas extrañas en células de pollos y en otros tipos de células. Se puede concebir que el promotor de CAV está constituido por células de tuétano de hueso funcionales (en pollos). Como sistema modelo para terapia de genes las proteínas extrañas pueden ser expresadas in vitro en células de tuétano óseo por medio de elementos promotores/intensificadores de CAV opcionalmente en combinación con vectores retrovíricos. Las células genéticamente modificadas de tuétano de hueso pueden ser entonces transplantadas al tuétano de hueso o, en el caso presente, al pollo. Para fragmentos de gen muy pequeños, el propio genoma de CAV puede ser utilizado como vector. Los elementos intensificador/promotor de CAV podían ser también activos en otros organismos. Si éste fuera el caso, los elementos pueden ser también utilizados, por ejemplo, en el sistema de ratón como modelo para terapia de gen. Los productos del propio CAV objeto de regulación del promotor de CAV de la propia solicitante u otro promotor proporcionan asimismo posibilidades para estudiar y desarrollar técnicas para la terapia de genes. La posibilidad de utilizar el genoma completo de CAV de manera entera o substancialmente entera como vector de clonado, es decir, como un tipo de plásmido eucariota para sistemas aviares, es una posibilidad a considerar de modo real teniendo en cuenta la estructura que se ha descubierto para el genoma de CAV. Depósito del clon de CAV plc-h/cav-ecori Un preparado en glicerol de células de HB1 transformadas con el plásmido plc-h/cav-ecori fue depositado en el Centraalbureau voor Schimmelcultures de Baarn, Holanda, en 7 de septiembre de 1990, con el número CBS Descripción de las figuras La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del ADN de CAV clonado. La longitud total es de 2319 bases, tomándose el primer G del sitio EcoRI como N 1. La figura 2 muestra los cuadros de lectura abiertos de predicción (ORF) que tienen una longitud de más de 0 bases para ambas hebras de ADN. Los ORF de predicción para los 3 codones distintos de inicio ATG, CTG y GTG están indicados en las 3 subfiguras 2A, 2B y 2C, respectivamente. La figura 3 muestra algunas estructuras en horquilla de pelo de predicción del genoma de CAV que consisten en ADN de hebra única. La figura 4 muestra los oligonucleótidos utilizados en el PCR. Se han mostrado la secuencia de ADN y la posición de los oligonucleótidos del genoma de CAV. La posición de los nucleótidos en el genoma de CAV corresponde al mostrado en la figura 1. La figura muestra el mapa de enzima de restricción del ADN de CAV clonado. Se han indicado dentro de corchetes el número de aislamientos de CAV para un total de 21 poseídos por lugares de enzima de restricción relevantes en el genoma. Materiales y métodos Cultivos de células y virus. Los aislamientos de CAV fueron cultivados en líneas celulares linfoblastoides transformadas procedentes de tumores de pollos inducidos por el virus de la leucosis aviar del subgrupo A(14-X-) o por el virus de la enfermedad de Marek (MDCC-MSB1). Los cultivos de células fueron infectados con 0,1-1 TCID0 aproximadamente por célula. Después de dos días las células fueron recogidas. Las células fueron infectadas con una progenie de virus de ADN de CAV clonado o aislamientos reales. El CAV-Cux-1, aislado originalmente en Alemania a partir de un grupo de pollos que estaban afectados por la enfermedad de Marek (Von Blow y otros, 1983, 198), fue proporcionado por Dr. M.S. McNulty, Veterinary Research 12

13 Laboratories, Belfast, Irlanda del Norte. En Enero de 1988, el Dr. J. P. Roseberger, Universidad de Delaware, Newark, USA, envió a los inventores dos muestras de sangre para la determinación de la virulencia de la enfermedad de Marek cepa T-1704 y su derivada, MDV-Del-S que es el primer paso en un pollo. Los inventores obtuvieron los aislamientos CAV-T-1704 y CAV-Del-S procedentes de polluelos SPF infectados con la cepa MDV T-1704 y su derivado MDV-Del-S. Los aislamientos de CAV holandés fueron seleccionados aselectivamente a partir de una serie de sesenta, todos los cuales fueron cultivados en cultivos celulares MDCC-MSB1. El material de campo fue suministrado por J.C. van den Wijngaard, Gezondheidsdienst Brabant en Boxtel y J. Naber, Gezondheidsdienst voor Pluimvee en Doorn, principalmenteporquesedeterminó atrofia del timo durante la autopsia. Se añadieron a la serie los aislamientos de CAV obtenidos de nuestros propios grupos de aves SPF. Aislamiento de ADN total. 2 Se resuspendieron virus y preparados de hígado en mm Tris HCl-pH 7,, 2mM EDTA, 0,2 % SDS, 0,6 mg/ml Proteinase-K y se incubó durante 1 hora a 37 C. Los preparados fueron extraídos con fenolcloroformo-alcohol isoamílico (2:24:1), y el ADN fue precipitado por medio de etanol. Las pastillas de ADN fueron resuspendidas en 0 µl mm Tris HCl-pH 7,, 1 mm EDTA. Extracción y análisis de ADN de bajo peso molecular. Se aisló ADN de bajo peso molecular de células infectadas por CAV 14-X y MDCC-MSB1 y células 14-X no infectadas, de acuerdo con el método descrito por Hirt (1967). El ADN fue separado sobre geles de agarosa y después de tintado con bromuro de etidio, se analizó directamente por medio de luz UV o fue transferido sobre un filtro Biotrace de acuerdo con el método descrito por Southern (1982). Las transferencias fueron hibridadas con ADN con cebado al azar marcado con 32 P, aislado a partir de ADN de bajo peso molecular de células 14-X infectadas por CAV que tienen una longitud de 2,7-3, kb. Clonado del ADN de CAV. 3 La totalidad del genoma de ADN del CAV fue clonado en el vector bacteriano plc-h. Se clonaron partes del genoma de ADN de CAV en el vector plc-19r. Todas las fases de clonado de ADN plásmido fueron llevadas a cabo en principio de acuerdo con los métodos descritos por Maniatis y otros (1982). Análisis de secuencia de ADN de CAV. Se purificaron plásmidos de ADN de CAV por medio de gradiente CsC1 y Sephacryl-S00 (pharmacia) por cromatografía. Se secuenció el ADN de doble hebra por medio de la T 7 DNA polimerasa (Pharmacia) o por medio de Taq DNA polimerasa (Promega). Ambos métodos fueron llevados a cabo de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por Pharmacia o Promega. Los oligonucleótidos fueron quinados con T4 nucleótido quinasa de Pharmacia. Se secuenciaron paradas bruscas ( Strong stops ) de acuerdo con el método descrito por Maxam and Gilbert (1977). Circularización del genoma del ADN de CAV clonado. 4 0 µg deplásmido de ADN de clones que contienen el genoma completo de ADN de CAV fueron digeridos con enzima de restricción de manera que se separó la totalidad del inserto de ADN de CAV del vector ADN. El tratamiento de T 4 -ADN ligasa de la molécula de 2,3 pares de kilobases de molécula de ADN de CAV lineal tuvo como resultado un ADN de CAV circular de doble hebra. Los productos de ligado fueron analizados sobre 0,8% de gel de agarosa. Transfección de DEAE-dextrano Para la transfección de células 14-X y MDCC-MSB1 se suspendieron 2 µg de ADN de CAV religado dos veces en 2 µl de agua Milli-Q y se mezclaron con 2 µl detampón TBS. Se añadieron µl mg/ml DEAE-dextrano a la mezcla de ADN, y la mezcla fue incubada durante minutos a temperatura ambiente. Células 14-X. Una placa de cultivo de tejidos de 0 mm con 1-2x 6 células 14-X placa fue lavada dos veces con tampón TBS. El tampón TBS fue eliminado por completo de la monocapa de células, y se añadieron 0 µl de DEAE-dextrano/ADN en forma de dilución. Las células fueron incubadas durante minutos a temperatura ambiente. La mezcla DEAE-dextrano/ADN fue substituida por 2 ml 2 % DMSO/TBS, y la monocapa de células fue incubada durante 2 minutos a temperatura ambiente. 13

14 Las células fueron lavadas dos veces con tampón TBS y, a continuación, se añadió el medio de cultivo de los tejidos (RPMI 16 o E-MEM). Las células fueron incubadas a 37 C- % CO Células MDCC-MSBI. Se centrifugaron aproximadamente 2x 6 células MDCC-MSB1 a 00 rpm en una centrífuga de mesa. El medio fue substituido por ml de tampón TBS y las células fueron resuspendidas cuidadosamente. La etapa de lavado fue repetida. Todo tampón TBS fue eliminado, la pastilla de células fue resuspendida cuidadosamente en 0 µl de mezcla de DEAE-dextrano/DNA y se incubó a temperatura ambiente durante minutos. Se añadieron 0, ml 2 % DMSO/TBS y la suspensión fue incubada durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron ml de TBS y las células fueron centrifugadas a 00 rpm en una centrifugadora de mesa. El sobrenadante fue eliminado y se añadieron 0 ml del medio de cultivo del tejido. Las células fueron resuspendidas y separadas por centrifugación. Las células fueron recibidas en ml de medio de cultivo de tejidos e incubadas a 37 C- % CO 2.Amodo de control se utilizaron para la transfección 2 µg plc-h plásmido. Prueba de neutralización in vitro. Se infectaron células MDCC-MSB1 con sobrenadante de MDCC-MSB1 y se transfectaron células 14-X con ADN de CAV clonado. Se infectaron aproximadamente 2 x 4 células. El contenido devirusdeesteinóculo no era exactamente conocido. En la mitad de los cultivos de células infectados se añadieron al medio suero policlonal con una actividad de neutralización dirigida contra CAV, diluido 1:0. A modo de control, una serie de pozos con células de MSB1 infectadas con CAV fueron incluidos en el proceso, no añadiéndose al medio antisuero alguno contra CAV. Infección por CAV de polluelos de un día de edad. Se inyectaron por vía intramuscular en polluelos de un día de edad sobrenadantes de ADN de CAV ycélulas MDCC-MSB1 14-X transfectadas con ADN de control. Seis días después de la infección se llevó a cabo una autopsia en polluelos por grupo, después de haber determinado en primer lugar el valor del hematocrito y el peso corporal total. Para aislamiento del virus y para inmunohistoquímica, se recogieron sangre en heparina, timo y tuétano óseo. La investigación de inmunohistoquímica tuvo lugar por medio de tinción de peroxidasa de secciones de timo con, entre otros, el CV1-8.1 monoclonal específico de CAV. Catorce y veintiocho días después de la infección se llevó a cabo una autopsia de otros polluelos y se llevaron a cabo todas las determinaciones anteriormente indicadas. Reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos fueron sintetizados por medio de un sintetizador de ADN tipo Ciclón (Biosearch Inc. USA). La secuencia fue derivada de la secuencia de ADN de CAV mostrada en la figura 1. El PCR fue aislado en ADN procedente de células MDCC-MSB1 infectadas y no infectadas con CAV. La concentración final de los reactivos fue: 0 mm KCl, mm Tris-HCl (ph 8,3), 3mM MgCl 2,0,01%de sero albúmina de vaca, 0 µm de cada uno de dntp, 1 µm de cada uno de los oligonucleótidos y 2 unidades de Tag-ADN polimerasa (CETUS, USA) en un total de 0 µl. Las muestras de ADN fueron incubadas cíclicamente veces a 93 C durante 1 minuto, a C durante 1 minuto y a 72 C durante 3 minutos en un ciclizador térmico Perkin Elmer/Cetus. Una decena parte del ADN amplificado fue directamente analizado sobre un gel al 2 % de agarosa/bromuro de etidio o por análisis de transferencia Southern. La sonda de ADN utilizada fue el oligonucleótido que se había marcado de forma terminal con 32 P de acuerdo con Maniatis y otros (1982). Análisis de transferencia por puntos ( dot blot ) El inserto de ADN de CAV de plc-h/cav-ecori fue aislado y marcado con digoxigenina-11-dutp (Boehringer, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del suministrador. Se saturaron filtros Blotrace-RP con 1,M NaCl y 0, M de citrato sódico. Las muestras de ADN fueron resuspendidas en mm Tris HCl (ph 7,) y 1 mm EDTA, hervidas durante 3 minutos, enfriadas sobre hielo y colocadas sobre el filtro. El filtro fue secado a temperatura ambiente e incubado durante minutos a 6 C. Los filtros fueron hibridados con ADN marcado con digoxigenina. El ADN marcado con digoxigenina se hizo visible por medio de tinción inmunológica de acuerdo con el protocolo del suministrador. 14

15 2 TABLA 1 Elementos de la secuencia de unión del factor de transcripción conocido en la región amplificadora/promotora de CAV Elemento Secuencia Secuencia de Posición en la de consenso CAV secuencia de CAV 1. -TATA-# GTATA A / t A A / T GTATATAT SP1 GGGCGG GGGCGG CREB TGACGTCA TGACGTTT PEA-I (Py) GGAAGTGACTAAC GAAAGTGACTTTC GT (SV ) G G / C TGTGGAA A / T GT CGTTGCGAAAGT MLTF GGCCACGTGACC TGCCACTGTCGA CCAAT-TF AGCCAAT AGCCAAT CACCC-# CACCC CAGCC ATF ACGTCA ACGTCA CACCC-# CACCC CAGCC ATF ACGTCA ACGTCA SPI (weak) GAGGCG ATF ACGTCA ACGTCA CACCC-# CACCC CATCC ATF ACGTCA ACGTCA CACCC-# CACCC CATCC ATF ACGTCA ACGTCA el sitio CAP se encuentra probablemente a unos + perfecta homología entre CAV y secuencia de consenso se ha encontrado secuencia de consenso en varios virus # secuencia de ADN de un elemento Referencias De Boer, G.F., Pol. J. M. A., and Jeurissen S.H.M. (1988). Marek s disease vaccination strategies using vaccines made from three avian herpesvirus serotypes. Proceedings First International Poultry and Poultry Diseases Symposium, Manisa, Turkey, pp (in Turkish, English abstract). 2. De Boer, G.F., Jeurissen, S. H. M., Van Roozelaar, D. J., Vos, G. J. and Koch, G. (1989a). Enhancing effects of chicken anaemia agent (CAA) on Marek s disease pathogenesis. Proceedings of the Thirtyeight Westem Poultry Disease Conference, Tempe, Arizona, U.S.A., p De Boer, G. F., Pol. J. M. A., and Jeurissen, S. H. M. (1989b), Enhancing effects of chicken anaema agent (CAA) on Marek s disease pathogenesis, Abstractbook IXth Intem. Congress of the WVPA, Brighton, U. K., p Engstrom B. E. (1988). Blue wing disease of chickens: Isotation of avain reovirus and chicken anaemia agent Avian Pathology 17, Engström, B. E., Fossum, O., and Luthman, M. (1988). Blue wing disease of chicken: Experimental infection with a Swedish isolate of Chicken Anaemia Agent and an avian Reovirus. Avian Pathology 17, Hann, S. R., King M. W., Bentley, D. L., Anderson, C. W., and Eisenman, R. N. (1988). A non-aug translational initiation in c-myc exon 1 generates an N-terminally distinct protein whose synthesis is disrupted in Burkitt s Iymphomas. Cell 2, Hirt, B. (1967). Selective extraction of polyoma DNA from injected mouse cell cultures. Journal of Molecular Biology 26,

16 8. Jeurissen, S. H. M., Pol, J. M. A., De Boer, G. F. (1989). Transient depletion of cortical thymocycles induced by chicken anaemia agent. Thymus 14, Jones, N. (1990). Structure and function of transcription factors. Seminars in Cancer Biology 1, Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 11. Maxam, A. M., and Gilbert, W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proceedings National Academic Sciences U. S. A. 74, McNutty, M. S., Connor, T. J., McNeilly, F., McLoughlin, M. F., and Kirkpatrick, K. S. (1990). Preliminary characterisation of isolates of chicken anaemia agent from the United Kingdom, Avian Pathology, In Press. 13. Ritchie, B. W. Niagro, F. D., Lukert, Steffens, W. L., and Latimer, S. (1989). Characterization of a new virus from cockatoos with psittacine beak and feather disease, Virology 171, Sanger, F., Nicklen, S., and Coulsen, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proceedings National Academic Sciences U. S. A. 74, Southem, E. M. (197). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis, Journal of Molecular Biology 98, Tischer, I., Gelderblom, H., Vetterman, W. and Koch, M. A. (1982). A very small porcine virus with circular, single-stranded DNA, Nature 29, Todd, D., Creelan, J. L., Mackie, D. P., Rixon, F., and McNulty M. S. (1990). Purification and biochemical characterisation of chicken anaemia agent. Journal of General Virology 71, Vielitz, E. (1989). Protect your chicks from infectious anemia. Poultry Science 68, Von Billow, V., Fuchs, B., Vielitz, B., and Landgraf, H. (1983). Frusterblichkeitssyndorm bei Küken nach Doppelinfection mit dem Virus des Marekschen Krankheit (MDV) und eine Anämie-Erreger (CAA). Zentralblatt für Veterinarmedizin B., Von Blow, V., Fuchs, B., and Bertram, M. (198). Untersuchungen über den Erreger der Infectiosen Anämie-Erreger bei Hühnerkücken (CAA) in vitro: Vermehrung, Titration, Serumneutralisationstest und indirekter Immunofluoreszenstest. Zentralblatt für Veterinarmedizin B., 32, Yuasa, N., Taniguchi, T., and Yoshida, I. (1979). Isolation and some properties of an agent inducing anaemia in chicks. Avian Diseases 23, Yuasa, N., Taniguchi, T., and Yoshida, I. (1980). Effects of infectious bursal disease virus infection on incidence of anaemia by chicken anaemia agent. Avian Diseases 24, Yuasa, N. (1983). Propagation and infectivity tiration of the Gifu-1 strain of chicken anaemia agent in a cell line (MDCC-MSB1) derived from Marek s disease lymphoma. National Institute of Animal Health Quarterly 23,

17 REIVINDICACIONES 2 1. Método para la producción de virus de anemia de pollos (CAV) en forma de doble hebra, comprendiendo las fases de aislar ADN de bajo peso molecular procedente de células infectadas por CAV, fraccionamiento de dicho ADN de bajo peso molecular sobre agarosa/bromuro de etidio, comparación de dicho modelo de fraccionado con el modelo de fraccionado de la misma célula no infectada, aislando el ADN presente solamente en la célula infectada y comprobando que este ADN es de doble hilera por análisis de enzima de restricción. 2. Ácido nucleico recombinante en forma de una molécula de ADN de doble hebra, que comprende una secuencia de nucleótidos específica del virus de anemia del pollo (CAV) que se corresponde con la secuencia de nucleótido del genoma de CAV o una parte del mismo, que se puede obtener por un método según la reivindicación Ácido nucleico recombinante, que comprende una secuencia de nucleótidos específica de CAV, que corresponde o es complementaria como mínimo a una parte específica de CAV de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1, una secuencia de nucleótidos homóloga de aquélla en un mínimo de %, que se puede obtener por un método según la reivindicación Ácido nucleico recombinante, según la reivindicación 2 ó 3, que comprende una secuencia de nucleótidos específica de CAV que se corresponde o es complementaria de una secuencia de nucleótidos que se presenta en un genoma de CAV, de manera que dicha secuencia de nucleótidos codifica para, como mínimo, una parte de una proteína de CAV.. Ácido nucleico recombinante, según las reivindicaciones 2-4, que comprende además una secuencia de nucleótidos derivada de un vector procariótico o eucariótico. 6. Ácido nucleico recombinante, según las reivindicaciones 2 -, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína distinta de una proteína de CAV o una secuencia de nucleótidos que codifica para una parte de dicha proteína distinta. 7. Ácido nucleico recombinante, según las reivindicaciones 2-6, que comprende una secuencia de nucleótidos que no se presenta en el genoma de CAV que tiene una función reguladora Ácido nucleico recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 3-7, marcado con uno o varios marcadores adecuados para el marcado de ácidos nucleicos tales como radioisótopos, moléculas de enzimas, haptenos, substancias fluorescentes, tintes, pigmentos y marcadores en partículas. 9. Utilización del ácido nucleico recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3,como sonda específica de CAV o cebador en un proceso de detección de ADN o ARN de CAV.. Equipo de diagnóstico para detectar ADN o ARN de CAV que contiene ácido nucléico recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 2-3 como sonda o cebador específico de CAV Célula procariótica o eucariótica, que contiene un ácido nucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 17

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