VIGILANCIA DEL VIRUS CHIKUNGUNYA POR LABORATORIO EN ARGENTINA

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1 VIGILANCIA DEL VIRUS CHIKUNGUNYA POR LABORATORIO EN ARGENTINA Bioq. Victoria Luppo Laboratorio de Arbovirus Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH) Dr. J.I.Maiztegui - ANLIS, Pergamino-Argentina

2 CHIKUNGUNYA Virus del género Alphavirus y Flia Togaviridae Deriva de Makonde: aquel que se encorva Son esféricos, con una nucleocápside dentro de una envoltura lipoproteica. Son virus con genoma de RNA de polaridad positiva de aprox KB Genes proteínas no estructurales: replicación del virus; genes de proteínas estructurales: implicadas en el reconocimiento con el sistema inmune (epítopes específicos) Está Relacionado Genéticamente Y Serológicamente a O nyong-nyong, Igbo Ora Y En Menor Medida Mayaro Y Ross River 1 Serotipo 3 Genotipos Principales: Africa Occidental (selvatico) Africa Central/Este/Sur (ECSA) Asiatico-Americano Proteínas no estructurales Proteínas estructurales

3 Selección, recolección y envío de muestras Selección de muestras a procesar: Muestras de pacientes con inicio agudo de fiebre >38.5º C, artralgia grave o artritis no explicada por otra condición médica, que reside o haya visitado áreas con circulación de CHIKV. Tipo de muestra: Suero de Fase aguda: hasta 8 días tras el inicio de síntomas Suero de Fase convalesciente: días tras el inicio de síntomas LCR: casos de meningoencefalitis. Conservación de la muestra: -Refrigerada si se procesa dentro de las 48 hs -Congelada si se procesa después de las 48 hs Envío de la muestra -Con hielo seco (en lo posible), o con geles refrigerantes para asegurar la cadena de frío -Siempre con la ficha clínico-epidemiológica completa (fecha de inicio de los síntomas, Fecha toma de muestra, Historia de viajes, antecedentes de vacunación, etc) -Triple envase

4 VIREMIA Y CINETICA DE ANTICUERPOS EN INFECCIONES POR CHIKV DIAS DE EVOLUCIÓN

5 Técnicas de laboratorio para CHIK Aislamiento viral e identificación por IF o RT-PCR Detección de genoma viral (RT-PCR convencional y en Tiempo Real ) Detección de anticuerpos contra proteínas virales: Elisa IgM/IgG, Neutralización por reducción del número de placas.

6 Inactivación 1er paso extracción del RNA (BSL2) Algoritmo para detección de CHIKV, DENV y requerimientos de Bioseguridad Muestra de Caso sospechoso de CHIKV y DENV < 8 días de evolución Serología en casos RT-PCR (-) CHIK en BSL2 RT- PCR DENV y CHIKV ELISA IgM DENV (desde 4 dpi) Positivo Negativo Negativo Positivo Secuenciación Filogenia Aislamiento Viral (BSL3) Positivo Estudiar PAR SEROLÓGICO por Neutralización r técnica de para CHIK y otros Alphavirus (BSL3) IgM CHIKV Negativo Solicita Segunda muestra para repetir serología Estudiar por técnica de neutralización para DEN y otros Flavivirus (BSL2, virus quiméricos para SLEV y WN, cepa vacunal YFV)

7 Algoritmo para detección de CHIKV, DENV y requerimientos de Bioseguridad Caso sospechos de DENV y CHIKV 8 días de evolución Serología en BSL2 ELISA IgM DENV y CHIK V Positivo CHIKV Positivo DENV Negativo DENV y CHIKV Estudiar PAR SEROLÓGICO por técnica de neutralización para CHIK y otros Alphavirus ( BSL3) *Estudio de segunda muestra para descartar posible infección secundaria de DENV sin IgM (Clínica y Epidemiología) Estudiar PAR SEROLÓGICO por técnica de neutralización para DENV y otros Flavivirus (BSL2, virus quiméricos para SLEV y WN, cepa vacunal YFV) Se descarta caso de DENV* o CHIKV Búsqueda de otros Arbovirus

8 TÉCNICAS DIRECTAS

9 AISLAMIENTO VIRAL Gold Stándard de los métodos directos Muestra indicada: suero de fase aguda (< de 8 días de evolución y perfectamente conservada) Inoculación en lineas celulares suceptibles: BHK-21, HeLa, Vero y C6/36. Efecto citopático al 3er día. Confirmación por técnica de IF, RT-PCR convencional o en real time del sobrenadante celular. Aislamiento en laboratorio BSL-3 de cepas obtenidas en el INEVH de casos importados

10 Aislamiento de cepas de CHIKV en el INEVH (BSL 3) 1. Se aislaron en celulas Vero 2. Identificación viral por RT-PCR Real Time CHIKV 3. Titulación por UFP 4. Secuenciación de un fragmento de Genoma Viral y filogenia viral Muestras de Suero de casos sospechosos (< 8días de evolución) Se han obtenido stocks virales con titulos 10 7 ufp /ml: cepa Asiatica (aislamiento viral de suero de un viajero detectado en Argentina) Celulas Vero C 76

11 RT-PCR en tiempo real CHIKV Inicialmente se usó un protocolo diseñado por el Dr. Lanciotti 2007 (sensibilidad: 1UFP o 50 copias genómicas) Diseño de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 Detecta todos los genotipos West Africa, ECSA y Asia No hay reactividad para otros Alphavirus (ONN, Ross River, Mayaro, EEE, WEE, VEE, Semiliki Forest, Sinbis).

12 RT-PCR en tiempo real CHIKV Recientemente se han diseñado 2 sets de primers y sonda más específicos para el genotipo asiático circulante (Fort Collins- CDC) (sin publicar aún) Se analizaron en el INEVH diluciones seriadas de una de las cepas aisladas en el INEVH procedente de República Dominicana Los sets 2 y 3 tienen mayor sensibilidad que el set 1, por lo cual se recomienda para el análisis de las cepas que circulan actualmente en América nsp1 nsp2 nsp3 nsp4 C E2 E1 AAAAAAAAAAA Sets de primer y sondas Set 1 (ECSA) 6856F 6981c 6919-FAM Set 2 (Asiático-América) 3855F 3957c1, FAM1,2 Set 3 (Asiático-América) 856F 962c 908-FAM No estructural estructural

13 RT-PCR convencional genérica para Alphavirus Oligonucleótidos degenerados en la región nsp4 (195pb) Detección de EEE, WEE, VEE, CHIK, Ross River, Sinbis, Semiliki Forest Para identificar el Alphavirus se requiere la secuenciación genómica nsp1 nsp2 nsp3 nsp4 C E3 E2 E1 AAAAAAA No estructural estructural

14 Caracterización Filogenética de cepas circulantes CHIKV detectado en Argentina- INEVH 2014 Identificación del Genotipo Asiático en viajeros procedentes del Caribe Análisis bayesiano, 1200 nt en la región E ; 155 pb región nsp4. Árboles de topología similar Congreso Argentino de Virología CAV,2015

15 TÉCNICAS SEROLÓGICAS

16 ELISA de Captura de Ac IgM Desde el 2011 el INEVH cuenta con la técnica de Elisa IgM de captura puesta a punto y evaluada externamente a través de proficiencia del CDC Permite detectar infección actual o reciente Presenta cruce serológico con otros alfavirus del mismo grupo ej: virus Mayaro, Ross River, Onyong nyong) Metodología in house que utiliza reactivo producido en INEVH ELISA de captura IgM CHIK (P/N) CHIK RR ONN VEE MAY EEE Fuente: CDC

17 IgM Capture ELISA 1. Anti IgM humano (4 C toda la noche) 2. Agregar suero de paciente en la dilución adecuada (37 C, 1 Hora) 3. Agregar Antígeno (chik y normal para la misma muestra) ( 4 C toda la noche) 4. Agregar el Ac monoclonal conjugado con peroxidasa rábano (37, 1 Hora) 5. Adición del Sustrato TMB. Dejar 30 min a 37 C y solución de Stop. Leer a 450 nm Fuente: CDC

18 Inoculación viral Producción de antígenos: Slurry para ELISA IgM Incubación x días, 34ºC Congelamiento -70ºC Linea Celular VeroC76 C6 / /BHK % Infección Monitoreo por ECP y/o IFI Descongelamiento Sonicado y centrifgado ANTIGENO p/ ELISA IgM Inactivación por irradiación gamma

19 Puesta a punto de la PRNT para confirmación serológica de CHIKV Técnica serológica de referencia para confirmar el diagnóstico Aumento en 4 veces el título entre muestra aguda/convalesciente. Estudiar especificidad con panel de Alphavirus Se tituló stock viral de MAY para incorporar al panel

20 INCORPORACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DE CHIKV EN LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA DIAGNOSTICO DE DENGUE Y OTROS ARBOVIRUS INEVH Confirmación, Control de calidad, trasferencia de tecnología y capacitación Incorporación del Evento CHIK en SIVILA Puesta a Punto de Real Time en laboratorios de la Red Puesta a punto de PRNT, producción de antígenos para ELISA, producción de controles positivos para PCR Puesta a Punto de RT- PCR Genérica de Alfavirus en laboratorios sin equipos Real Time

21 MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN! Bioq. Victoria Luppo Dra Alejandra Morales Lic Cintia Fabbri

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