Brote de Enterovirus D68- EEUU 2014 Perspectiva laboratorio

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1 Brote de Enterovirus D68- EEUU 2014 Perspectiva laboratorio Allan Nix Jefe de equipo Laboratorio de Picornavirus Rama de laboratorio de Polio y Picornavirus Webinar OPS / SARInet 6 de noviembre de 2014 National Center for Immunization & Respiratory Diseases Division of Viral Diseases

2 Taxonomía del género Enterovirus* Taxonomía antigua: por enfermedad en humanos y sistemas de modelo animal Poliovirus PV1-3 Virus Coxsackie A CAV1-22, 24 Virus Coxsackie B CBV1-6 Echovirus E1-7, 9, 11-21, 24-27, Enterovirus EV Rinovirus (género) *No incluye EV-E, -F, -G, -H J animal, ni los no clasificados Taxonomía actual: por propiedades moleculares y biológicas Enterovirus A (EV-A) 25 tipos Enterovirus B (EV-B) 61 tipos Enterovirus C (EV-C) 23 tipos Enterovirus D (EV-D) 5 tipos Rinovirus A (RV-A) 80 tipos Rinovirus B (RV-B) 32 tipos Rinovirus C (RV-C) 54 tipos

3 Rinovirus (RV) y Enterovirus (EV) Las dos pruebas especificas en tiempo real para EV y RV se enfocan en las mismas secuencias conservadas de nucleótidos en la región 5 NTR IRES Se hace referencia a estas pruebas en la literatura como pan-ev o pan-rv Las pruebas pan-ev y pan-rv son, de hecho, NO ESPECÍFICAS Hace poco, ICTV eliminó el género Rinovirus y reclasificó todos los RV como miembros del género Enterovirus Las pruebas en tiempo real de pan-ev de los CDC en EEUU detectan el 66% de especies RV-A y -B, y detectan una cantidad desconocida de especies RV-C Por otra parte, las pruebas pan-rv publicadas detectan un porcentaje desconocido de las especies EV-A, -B, -C y -D El reporte a los clínicos ha sido problemático, porque no son conscientes de la taxonomía del virus, o no conocen bien las pruebas Una prueba pan-ev o pan-rv 5 NTR positiva debe ser reportada como RV/EV/; RV o EV Se requiere tipificación para asignar la especie de EV o RV y (sero)tipo

4 Especies A-D de EV excluye el RV Método Neighbor-Joining; MEGA 5.0 EV especie C EV especie A EV especie B Aminoácido; secuencias de codificación completas

5 Enterovirus especie D EV-D68 Aislado por vez primera en 1962 en niños con enfermedad respiratoria HRV87 aislado en 1963 en el mismo laboratorio (cepa Corn) HRV87 re-clasificado alrededor de 2002 como un EV-D68 Asociado con enfermedad respiratoria grave (desde 1962) EV-D70 Asociado con conjuntivitis hemorrágica aguda (CHA) CHA reportada por vez primera en Ghana en 1969; aislado por vez primera en Japón, en1971 EV-D94 Aislado en heces de pacientes con PFA de células RD (heces de 2001, República Democrática de Congo) Aislado en muestras de alcantarillado en células RD (Egipto) EV-D111 Detectado por vez primera e identificado en chimpancés en Camerún Aislado posteriormente en heces de pacientes con PFA en células RD (Camerún, República Democrática de Congo, República Centroafricana) EV-D120 Detectado por vez primera e identificado en 4 gorilas y 1 chimpancé en Camerún

6 Cultivo celular de EV-D68 EV-D68 crece en mayores títulos a 33 C Las células primarias de riñones de monos apoyan el crecimiento CMK Cynomolgus renal primario RMK Rhesus renal primario Líneas celulares derivadas de tejido pulmonar humano apoyan el crecimiento A549 epitelio de pulmón humano embrionario HLF fibroblastos de pulmón humano embrionario WI-38 fibroblastos de pulmón humano embrionario MRC-5 fibroblastos de pulmón humano embrionario Otras líneas celulares RD rabdomiosarcoma humano HFKD riñón fetal humano diploide

7 Efecto citopático en células de rabdomiosarcoma Fotografía: Yiting Zhang

8 EV-D68 sección EM delgada; células RD Fotografía: Cynthia S. Goldsmith y Yiting Zhang

9 Enterovirus D68 por estado de residencia*, 19 agosto 30 octubre de 2014 *Si conocido

10 Vpg Genoma Enterovirus / Objetivo de tipificación 5'NTR VP4 VP2 P1 P2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3 B 3C pro 3D pol 3'NTR P3 A n VP3/ VP1 Partial VP1 Identidad antigénica (serotipo) Secuencias de aminoácidos conservadas flanquean los sitios de interés variable Por diseño amplifica todo EV-A, -B, -C y D (algunos tipos recientes solo en análisis in-silico ) También amplifica muchos RV-A, -B, y algunos C Identificación viral Objetivo de serotipo-específico para la secuenciación de diagnóstico- tipificación molecular ( serotipificación ) Primer borrador de epidemiología molecular, es decir, filogenias Nix, W.A., M. S. Oberste, and M. A. Pallansch. Sensitive, semi-nested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 44(8):

11 360 pares de bases de genes VP1 Neighbor-joining tree MEGA 6.0 EV-D68 Análisis de secuencia parcial VP EE.UU. Cepa predominante del brote 544 Pacientes (92,4%) Esta cepa de EV-D68 esta estrechamente relacionada a la cepa de EV-D68 detectada en EE.UU. en 2011, 2012, y 2013 También esta estrechamente relacionada a China (2012), Italia (2012) y Tailandia (2011) 2014 EE.UU. Cepa menor del brote 44 Pacientes (7,4%) Esta cepa de EV-D68 esta estrechamente relacionada a la cepa de EV-D68 detectada en España (2012) e Italia (2012) 1 Paciente (0,2%)

12 VP4 / VP2 Árbol de máxima verosimilitud Cepas del brote EE.UU. >99% de casos confirmados Garcia, J., et. al. Human rhinoviruses and enteroviruses in influenza-like illness in Latin America. Virology Journal 2013, 10:305.

13 2014 EV-D68- Ensayo específico en tiempo real RT-PCR # Identificación Orientación Gen Posición (5-3 Cadena codificante) Motivo Aminoácidos (NH-COOH) AN887 Sentido VP QTRTVINQH AN893 Antisentido VP VAVNGSSNNT AN890 (Probe) Antisentido VP DKNFFKWT EV VP1 Ensayo de tipificación estándar + - EV-D68- Ensayos específicos + - (Verdadero Positivo) 69 (Falso Negativo) 0 (Falso Positivo) 3 (Verdadero Negativo) 65 Valor Predictivo Positivo 96% Valor Predictivo Negativo 100% Sensibilidad 100% Especificidad 96%

14 Vista de la amplificación: Muestras Clínicas Respiratorias

15 Gracias por la invitación para hablar con ustedes hoy Contactos: Allan Nix Steve Oberste Para mayor información, contactar a los Centros Para el Control y la Prevención de Enfermedades 1600 Clifton Road NE, Atlanta, GA Teléfono: CDC-INFO ( )/TTY: Web: Los resultados y conclusiones de este informe son de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.

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