Genética de las ENACH

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José Ignacio Henríquez Padilla
hace 8 años
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1 Genética de las ENACH FORMA CLÍNICA GEN FORMA CLÍNICA GEN Neurodegeneración asociada a Neurodegeneración asociada a PANK2 pantotenato quinasa (PKAN) proteína beta -propeller (BPAN) WDR45 Neurodegeneración asociada a fosfolipasa A2 (MPAN) PLA2G6 Neuroferritinopatía FTL Neurodegeneración asociada a proteína de membrana C19orf12 Aceruloplasminemia CP mitocondrial (MPAN) Neurodegeneración asociada a hidroxilasa de ácidos grasos (FAHN) FA2H Síndrome de Woodhouse-Sakati DCAF17 Enfermedad de Kufor-Rakeb ATP13A2 COASY Genes más frecuentes: PANK2 : 50% PLA2G6: 20% C19orf12: 6-10% WDR45: 1-2% Genes más raros: FA2H, COASY, ATP13A2, DCAF17, FTL y CP Sin diagnóstico: 40% casos

2 Herencia Autosómica Recesiva Habitualmente el primer caso en una familia es un hijo de padres sanos portadores. Afecta por igual a hombres y a mujeres. Los enfermos presentan dos mutaciones en un mismo gen; no es preciso que sea la misma (heterozigotos compuestos).

3 Análisis genético: Protocolo de Trabajo Secuenciación de los genes más frecuentes PANK2, PLA2G6, C19orf12 y WDR45 Mutaciones en exones y regiones de alrededor (splicing) Sanger Descartar grandes deleciones y/o duplicaciones PANK2 y PLA2G6 MLPA (kit comercial) Análisis de los genes menos frecuentes DCAF17, COASY, ATP13A2, FTL, CP y FA2H Panel de Genes Trastornos del movimiento

4 PERSONA CÉLULA CROMOSOMA GEN

La determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en la

5 Análisis de los genes más frecuentes Secuenciación de DNA: Sanger Frederik Sanger Detectar pequeños cambios Estudiar gen a gen Qué es? La determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en la cadena de DNA. La secuencia de DNA constituye la información genética heredable.

6 Gen PANK2 c.570c>g c.656g>t c.747dup c.790c>t c.1211a>t c.1038a>t c.1171dupattg c.1064a>g c.1070g>c c.1475c>g c.1502t>c c.1583c>t EXÓN 1 EXÓN 2 EXÓN 3 EXÓN 4 EXÓN 5 EXÓN 6 EXÓN 7 Más del 80% de mutaciones están en los exones GEN

7 padre sano portador madre sana portador hijo enfermo hija sana

8 Análisis de los genes más frecuentes *Mutación novel Genes: PANK2, PLA2G6, C19orf12, WDR45 40 pacientes (35 familias): o Diagnóstico genético en 26 pacientes o 14 pacientes pendientes de diagnóstico PANK2 PLA2G6 Paciente Mutación Paciente Mutación NBIA-1 c.1211 A>T (Hom) NBIA-6 c.2017c>t (Hom)* NBIA-2,3,4,5,7,8 c.1583c>t (Hom) NBIA-11 c,1010t>a*/c.1027g>a NBIA-09,10 c.1171dupattg* NBIA-14,15 c.1640a<g(hom) NBIA-13 c.1070g>c*/c.790c>t NBIA C>T/2370T>G NBIA-16,33 c.747dup*/c.1475c>g* NBIA-26 c.209 G>A/c T>A * NBIA-19 c.1502t>c (Hom) NBIA-32 c.1547dupgc (Hom) NBIA-34,35 c.1064a>g/c.1502t>c NBIA-44,45 c.680 C>T (Hom)* NBIA-42,43 c delca/c.980 C>T

9 Análisis de los genes más frecuentes Genes: PANK2, PLA2G6, C19orf12, WDR45 40 pacientes (35 familias) Diagnóstico genético en 26 pacientes 14 pacientes pendientes de diagnóstico Genes más frecuentes Según bibliografía: PANK2 : 50% PLA2G6: 20% C19orf12: 6-10% WDR45: 1-2% ,5% 9 22,5% 14 35% 0 PANK2 PLA2G6 SIN DIAGNÓSTICO

10 Análisis genético: Protocolo de Trabajo Diagnóstico genético 26 de 40 pacientes Secuenciación de los genes más frecuentes PANK2, PLA2G6, C19orf12 y WDR45 Mutaciones en exones y regiones de alrededor (splicing) Sanger Descartar grandes deleciones y/o duplicaciones PANK2 y PLA2G6 MLPA (kit comercial) Análisis de los genes menos frecuentes DCAF17, COASY, ATP13A2, FTL, CP y FA2H Panel de Genes Trastornos del movimiento

11 Análisis genético: Protocolo de Trabajo Diagnóstico genético 26 de 40 pacientes Secuenciación de los genes más frecuentes PANK2, PLA2G6, C19orf12 y WDR45 Mutaciones en exones y regiones de alrededor (splicing) Sanger Descartar grandes deleciones y/o duplicaciones PANK2 y PLA2G6 MLPA (kit comercial) Análisis de los genes menos frecuentes DCAF17, COASY, ATP13A2, FTL, CP y FA2H Panel de Genes Trastornos del movimiento

12 Más del 80% de mutaciones están en los exones Qué pasa si una mutación está en otra parte del gen? Por ejemplo en un intrón

DELECIÓN DUPLICACIÓN Secuenciación de los genes más frecuentes PANK2, PLA2G6, C19orf12 y WDR45 Mutaciones en exones y regiones de alrededor (splicing) Sanger Descartar

13 DELECIÓN DUPLICACIÓN Secuenciación de los genes más frecuentes PANK2, PLA2G6, C19orf12 y WDR45 Mutaciones en exones y regiones de alrededor (splicing) Sanger Descartar grandes deleciones y/o duplicaciones PANK2 y PLA2G6 MLPA Análisis de los genes menos frecuentes DCAF17, COASY, ATP13A2, FTL, CP y FA2H Panel de Genes Trastornos del movimiento

14 Análisis de deleciones/duplicaciones grandes en PANK2 y PLA2G6 14 pacientes sin diagnóstico MLPA hecho en 11 Sin resultados positivos Paciente Genes investigados NBIA12 PANK2,C19orf12,WDR45 NBIA18 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA20 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA21 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA23 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA24 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA27 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA28 PANK2,PLA2G6,C19ORF12 NBIA30 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA31 COASY, WDR45 NBIA36 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA40 PANK2,PLA2G6,C19ORF12,WDR45 NBIA41 PANK2,PLA2G6 c.1615c>a (HET),C19ORF12,WDR45 NBIA37 PANK2c.332T>A/c insT*, PLA2G6, C19ORF12,WDR45 MLPA SI SI SI NO SI SI SI SI SI SI SI SI NO NO

15 Análisis genético: Protocolo de Trabajo Diagnóstico genético 26 de 40 pacientes 14 pacientes sin diagnóstico No resultados positivos Secuenciación de los genes más frecuentes PANK2, PLA2G6, C19orf12 y WDR45 Mutaciones en exones y regiones de alrededor (splicing) Sanger Descartar grandes deleciones y/o duplicaciones PANK2 y PLA2G6 MLPA (kit comercial) Análisis de los genes menos frecuentes DCAF17, COASY, ATP13A2, FTL, CP y FA2H Panel de Genes Trastornos del movimiento

16 Análisis genético: Panel de Genes El panel de genes permite el análisis de un gran número de genes al mismo tiempo. Técnica mucho más rápida y también más compleja de interpretar. Se incluirán los genes implicados en las ENACH y también otros relacionados con trastornos del movimiento: ENACH DISTONÍA PARKINSON ENFERMEDAD DE WILSON GENES IMPLICADOS EN LA SÍNTESIS DE COENZIMA A. De esta forma se estudiarán aquellos casos cuya clínica sea más complicada

17 Análisis genético: Tipo de muestra Extracción DNA Tubos EDTA Extracción RNA Tubos PAXgene

18 Para estudiar mutaciones que no están en los exones analizamos RNA Los intrones de los genes humanos son enormes. Es posible trabajar con fragmentos más pequeños (cdna obtenido a partir de mrna) De esta forma detectamos si hay cambios de tamaño debido a mutaciones que están en los intrones Tubos PAXgene

19 Objetivo: En pacientes en quienes no se logra el diagnóstico genético con el protocolo habitual, se investiga si hay mutaciones en regiones intrónicas Pacientes sin dx genético Extracción RNA RT-PCR abarcando todo el cdna

si el cambio está en población sana Análisis informáticos

20 El cambio detectado es patológico? Estudiar al resto de familiares Individuo sano enfermo Comprobar si el cambio está en población sana Análisis informáticos Averiguar si la base mutada es importante Predecir si el cambio puede alterar la función de la proteína

21 Función de los genes ENACH

22 Ensayo de actividad ATPase activity (Units/mol) 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 * * * p_valor < 0,05 0,15 0,1 0,05 0 WT R190W S25L D6A EMPTY

23 Estudio de localización Proteína normal MPZ-HA Superficie de la célula Proteína mutada p.s121f Interior de la célula

24 Mosca Transgénica Control RNAi 3-5 d 5 weeks 3-5 d ORGANIZACIÓN NORMAL DESORGANIZACIÓN MUTADO

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