BIOTECNOLOGIA DE PROTEINAS LA VIABILIDAD COMERCIAL ES ESENCIAL PARA EL EXITO DE CUALQUIER EMPRESA BIOTECNOLOGICA.

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1 BIOTECNOLOGIA DE PROTEINAS Es la producción y el aislamiento comerciales de proteínas específicas, de fuentes animales, vegetales o microbianas, y/o su utilización ulterior para producir un evento biológico pre-definido. LA VIABILIDAD COMERCIAL ES ESENCIAL PARA EL EXITO DE CUALQUIER EMPRESA BIOTECNOLOGICA. Biotecnología clásica: Procesos fermentativos (cerveza, vino, quesos) (al menos 4000 años). Biotecnología moderna: Tecnologías de DNA recombinante y anticuerpos monoclonales (desde mediados de la década del 1970). Muchas proteínas tienen aplicación industrial: enzimas, anticuerpos, hormonas, factores de coagulación sanguinea, factores de crecimiento. Se emplean como agentes diagnósticos y terapéuticos, y en la fabricación de una gran variedad de productos biológicos. Se las puede obtener de sus fuentes naturales, pero actualmente es muy frecuente su obtención a partir de otros organismos, por técnicas de DNA recombinante. 1

2 PROTEINAS DE USO FARMACEUTICO: Factores de coagulación (hemofilias); eritropoietinas (anemias); Factor de crecimiento de fibroblastos (ciertas úlceras); Insulina (diabetes); Interferones, interleukinas (cancer, SIDA); anticuerpos monoclonales (diagnóstico); vacunas (hepatitis B). Se producen en cantidades moderadas (gramos o kilos) y requieren la máxima pureza. La mayoría se produce por técnicas de DNA recombinante. 2

3 La producción de proteínas recombinantes para uso clínico es un emprendimiento de alto riesgo y alta recompensa. La American Pharmaceutical Manufacturers Association ha estimado el costo del desarrollo de una nueva droga de aplicación farmacéutica en millones de US$, y el tiempo requerido puede ser de unos 12 años, desde su concepciòn en el laboratorio hasta su llegada a los anaqueles de una farmacia. La primera proteína recombinante empleada en clínica fué la insulina humana, producida en Escherichia coli y aprobada por USA, UK, Alemania Occidental y Holanda en La primera vacuna recombinante administrada a seres humanos fué la vacuna contra hepatitis B, producida en levadura (Saccharomyces cerevisiae). Se producen actualmente proteínas recombinantes para uso clínico en hongos filamentosos, plantas y animales transgénicos. 3

4 Muchas proteínas con APLICACION INDUSTRIAL, en general enzimas de origen microbiano, se producen en grandes cantidades, a menudo cientos de toneladas y con mucha menor pureza. Es una industria que moviliza cientos de millones de US$ por año. EJEMPLOS DE ENZIMAS CON APLICACIÓN INDUSTRIAL: PROTEINASAS (preparados detergentes, fabricación de quesos, industrias de la cerveza y el pan, de la carne y del cuero; digestivos de uso humano y veterinario). AMILASAS (procesado de almidones, industrias fermentativas). PECTINASAS (industrias de jugos frutales y procesado de frutas). LIPASAS (industria lechera, industria de aceites vegetales). LACTASA (hidrólisis de lactosa en leche). GLUCOSA ISOMERASA (producción de jarabes con alta concentración de fructosa). PENICILIN ACILASA (producción de penicilinas semisintéticas). La mayoría de estas enzimas se obtiene de fuentes naturales, pero algunas son recombinantes (quimosina, para la hidrólisis parcial de la caseína en la fabricación de quesos). 4

5 LAS PROTEINAS: REPASO DE ESTRUCTURA 5

6 ESTRUCTURA Y FUNCION DE LAS PROTEINAS. Las proteínas son polímeros de aminoácidos unidos por uniones amida, llamadas uniones peptídicas. La cadena polipéptídica constituye la estructura primaria de la proteína, dada por la secuencia de los residuos de aminoácidos. Para ser funcional, la proteína requiere niveles superiores de estructura, que la llevan a su forma tridimensional, esencial para su función. Esos niveles estructurales son las estructuras secundaria, terciaria y, eventualmente, cuaternaria (si se trata de un oligómero con subunidades iguales o diferentes). 6

7 LOS AMINOACIDOS 7

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16 NIVELES ESTRUCTURALES EN LAS PROTEÍNAS. 1) Estructura primaria: Secuencia de aminoácidos. Unión peptídica exclusivamente. 2) Estructura secundaria: Disposición espacial de residuos de aminoácidos cercanos en la secuencia. Unión hidrógeno involucrando el N y el O de las uniones peptídicas exclusivamente. Tres elementos principales de estructura secundaria: α-hélice, estructura β (hoja plegada) y giros β. 16

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21 3) Estructuras supersecundarias: motivos y dominios. 4) Estructura terciaria: Disposición espacial de residuos de aminoácidos lejanos en la secuencia. Interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno entre restos laterales o entre ellos y la cadena peptídica, uniones salinas, puentes disulfuro. 5) Estructura cuaternaria: Disposición espacial de las subunidades en proteínas oligoméricas. Interacciones hidrofóbicas, uniones puente hidrógeno y salinas. 21

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26 PURIFICACION DE PROTEINAS 26

27 GENERALIDADES SOBRE PURIFICACION DE PROTEÍNAS. El método de purificación debe diseñarse desde un principio teniendo en cuenta la cantidad de proteína que se requiere. Hay etapas de purificación que se pueden aumentar de escala fácilmente y otras en que no es posible hacerlo. El grado de pureza necesario dependerá del uso que se va a dar a la proteína. Para usos en investigación, la escala es reducida y es mas importante la pureza que el rendimiento. Para usos terapéuticos la escala es mayor y la pureza requerida es máxima. Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajo costo y pureza menor. Si el interés está en la proteína y no importa el organismo de origen, conviene buscar una fuente fácil de obtener, barata, que contenga esa proteína en abundancia. Si existe la posibilidad de partir de organismos enteros o de células en cultivo, esto último es en general preferible. Lo óptimo es producir la proteína por métodos de DNA recombinante. Dependiendo de la finalidad, la proteína debe ser obtenida en estado nativo o puede estar desnaturalizada. Para actividad biológica, debe estar nativa; para determinar estructura primaria, puede estar desnaturalizada. 27

28 Se debe seleccionar un método de determinación específico de la proteína en cuestión (p.ej.: actividad, si se trata de una enzima; unión de ligando a un receptor; unión de un anticuerpo específico en un RIA) y un método de determinación de la proteína total. Debe tenerse en cuenta que, salvo la determinación de proteína por análisis de aminoácidos o por peso seco, todos los demás métodos son semicuantitativos, a menos que se los estandardice con la propia proteína en estudio. Entre estos métodos se pueden mencionar 1) espectrofotometría en el UV (280 nm, Trp; nm, unión peptídica); Biuret (Cu 2+ alcalino); Lowry (Cu 2+ alcalino + reactivo de Folin-Ciocalteau); Bradford (Coomassie Blue); unión de Ag. La actividad específica (AE) es igual a la relación entre la cantidad de proteína que se purifica sobre la cantidad de proteína total. El grado de purificación es el cociente de la AE en la etapa 2 sobre la AE en la etapa 1 (la purificación global, AE final sobre AE inicial) Se debe utilizar un método adecuado para juzgar la pureza de la proteína obtenida; actualmente se utiliza SDS-PAGE, monodimensional o, preferentemente, bidimensional. En otras épocas, se utilizó la ultracentrifugación analítica. Se debe evitar la proteólisis de la proteína en estudio durante su purificación, utilizando cócteles de inhibidores de proteasas, y trabajando tan rápido como sea posible y en frío, para minimizar su acción. 28

29 Purificacion step Total Protein Total activity Specific Activity Yield Purification factor mg units a units a /mg % Fold Cell-free extract ConA-Sepharo se Mono Q Mono P

30 ESQUEMA GENERAL DE UN METODO DE PURIFICACION 1) Separación de las células. 2) Si la proteína es intracelular, ruptura celular y separación de restos. 3) Concentración. 4) Aislamiento primario. 5) Purificación de alta resolución. 6) Pulido del producto final. Problemas a ser resueltos para diseñar el proceso: 1) Elegir etapas basadas en diferentes principios fisicoquímicos. 2) Elegir entre operaciones alternativas, en base a la escala final buscada. 3) Diseñar una secuencia de etapas óptima, con el menor número de etapas posible, lo que aumentará el rendimiento final. 4) Minimizar la desnaturalización y efectos de superficie; evitar agregación: minimizar la degradación; cuidar la limpieza y desinfección del equipo usado. 30

31 METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS. 1) Separación de células del medio (en cultivos microbianos o de células eucarióticas vegetales y animales) 2) Si la proteína es intracelular, ruptura del material y obtención de un extracto libre de células. 3) Concentración. Precipitación (sales, ph, alta temperatura, solventes orgánicos). Ultrafiltración. 4) Separación de sales y moléculas pequeñas. Diálisis 5) Fraccionamiento cromatográfico. 31

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34 METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS. 1) Separación de células del medio (en cultivos microbianos o de células eucarióticas vegetales y animales) 2) Si la proteína es intracelular, ruptura del material y obtención de un extracto libre de células. 3) Concentración. Precipitación (sales, ph, alta temperatura, solventes orgánicos). Ultrafiltración. 4) Separación de sales y moléculas pequeñas. Diálisis 5) Fraccionamiento cromatográfico. 34

35 METODOS PARA LA RUPTURA DEL MATERIAL A menos que se trate de una proteína extracelular, liberada al medio, las células o tejidos deben romperse para extraer la proteína de interés. Esta ruptura debe ser sólo la necesaria, no excesiva, para evitar la extracción inútil de proteínas contaminantes. Los distintos tipos de células tienen diferente susceptibilidad a la ruptura. Las células animales son muy fáciles de romper, pues carecen de pared. Las vegetales tambien, pues, pese a tener pared celular, su gran tamaño las hace vulnerables a la ruptura mecánica. Las células bacterianas son más resistentes, y esta propiedad depende de que sean Gram positivas o Gram negativas. El predominio del peptidoglicano en la pared de las primeras, las hace mucho mas sensibles a métodos suaves, como la digestión con lisozima. Los hongos filamentosos y las levaduras son los más resistentes a la ruptura. Tienen paredes celulares que contienen hasta % de polisacárido (quitina y glicanos en hongos, manano y glucano en levaduras), además de lípidos y proteínas. 35

36 ALGUNOS METODOS DE RUPTURA DE CELULAS 1) Mortereado con arena, alúmina, bolitas de vidrio, carburo de silicio. 2) Molinos de ruptura, por agitación con abrasivos. 3) Uso de licuadoras u otros dispositivos con cuchillas rotativas. 4) Sonicación. 5) Congelación y descongelación. 6) Extrusión de líquido o sólido (material congelado) 7) Descompresión explosiva. 8) Enzimas líticas, seguido por shock osmótico o tratamiento mecánico. 9) Detergentes (Triton, digitonina) o solventes (tolueno). 10) Aislamiento previo de la organela en que se encuentra la proteína. 36

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38 METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS. 1) Separación de células del medio (en cultivos microbianos o de células eucarióticas vegetales y animales) 2) Si la proteína es intracelular, ruptura del material y obtención de un extracto libre de células. 3) Concentración. Precipitación (sales, ph, alta temperatura, solventes orgánicos). Ultrafiltración. 4) Separación de sales y moléculas pequeñas. Diálisis 5) Fraccionamiento cromatográfico. 38

39 METODOS DE SEPARACION Y CONCENTRACION Remoción de agua y moléculas pequeñas por 1) Agregado de un polímero seco on poros muy pequeños como para que la proteína penetre (Sephadex G-25). 2) Remoción a través de una membrana semipermeable (ultrafiltración). Celdas filtrantes. Diálisis contra polietilenglicol. Diálisis en vacío. 3) Remoción de agua en vacío: liofilización. Buffers volátiles, como el bicarbonato de amonio. Purificación por ultrafiltración. 39

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44 PURIFICACIÓN Y CONCENTRACION POR PRECIPITACION 1) Precipitacion por aumento de la fuerza iónica (salting-out): Series de Hoffmeister. Sulfato de amonio. 2) Precipitación por disminución de la fuerza iónica (salting-in) 3) Precipitación por alteración del ph (mínima solubilidad en el pi). 4) Precipitación por solventes orgánicos (etanol, acetona), que disminuyen la constante dieléctrica de la solución y por ello su poder de solvatación. 5) Desnaturalización de impurezas por altas temperaturas, extremos de ph, solventes orgánicos. 44

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46 METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS. 1) Separación de células del medio (en cultivos microbianos o de células eucarióticas vegetales y animales) 2) Si la proteína es intracelular, ruptura del material y obtención de un extracto libre de células. 3) Concentración. Precipitación (sales, ph, alta temperatura, solventes orgánicos). Ultrafiltración. 4) Separación de sales y moléculas pequeñas. Diálisis 5) Fraccionamiento cromatográfico. 46

47 Eliminacion de moleculas chicas por dialisis. Se requiere, en general, despues de una precipitacion con sulfato de amonio. Cambios de buffer: 1) Diálisis. 2) Filtración por gel; 3) Diafiltración. 47

48 METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS. 1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células. 2)Precipitación (sales, ph, alta temperatura, solventes orgánicos). 3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración. 4)Fraccionamiento cromatográfico. Principio de separación Forma y tamaño Carga neta Punto isoeléctrico Hidrofobicidad Función biológica Antigenicidad Contenido en carbohidrato Grupos sulfhidrilos libres Capacidad de ligar metales Tipo de cromatografía Filtración por gel Cromatografía de intercambio iónico. Cromatoenfocado Cromatografía de interacción hidrofóbica Cromatografía en fase reversa Cromatografía de afinidad Inmunoadsorción Cromatografía con lectinas inmobilizadas Cromatografía covalente Cromatografía de quelatos metálicos 48

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50 CROMATOGRAFIA Separación diferencial de los componentes de una muestra entre una fase móvil y una fase estacionaria. La fase móvil es el solvente en que se introduce la muestra y con el que se eluyen las proteínas (puede ser el mismo o variar durante la corrida). La fase estacionaria comprende las partículas, en general esféricas, con que se llena la columna. Estas partículas están formadas por una matriz y, en la mayoría de los casos, moléculas de menor o mayor tamaño con las que se la derivatiza, para adaptarla a los diferentes procedimientos cromatográficos. La matriz es el sustrato sólido de la fase estacionaria. Las más comunes son celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica. Deben tener buena estabilidad mecánica y química, alta capacidad, tamaño y forma adecuada de poros, superficie inerte para minimizar las interacciones no específicas, y tamaño de partícula adecuado al flujo de solvente deseado y a la presión operativa. 50

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54 TIPOS DE CROMATOGRAFIA Según la presión a que se opera la corrida, se pueden considerar tres tipos: 1. Corridas a presión normal (LPLC, low-pressure liquid chromatography). Presión inferior a 5 bar. Pueden usarse matrices de escasa rigidez, como la agarosa o el dextrano. 2. Corridas a presión intermedia (MPLC, medium-pressure liquid chromatography, tambien llamada FPLC (Fast protein liquid chromatography). Presión entre 6 y 50 bar. Requiere matrices mas rígidas. Permite flujos mayores. 3. Corridas a alta presión (HPLC, high-pressure - o high-performance - liquid chromatography). Presiones mayores de 50 bar. Requiere matrices de rigidez alta, partículas pequeñas y columnas y tuberías de material altamente resistente a la presión, como el acero inoxidable o el titanio. 1 Atm corresponde a milibars 54

55 CARACTERISTICAS TIPICAS DE LPLC Y HPLC. Característica LPLC HPLC Tamaño de partícula (μ) Flujo (ml.cm -2.h -1 ) Presión de trabajo (bar) < 5 > 50 Tiempo de separación (hs.) Hasta Volumen de muestra ml - litro μl - ml Etapa de purificación Variable En general tardía Resolución Buena Excelente Dificultades Largo tiempo, Alto costo de equipo, cámara fría Posible desnaturalización por presión. 55

56 OTRAS CONSIDERACIONES GENERALES. El tamaño de la columna a utilizar dependerá del procedimiento cromatográfico a seguir y de la cantidad de muestra a purificar. La aplicación de la muestra a la columna se hace generalmente a través de un loop, imprescindible para FPLC o HPLC. En LPLC puede hacerse aplicación manual. La elución de las proteínas introducidas en la columna puede hacerse sin cambiar la composición de la fase móvil (elución isocrática) o cambiandola, por etapas o continuamente (gradientes). Normalmente, luego de la corrida la columna debe ser regenerada, dejandola en condiciones de ser reutilizada. En general si las columnas no se utilizan continuamente deben ser guardadas conteniendo un agente conservador, como el etanol al 20 % o la azida sódica, para evitar el crecimiento de microorganismos. 56

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60 METODOS CROMATOGRAFICOS BASADOS EN LA CARGA DE LA PROTEINA. Todas las proteínas contienen residuos cargados, positiva o negativamente, y su balance a un determinado valor de ph da la carga neta de la molécula a ese ph. El valor de ph en el que las cargas se balancean, y en consecuencia la carga neta de la molécula es 0, es el punto isoeléctrico de la proteína. Los métodos cromatográficos basados en la carga son dos: 1) La cromatografía de intercambio iónico. 2) El cromatoenfocado. 60

61 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO. 61

62 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO. La mayoría de las proteínas tienen su pi entre ph 5 y 9. Por encima de su pi la carga neta de la proteína es negativa, y por debajo es positiva. El material utilizado es una matriz derivatizada con grupos cargados positivamente (que intercambian iones negativos, y se llaman por eso intercambiadores aniónicos, como DEAE-celulosa) o negativamente (intercambiadores catiónicos, como CM-celulosa). La adsorción puede hacerse en batch o en columna. Las proteínas migrarán (en condiciones isocráticas) en base a su carga neta a ese determinado ph. Si se trabaja a un valor de ph tal que muchas proteínas se adsorben, la elución se hará cambiando el ph o aumentando la fuerza iónica del buffer. Los intercambiadores pueden ser débiles (utilizables cuando la proteína tiene carga elevada a ese ph) o fuertes (cuando la carga es baja). No conviene usar intercambiadores fuertes para proteínas muy cargadas a ese ph, pues la interacción será muy fuerte y la elución más dificil. La regeneración de la columna se hace con alta fuerza iónica (ClNa 1 M,p.ej.). 62

63 GRUPOS INTERCAMBIADORES DE IONES USADOS EN PURIFICACION DE PROTEINAS. Fórmula Nombre Abreviatura Aniónico fuerte -CH 2 N + (CH 3 ) 3 Trimetilaminometil TAM - -C 2 H 4 N + (C 2 H 5 ) 3 Trietilaminoetil TEAE - Aniónico débil -C 2 H 4 N + H 3 Aminoetil AE - -C 2 H 4 N + (C 2 H 5 ) 2 Dietilaminoetil DEAE - Catiónico fuerte -SO 3 - Sulfo S - -CH 2 SO 3 - Sulfometil SM - Catiónico débil -CH 2 - COO- Carboximetil CM - 63

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66 PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN COLUMNA DE MONO Q (INTERCAMBIADOR ANIÓNICO) 66

67 CROMATOENFOCADO El cromatoenfocado puede ser considerado como una extensión del isoelectroenfocado (IEF) y la cromatografía de intercambio iónico. En IEF las proteínas se separan por electroforesis en un gradiente de ph; se aplica en electroforesis bidimensional. En cromatografía de intercambio iónico se puede eluir con un gradiente de ph, que se forma fuera de la columna. En cromatoenfocado, el gradiente se forma dentro de la columna, mezclando una matriz de intercambio aniónico pre-ajustada a un valor de ph, con un buffer de ph más bajo. La proteína al descender en la columna encontrará valores crecientes de ph; cuando llegue a su pi se volverá electronegativa, y se unirá a la matriz positivamente cargada. Como el buffer sigue corriendo, la proteína se separará y unirá sucesivamente, hasta eluirse en una banda muy definida ( enfocada ) al ph correspondiente a su pi. 67

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71 PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI POR FPLC EN COLUMNA DE MONO P (CROMATOENFOCADO) 71

72 PURIFICACION BASADA EN LA HIDROFOBICIDAD La llamada originalmente cromatografía de partición utilizaba una fase estacionaria polar y una fase móvil orgánica. La cromatografía en fase reversa se denomina de ese modo porque utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La fase estacionaria está en general formada por cadenas alifáticas de hasta C18 unidas a una matriz de silica. La fase móvil es un solvente polar como metanol, propanol, etanol o acetonitrilo. Estas condiciones pueden causar la desnaturalización de muchas proteínas. Por ello se las utiliza en general en HPLC en fase reversa (RP-HPLC), para purificar proteínas y péptidos para su secuenciación. Se usan contraiones como el ácido trifluoroacético para asociarse con grupos cargados en la proteína y aumentar su hidrofobicidad. Para purificar proteínas en estado nativo se utilizan condiciones mas suaves, en la llamada cromatografía de interacción hidrofóbica. Se utiliza en general octil-sepharosa o fenil-sepharosa; la adsorción de las proteínas se hace en general a alta fuerza iónica, y la elución disminuyéndola, y, si es necesario, agregando un solvente como propanol o butanol. 72

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75 CROMATOGRAFIA COVALENTE A ph 8, reaccionan la mayor parte de las proteínas que contienen Cys-SH; a ph 4, sólo las que tienen Cys residuos con un pka muy bajo, como la papaína. La columna se regenera con 2,2 -dipiridildisulfuro. La piridin-2-tiona absorbe a 343 nm 75

76 CROMATOGRAFIA DE QUELATOS METALICOS (IMAC) La matriz tiene unido covalentemente un quelante, como el ácido iminodiacético. Se carga la columna con un ión adecuado, que puede ser Zn 2+, Ni 2+, Cu 2+, Co 2+. La proteína se adsorbe a la columna si tiene residuos agrupados de His, Cys o Trp. Se puede eluir con quelantes, o bajando el ph a 4-6, o compitiendo con imidazol. Esta técnica es muy usada actualmente para purificar proteínas recombinantes, expresandolas como fusiones con un tag de poly-his (en general 6 residuos), que pueden agregarse en el N o en el C-terminal. Se eluyen con imidazol. Si todo funciona bien, se puede tener proteína recombinante pura en un solo paso de purificación. Debe tenerse en cuenta que iones como el Co 2+ pueden catalizar la oxidación de grupos en la proteína, en especial de -SH. Luego de la purificación la columna se regenera con un quelante como EDTA, y para reutilizarla se la debe volver a cargar con metal. 76

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78 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Se basa en que todas las proteínas tienen sitios de unión para algún ligando, ya sea una molécula pequeña (p.ej.: un análogo del sustrato de una enzima, una hormona para un receptor) u otra proteína (p-ej.: la Concanavalina A para unir glicoproteínas de alta manosa, o anticuerpos específicos para ligar sus antígenos). El ligando elegido para la proteína que se desea purificar debe inmovilizarse sobre una matriz adecuada. La especificidad del ligando puede ser absoluta (p.ej.: avidina para carboxilasas con biotina) o relativa (p.ej.: Cibacron Blue para dehidrogenasas NAD o NADPdependientes). La afinidad de la proteína por el ligando debe ser moderada (K L entre 10-4 y 10-8 M) para permitir una buena unión y una disociación ulterior del complejo en condiciones no desnaturalizantes. Para desarrollar el material para cromatografía de afinidad, primero hay que activar la matriz (p.ej.: agarosa con BrCN) y luego fijarle el ligando. El material debería ser lo suficientemente estable como para permitir su reutilización. Se pueden expresar proteínas recombinantes como fusiones que permiten aplicar cromatografía de afinidad (glutation S-transferasa y GSH-Sepharosa; maltosebinding protein (MBP) y maltosa-agarosa). 78

79 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD. Se explota el hecho de que toda proteina es capaz de interaccionar con uno o mas ligandos. Fijandolos a una matriz, se puede purificar selectivamente a la proteina en estudio. 79

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83 GLUTAMATO DEHIDROGENASA-NADP DEPENDIENTE 83

84 CRUZIPAINA 84

85 FILTRACION POR GEL (CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR, O DE TAMIZADO MOLECULAR) El material cromatográfico es un gel en partículas esféricas, de porosidad controlada, sin derivatizaciones. La separación de las proteínas se hace en base a la forma y la masa de la proteína. La elución es isocrática. Las proteínas que no penetran en absoluto en los poros del gel son las que salen primero (en el llamado volumen de exclusión o volumen vacío, V o ). Las demás moléculas en la muestra se separan, saliendo últimas las que penetran por completo en las particulas de gel. Se usa en general fuerza iónica alta, para minimizar las interacciones de las proteínas entre si, y de las proteínas con la matriz (en este último caso, no relacionadas con el tamaño de poro). Los materiales mas comunes son geles de dextrano (Sephadex), de agarosa (Sepharosa), de agarosa y poliacrilamida (Biogel A), de poliacrilamida (Biogel P). Puede usarse en LPLC, y tambien en FPLC (Superosa, Superdex) y HPLC (silica porosa, como Lichrosorb). En la filtración por gel es crítica la relación entre el volumen de muestra y el volumen de la columna (1 a 5 % del volumen total (V t ) del gel), por lo cual es una técnica que no se puede aumentar en escala mas que hasta un cierto punto. Para desalado de proteínas, se admite hasta un % del V t. Aplicaciones: Purificación de proteínas - Desalado - Determinación de pesos moleculares de proteínas nativas - Determinación de constantes de equilibrio de unión ( binding ). 85

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87 Purificacion step Total Protein Total activity Specific Activity Yield Purification factor mg units a units a /mg % Fold Cell-free extract ConA-Sepharose Mono Q Mono P

88 PURIFICACION DE PROTEINAS DE MEMBRANA. Proteínas integrales y Proteínas periféricas 88

89 PROTEINAS INTEGRALES 89

90 Para purificar proteinas de membrana, lo mejor es empezar purificando la membrana. La solubilización de las proteínas dependerá de que se trate de proteínas integrales o periféricas. Proteínas periféricas: Buffer con EDTA mm, o alta fuerza iónica, hasta 1 M ClNa o ClK. En algunos casos se requieren condiciones más drásticas(urea 8 M, clorhidrato de guanidina 6 M). Incluir inhibidores de proteasas. Proteinas integrales: Las que tienen una parte soluble sustancial, pueden ser solubilizadas cortando la parte que las ancla en la membrana con fosfolipasas o proteasas, según de qué ancla se trate. Las de Clase I se extraen por delipidación con solventes orgánicos, agentes caotrópicos o detergentes. Detergentes: Moléculas anfifílicas, relativamente pequeñas. Por encima de la concentración micelar crítica las moléculas coalescen a través de su parte hidrofóbica para formar micelas, en equilibrio con el monómero. 90

91 Cuando se agrega un detergente a una membrana, se particiona dentro de la bicapa hasta que esta se hace inestable y se desintegra. Los lípidos forman en general micelas mixtas con el detergente, en tanto que las proteínas hidrofóbicas se cubren con una monocapa del mismo. Actualmente se usa mucho el Triton X-114, que tiene la propiedad de ser miscible con el agua a 0-4 o C, pero se separa en dos fases a o C. Las proteínas integrales, solubilizadas a baja temperatura, particionan en la fase de detergente al llevarlas a o C. Existe una variedad considerable de detergentes empleados en purificación de proteínas de membrana. Pueden ser detergentes iónicos, como el SDS o el CTAB, o no iónicos, como la digitonina, el octilglucósido, el Lubrol, el Triton, y otros. 91

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95 PURIFICACION DE LAS PROTEINAS SOLUBILIZADAS. Las proteínas periféricas (o los fragmentos hidrofílicos de proteínas integrales) en general se purifican por los mismos métodos que los usados para las solubles. Las proteínas integrales presentan problemas especiales, debido a que requieren la presencia continua de detergentes o solventes orgánicos. La filtración por gel puede aplicarse; prácticamente todos los materiales para esta técnica pueden usarse en presencia de detergentes o desnaturalizantes, y existen algunas resinas (poliéteres hidroxilados, dextranos hidroxipropilados) admiten solventes orgánicos. La cromatografía de intercambio iónico y el cromatoenfocado pueden utilizarse, en presencia de detergentes no iónicos. La cromatografía en fase reversa en algunos casos puede aplicarse, con la muestra solubilizada en ácido fórmico al % en agua. La cromatografía de afinidad es aplicable en general, requiriendose a veces resinas de altas porosidad y brazos espaciadores largos. 95

96 PURIFICACION DE PROTEINAS PARA USO TERAPEUTICO. Lo que se requiere en este caso es la máxima pureza. Por lo demás, los métodos usados son como para cualquier proteína soluble. La fuente pueden ser tejidos o sueros animales, sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos, o hibridomas. El nivel aceptable de contaminantes se relaciona con la frecuencia de administración de la proteína, y está regulado por las autoridades sanitarias. La significación clínica de los contaminantes es variable: 1) Antigenicidad: puede dar origen a reacciones de hipersensibilidad. 2) Transformación por DNA. 3) Enfermedades transmisibles (virus, priones). 4) Pirogenicidad por lipopolisacáridos de pared bacteriana. Para insulina, se considera que el nivel de contaminantes por debajo del cual no se producen anticuerpos es de 10 ppm. Para DNA se pueden considerar aceptables valores de 10 pg por dosis. Para virus y priones, ausencia completa. 96

97 Se requieren, por lo tanto, métodos muy sensibles para la detección de contaminantes. Para contaminantes proteicos, lo mas usados son los métodos inmunológicos. Tambien puede usarse tinción con Ag. El límite de sensibilidad es del orden de 5 ppm por inmunoensayo, ppm por Western blot y de ppm por tinción con plata. Para DNA contaminante, se usan técnicas de hibridización. Para detección de virus, hibridizaciones y PCR con oligonucleótidos adecuados. Para endotoxinas bacterianas, gelificación de lisado de amebocitos de Limulus polyphemus. OTRAS APLICACIONES ESPECIALES: 1) SECUENCIACION: Evitar el bloqueo del N-terminal (usar urea libre de cianato). Usar RP-HPLC o SDS-PAGE y electrotransferencia para la purificación final. 2) CRISTALOGRAFIA: La pureza debe ser alta, pero sobre todo deben evitarse las microheterogeneidades de la propia proteína a cristalizar (en especial la proteína desnaturalizada). Es bueno terminar la purificacion con cromatografía de afinidad. 97

98 PURIFICACION DE PROTEINAS EN GRAN ESCALA. La escala de producción de proteínas y péptidos por la industria biotecnológica es de gramos a kilogramos, y utiliza columnas cromatográficas en un rango de volumen de litros a miles de litros. El aumento de escala es un problema de ingeniería e involucra consideraciones que no están asociadas con ciencia pura, como se la considera en el laboratorio. La operación en escala pequeña busca obtener cantidades limitadas de proteína, con mucha atención de personal altamente capacitado. En la operación a gran escala, se debe minimizar el costo y aumentar al máximo el rendimiento. Esto implica minimizar la intervención humana, sobre todo de científicos calificados. El proceso debe ser tan sencillo como sea posible. Las etapas innecesarias son antieconómicas, bajan el rendimieto y multiplican los problemas. Si el proceso de laboratorio está destinado desde un comienzo a una aplicación industrial, el método de purificación debe ser diseñado desde el principio con miras a su aplicación en gran escala. Hay etapas de purificación que pueden llevarse a una escala industrial y otras que no. La industria biotecnológica es extremadamente competitiva, y el factor tiempo es crítico. 98

99 El manejo de soluciones de proteínas en gran escala implica una serie de problemas técnicos, como evitar la formación masiva de espuma (que causa desnaturalización) en el bombeo de las soluciones, necesario para transferirlas entre etapas, evitar la agregación de las proteínas al aumentar su concentración, y evitar escrupulosamente la contaminación microbiana, que lleva a degradación. Las operaciones a realizar son como en cualquier purificación en escala normal, pero con características especiales. Separación de sólidos: Se pueden utilizar centrífugas industriales o filtración. Las centrífugas de alta velocidad requieren refrigeración, y contención adecuada para evitar la formación de aerosoles contaminantes del medio ambiente. El costo aumenta a medida que disminuye el tamaño de las partículas a separar. Los filtros pueden ser los llamados filtros profundos (tierra silícea, 5 a 10 cm de espesor) o membranas (microfiltración). Los problemas más importantes son la floculaciòn de las proteínas, su unión a las membranas y la desnaturalización. 99

100 Ruptura celular: las técnicas más aplicables a gran escala son el homogeneizador y el molino con bolitas de vidrio. Homogenizador: la suspensión (15-20 % de peso seco) es forzada a alta presión a través de una válvula estrecha; es el método mas usado, pero no sirve para microorganismos filamentosos. Puede procesar hasta 6000 litros/hora. Los molinos usan como abrasivo bolitas de vidrio, de mm de diámetro. Sirve para microorganismos filamentosos. Acepta % de células, peso húmedo, en suspensión y procesa hasta 2000 litros/hora. Tambien puede utilizarse en ciertos casos lisis enzimática (lisozima, por ejemplo) o química (tolueno, detergentes como SDS o Triton X-100, agentes caotrópicos como guanidina o urea). Operaciones primarias de separación: Incluyen la concentración, que se puede hacer por ultrafiltración o por precipitación, con sales o solventes orgánicos. La remoción de ácidos nucleicos puede hacerse con nucleasas, o agentes precipitantes, como la polietilenimina, polímero catiónico de peso molecular 24 kda. Esta precipitación remueve además los restos celulares ( cell debris ). 100

101 Operaciones de purificación de proteínas: Se debe buscar un mínimo de etapas, para disminuir los costos y aumentar el rendimiento. En general, una etapa preparativa (que debe dar un alto rendimiento, aunque no purifique mucho, y puede ser una precipitación salina); una etapa de alta resolución, que debe dar un producto altamente purificado, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico o de afinidad, o cromatoenfocado; y una etapa final, de pulido del producto, para eliminar los últimos contaminantes; a esta altura de la purificación, puede emplearse filtración por gel. Es lo más frecuente que el aumento de escala en los métodos cromatográficos se obtenga aumentando el radio de la columna y manteniendo, o aumentando poco, su altura. Pero esto dependerá, naturalmente, del tipo de cromatografía que se use. Existen columnas con volúmenes totales de hasta 2500 litros, con diámetro de 2 metros y alturas ajustables, hasta alrededor de 80 cm. La elución isocrática es más frecuente que el uso de gradientes, para simplificar la operación. Se pueden emplear columnas radiales, que constituyen un concepto nuevo en el campo de la cromatografía en columna. 101

102 Cromatografia de flujo radial. La muestra se distribuye del encabezamiento de la columna (6) al canal anular externo (1); de alli difunde a través de la pared porosa (5), a través del material cromatográfico, pasa luego a través de la pared porosa interna (4)y llega al canal interno (2) de donde pasa al colector. 102