11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 39/ Inventor/es: Hyöty, Heikki y Knip, Mikael. 74 Agente: Lehmann Novo, María Isabel

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl. 7 : A61K 39/12 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación: Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Prevención de la diabetes tipo I y otras enfermedades por enterovirus no polio. Prioridad: US 1872 P 73 Titular/es: Heikki Hyöty Minna Canthin Katu 3 B 332 Tampere, FI Mikael Knip 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Hyöty, Heikki y Knip, Mikael 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Lehmann Novo, María Isabel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Prevención de la diabetes tipo I y otras enfermedades por enterovirus no polio Campo de la invención La invención se refiere a la prevención de la diabetes tipo I y otras enfermedades por enterovirus no polio mediante un nuevo régimen de vacunación basado en una inmunización masiva con la vacuna del virus de la polio oral disponible actualmente (OPV) y/o con nuevas vacunas de enterovirus no polio. La invención proporciona prevención de la diabetes mellitus tipo I (IDDM) y otras enfermedades por enterovirus no polio mediante la eliminación del efecto de riesgo de las infecciones por enterovirus. Esto se logra mediante un nuevo régimen de inmunización, que se basa en la inducción de la inmunidad de células T tipo Th-1 sistémica y mucosa local mediante vacunas de virus de la polio orales y opcionalmente la inducción de la inmunidad humoral tipo Th-2 mediante una nueva vacuna de enterovirus que induce la neutralización de anticuerpos frente a serotipos de enterovirus apropiados. Estos dos regímenes pueden usarse por separado o combinados. Con más precisión, la presente invención se refiere al uso de la vacuna del virus de la polio oral (OPV) en la fabricación de una vacuna frente a enfermedades por enterovirus no polio, y especialmente frente a la diabetes mellitus tipo I (IDDM). Cuando la OPV se usa junto con una vacuna, que induce inmunidad específica de serotipo frente a enterovirus no polio, los efectos secundarios perjudiciales de la vacuna de enterovirus no polio se pueden evitar. La invención proporciona de este modo una composición de vacuna que comprende dichas dos vacunas. Antecedentes Las infecciones por enterovirus son habitualmente subclínicas pero también pueden producir varios tipos de enfermedades. Enfermedades típicas por enterovirus son la meningitis, parálisis, miocarditis, infecciones generalizadas en recién nacidos, enfermedad mano-pie-boca, herpangina, pleurodinia, hepatitis, rash, exantemas y enfermedades respiratorias incluyendo la neumonía. Además, se ha sospechado que las infecciones por enterovirus desempeñan un papel en la patogénesis de la miocardiopatía dilatada, arterioesclerosis, síndrome de fatiga postviral y la diabetes mellitus tipo I. El grupo de los enterovirus incluye un total de 64 serotipos diferentes. Los virus de la polio son los enterovirus más ampliamente conocidos que incluyen 3 serotipos diferentes (virus de la polio tipos 1, 2 y 3) los cuales pueden producir meningitis y poliomielitis paralítica típica (parálisis fláccida). La meningitis frecuentemente está producida por varios enterovirus no polio, que son la causa más frecuente de meningitis aséptica. La miocarditis está producida principalmente por serotipos de coxsackie B pero también se pueden incluir otros serotipos de enterovirus. La enfermedad mano-pie-boca está producida principalmente por ciertos serotipos de coxsackie A y las infecciones graves de la infancia se relacionan con serotipos de coxsackie B. Las enfermedades paralíticas también pueden estar producidas por otros serotipos además de los serotipos del virus de la polio. Los serotipos relacionados con la arterioesclerosis y la diabetes tipo I no se conocen. En la diabetes tipo I los más sospechosos han sido los virus coxsackie B4 y B pero también pueden incluirse otros además de los serotipos de coxsackie B. La única vacuna de enterovirus que se ha usado en seres humanos es la vacuna del virus de la polio. Esta vacuna incluye los tres serotipos del virus de la polio y proporciona prevención efectiva frente a la poliomielitis paralítica. La protección se basa en la inducción de anticuerpos neutralizantes frente a estos serotipos, y es específica de serotipo. De este modo, los anticuerpos neutralizantes, que se inducen mediante las vacunas del virus de la polio no protegen frente a ningún otro serotipo de enterovirus aparte de los tres serotipos del virus de la polio. El papel de las respuestas inmunes mediadas por células T en la protección frente a las infecciones por el virus de la polio no se conoce. La visión generalmente aceptada es que desempeñan sólo un papel menor mientras que los anticuerpos son más importantes en la eliminación de la infección y en la protección frente a reinfecciones. Se han desarrollado dos tipos diferentes de vacunas del virus de la polio. La vacuna de virus de la polio muertos inactivados (IPV; vacuna Salk) incluye virus de la polio inactivados con formalina (los 3 serotipos). Esta vacuna se administra parenteralmente usando inyecciones subcutáneas. Induce una respuesta inmune tipo Th-2 caracterizada por una fuerte respuesta de anticuerpos y altos niveles de anticuerpos neutralizantes frente a todos los serotipos del virus de la polio y proporciona prevención efectiva frente a la poliomielitis paralítica. Sin embargo, sólo induce una respuesta inmune local débil en el intestino. Como el tejido linfoide asociado al intestino es el primer sitio de replicación de los virus de la polio, la vacuna IPV no puede proteger frente a la infección por el virus de la polio sino sólo frente a las complicaciones de las infecciones. La IPV sólo puede inducir respuestas inmunes de células T citotóxicas débiles. La otra vacuna del virus de la polio es la vacuna de virus de la polio oral (OPV; vacuna Sabin) que incluye virus de la polio vivos atenuados (los tres serotipos). Esta vacuna se administra per os y el virus se replica de la misma forma que los virus de la polio salvajes en el cuerpo. Como la vacuna se administra per os de la misma forma que se adquieren las infecciones por enterovirus naturales, induce una inmunidad local fuerte en el intestino, que previene posteriores infecciones por el virus de la polio. De este modo, los individuos vacunados con OPV normalmente no se infectan con virus de la polio porque el virus no es capaz de replicarse en el intestino. La naturaleza de esta protección no se comprende completamente pero probablemente depende tanto de los anticuerpos neutralizantes como de la inmunidad 2

3 mediada por células T. La OPV induce respuestas de células T más intensas que la IPV e induce principalmente respuestas de células T tipo Th-1 caracterizadas por intensas respuestas de células T citotóxicas Las vacunas frente a enterovirus no polio no están disponibles para uso humano. La razón es que el gran número de serotipos de enterovirus hace difícil fabricar una vacuna de pan-enterovirus y, por otro lado, los serotipos, que causan las enfermedades por enterovirus no polio más graves, son altamente variables. La miocarditis y las miocardiopatías se han asociado con virus del grupo coxsackie B, la meningitis y las infecciones neonatales con varios serotipos diferentes y apenas se sabe nada acerca de los serotipos posiblemente relacionados con el desarrollo de la arteriosclerosis. En la diabetes tipo I no se conocen los serotipos responsables excepto que los virus de la polio no están involucrados. La visión general es que las vacunas de virus de la polio no serían efectivas en la prevención de la diabetes tipo I o de otras enfermedades por enterovirus no polio, sino que la prevención de las enfermedades por enterovirus no polio requeriría nuevas vacunas que inducirían anticuerpos neutralizantes frente a los serotipos de los que se va a proteger. Otra razón para la ausencia de las vacunas de enterovirus no polio humanas es que la seguridad de tales vacunas no se ha confirmado de forma fiable. De este modo, no hay vacuna efectiva ni ningún otro tratamiento para la prevención de las enfermedades por enterovirus no polio en el hombre. Ha habido interés público y científico sobre que las vacunas del virus de la polio podrían incrementar de hecho el riesgo de diabetes. Hiltunen y cols., 1999 analizan estas sospechas, paro no encontraron evidencias de un efecto negativo de la vacuna del virus de la polio en la IDDM. Classen 1998 desvela que las vacunaciones en la infancia incrementan el riesgo de diabetes al promover respuestas autoinmunes mediante la modulación no específica del sistema inmune. Para contrarrestar este efecto sugiere que cualquier vacuna incluyendo las vacunas del virus de la polio debería administrarse a una edad temprana, porque cualquier vacunación de la infancia después de la edad de 2 meses incrementa el riesgo de diabetes. Ninguna publicación sugiere que en la vacuna viral específica, OPV, haya un efecto positivo activo sobre la diabetes. Las vacunas de subunidades e inactivadas que incluyen ciertos virus coxsackie B se han probado en modelos animales. Han inducido buenos niveles de anticuerpos en ratones y conejos y protegido de forma efectiva de infecciones producidas por los serotipos que se incluyeron en la vacuna (Fohlman y cols., 1990 y 1993; ver y Tilles, 1994 y 1997). Sin embargo, estas vacunas no se han probado en seres humanos. La razón principal para esto es que el conocimiento actual sobre los mecanismos de la protección inmune frente a los enterovirus es limitada y la seguridad de tales vacunas no se puede garantizar. La cuestión de la seguridad se vuelve muy importante tras el descubrimiento de los inesperados efectos secundarios referidos al uso de las vacunas del sarampión y del virus sincitial respiratorio (RSV) inactivadas en humanos (Fulginiti y cols., 1967; Harris y cols., 1969; Kapikian y cols., 1969). Estas vacunas paradójicamente incrementaron la gravedad o modificaron el curso de las infecciones naturales. La explicación más probable para estos efectos adversos es que este tipo de vacunas inactivadas generalmente inducen una buena respuesta de anticuerpos pero una respuesta de células T citotóxicas muy pobre. De este modo, pueden haber inducido un cambio hacia la inmunidad mediada por anticuerpos tipo Th-2 que resulte en síntomas atípicos. Esto indica la necesidad de datos muy detallados sobre el efecto de la vacuna en el curso de las infecciones naturales y una cuidadosa evaluación de las cuestiones de seguridad. Otro problema ha sido que la protección que se logra mediante vacunas de este tipo depende de la inducción de anticuerpos neutralizantes y por lo tanto la protección es específica de serotipo. En consonancia, la vacuna incluiría los serotipos, que se deberían prevenir. Como se describe anteriormente, en las enfermedades por enterovirus no polio el espectro de serotipos responsables varía mucho de enfermedad a enfermedad e incluso en una enfermedad como la diabetes tipo I los serotipos exactos de los virus responsables no se han identificado todavía. De este modo, la composición de los serotipos de enterovirus de los que se va a proteger no se conoce y puede ser diferente de una enfermedad a otra. La ventaja del régimen de inmunización de la presente invención es que se basa en la vacuna del virus de la polio oral (OPV) que se ha usado extensamente en casi todos los países del mundo y que ha demostrado ser muy segura y efectiva. Las vacunas del virus de la polio son normalmente unas de las vacunas más seguras y efectivas jamás desarrolladas y han conducido a una erradicación casi completa de las infecciones por virus de la polio en el mundo. La única complicación clínicamente relevante de la OPV es el riesgo de parálisis asociado a la vacuna. Sin embargo, su frecuencia es extremadamente baja (casi de 1 por cada 1- millones de vacunas). La visión general es que la inmunidad frente a la infección por enterovirus se basa en la presencia de anticuerpos neutralizantes frente al virus. Estos anticuerpos pueden neutralizar eficientemente el virus cuando entra en el cuerpo. La importancia de los anticuerpos neutralizantes se refleja en el hecho de que los pacientes que tienen niveles anormalmente bajos de anticuerpos debido a una deficiencia inmune son particularmente susceptibles a las infecciones por enterovirus. Los anticuerpos neutralizantes pueden detectarse durante periodos prolongados después de la infección. Contribuyen a la erradicación del virus durante la infección primaria por enterovirus y protegen frente a las reinfecciones. Sin embargo, no pueden proteger frente a las infecciones, que se producen por otros serotipos. De este modo, la protección de estos anticuerpos es específica de serotipo. En consonancia, en general se piensa que es esencial para la eficacia de las vacunas de enterovirus que la vacuna sea capaz de inducir títulos altos de anticuerpos neutralizantes frente a los serotipos de los que se va a proteger. La única vacuna de enterovirus usada actualmente es la vacuna del virus de la polio que incluye los tres serotipos del virus de la polio. La presente invención se basa en el hallazgo de que, al contrario del paradigma general, las vacunas del virus 3

4 2 3 de la polio orales podrían proteger también frente a otras infecciones por enterovirus aparte de las infecciones por el virus de la polio y podrían por lo tanto usarse en la prevención de varias enfermedades por enterovirus no polio, que se han descrito en detalle en párrafos anteriores, y de enfermedades en las que se ha sospechado el papel de los enterovirus incluyendo la diabetes mellitus tipo I, síndrome de fatiga crónica y arteriosclerosis. Esta protección se basaría en la inducción eficiente de respuestas de células T e inmunidad de mucosa local mediante vacunaciones de OPV repetidas. Las respuestas inmunes de células T se conocen por producir reacciones cruzadas entre ciertos serotipos de enterovirus cuando son analizadas in vitro mediante ensayos de proliferación de células T (Beck y Tracy, 1990; Graham y cols., 1993). Sin embargo, no se conoce si la reactividad cruzada tiene algún significado biológico in vivo. Tampoco se conoce hasta qué punto las respuestas de células T que se inducen mediante vacunaciones OPV pueden producir reacciones cruzadas con enterovirus no polio y si esto tiene alguna relevancia clínica. Hemos analizado previamente esas cuestiones mediante el análisis de las respuestas de células T específicas en niños pequeños. Encontramos que algunos niños, que nunca habían experimentado ninguna infección por virus coxsackie B de acuerdo con la carencia de anticuerpos neutralizantes, tenían una respuesta de proliferación de células T fuerte frente al antígeno B4 de virus coxsackie purificado, lo cual refleja probablemente la reactividad cruzada de las células T que se han inducido inicialmente por otras infecciones por enterovirus (Juhela y cols., 1998). Además, la vacunación de la polio a la edad de 6 meses indujo una respuesta más fuerte a los antígenos del virus de la polio y B4 del virus coxsackie purificados en los niños que tenían evidencia serológica de infección previa por enterovirus en comparación con los niños que no tenían infección por enterovirus previa (Juhela y cols., 1998). Esto sugiere que las células T pueden producir reacciones cruzadas entre los enterovirus polio y no polio. Nuestro objetivo es utilizar esta reactividad cruzada de células T mediante la preparación de la memoria de células T de reacción cruzada usando vacunaciones OPV. Esto, en cambio, haría las respuestas inmunes a otros enterovirus más fuertes y más rápidas (respuesta secundaria) y de esta forma aumentaría la velocidad de erradicación del virus durante las infecciones por enterovirus no polio agudas. La OPV no puede proteger totalmente de estas infecciones ya que no induce anticuerpos neutralizantes frente a enterovirus no polio pero puede proteger frente a la viremia y la enfermedad grave mediante la potenciación de las respuestas de células T mediante la inducción de células T de memoria de reacción cruzada. Este tipo de ayuda de células T puede potenciar tanto la producción de anticuerpos neutralizantes durante la infección como las respuestas de células T citotóxicas frente a enterovirus no polio. También puede incrementar los anticuerpos frente a otros enterovirus aparte del serotipo que causa la infección aguda mediante la provocación de respuestas inmunes de memoria. La inducción de respuestas de memoria significa que la OPV estimula clones de células T de memoria, que se han originado en exposiciones previas a enterovirus y conducen de esta forma a su activación y a la inducción de anticuerpos frente a todos estos serotipos. Este tipo de respuesta de memoria se usa en el presente régimen para aumentar los niveles de anticuerpos para enterovirus en mujeres embarazadas proporcionando de este modo protección a sus hijos. Resumen de la invención Un objetivo de la presente invención es proporcionar medios para prevenir las enfermedades por enterovirus no polio, especialmente la diabetes tipo I (IDDM). Otro objetivo de la invención es proporcionar una vacuna o composición de vacuna útil para prevenir dichas enfermedades Otro objetivo más de la presente invención es evitar los efectos secundarios perjudiciales de las vacunas de enterovirus muertos o en subunidades que inducen inmunidad específica de serotipo. Otro objetivo más de la presente invención es el uso de una vacuna de la polio y/o una vacuna de enterovirus no polio en la fabricación de una vacuna frente a las enfermedades por enterovirus, especialmente la diabetes tipo I (IDDM). Se desvela un procedimiento de prevención de las enfermedades por enterovirus no polio o de prevención de la diabetes mellitus tipo I (IDDM) que comprende la administración de una cantidad efectiva de vacuna del virus de la polio oral (OPV) a un sujeto humano. La invención abarca además el uso de la vacuna del virus de la polio oral (OPV) para la fabricación de una vacuna frente a las enfermedades por enterovirus no polio, y especialmente para la fabricación de una vacuna frente a la diabetes mellitus tipo I (IDDM). La invención también se dirige a una composición de vacuna que comprende vacuna del virus de la polio oral (OPV) y vacuna de enterovirus no polio, que induce inmunidad específica de serotipo frente a los enterovirus no polio. Preferentemente la vacuna de enterovirus no polio comprende antígenos de enterovirus que representan serotipos de enterovirus diabetogénicos o una combinación suya. La invención se refiere además al uso de una vacuna, que induce inmunidad específica de serotipo frente a uno o más serotipos de enterovirus no polio diabetogénicos seleccionados del grupo que consta de virus coxsackie B serotipos 1, 2, 3, 4, y 6, virus echo seotipos 3, 4, 6, 9, 11, 22 y, y virus coxsackie A serotipos 9 y 16 para la fabricación de una vacuna frente a la diabetes mellitus tipo I (IDDM). Se desvela además un procedimiento de 4

5 prevención de la IDDM, que comprende la administración de una cantidad efectiva de dicha vacuna a un sujeto humano. Las vacunas mencionadas también son útiles en un procedimiento de prevención de enfermedades por enterovirus no polio, especialmente la diabetes mellitus tipo I en la descendencia que comprende la administración de una cantidad efectiva de vacuna del virus de la polio oral (OPV) a una mujer embarazada, o la administración de una cantidad efectiva de vacuna del virus de la polio oral (OPV) de forma prenatal a la mujer embarazada y postnatal al niño. Se expone un procedimiento de prevención de las enfermedades por enterovirus no polio, especialmente la IDDM, que comprende la administración de dosis repetidas de una cantidad efectiva de vacuna del virus de la polio oral (OPV) a los niños. Las vacunas son útiles en un procedimiento para evitar los efectos secundarios perjudiciales de las vacunas de enterovirus no polio, las cuales inducen inmunidad específica de serotipo frente a enterovirus no polio que comprende la administración de una cantidad efectiva de vacuna de enterovirus no polio simultáneamente, antes o después de la administración de una cantidad efectiva de vacuna del virus de la polio oral (OPV) a un sujeto humano. Breve descripción de la figura La figura 1 muestra la prevalencia acumulada de IDDM en cohortes que nunca han recibido OPV, o que han recibido una dosis de OPV en la infancia o in utero. Descripción detallada de la invención OPV es la abreviatura de vacuna del virus de la polio oral, y significa que es una vacuna que comprende virus de la polio vivos atenuados de uno, dos o los tres serotipos o su ADNc o ARN infeccioso. Además de administrarse de forma oral la OPV también se puede administrar por cualquier otra vía mucosa como per rectum o de forma intranasal o puede administrarse de forma parenteral. La OPV que comprende virus atenuados de los tres serotipos está disponible comercialmente y también se llama vacuna Sabin. IPV es otra vacuna del virus de la polio disponible comercialmente, que comprende virus de la polio muertos inactivados de los tres serotipos. La vacuna se llama vacuna Salk. IDDM significa diabetes mellitus insulín-dependiente, que es lo mismo que la diabetes mellitus tipo I o la diabetes tipo I. Enfermedades por enterovirus no polio significa cualquier enfermedad producida por enterovirus no polio p. ej. meningitis, parálisis, miocarditis, infecciones generalizadas en neonatos, enfermedad mano-pie-boca, herpangina, pleurodinia, hepatitis, rash, exantemas, enfermedades respiratorias que incluyen la miocardiopatía dilatada, arteriosclerosis, síndrome de fatiga postviral y diabetes mellitus tipo I. Cantidad efectiva de una vacuna es una cantidad que es capaz de provocar una respuesta inmune protectora en el receptor, ya sea por la producción de anticuerpos neutralizantes o por una respuesta mediada por células, o ambas. Una vacuna que induce inmunidad específica de serotipo es lo mismo que una vacuna que induce anticuerpos neutralizantes. Tales vacunas pueden ser vacunas muertas, vacunas de subunidades o vacunas de fragmentos de ADNc o ARN, en las que los fragmentos codifican una porción antigénica o una forma inactivada del virus. Una vacuna muerta es lo mismo que una vacuna inactivada es decir una vacuna que comprende virus tratados de forma que han perdido su capacidad infectiva. Una vacuna de subunidades comprende sólo una porción o porciones antigénicas del virus, no el virus completo. Un enterovirus diabetogénico es un enterovirus que se asocia con la inducción de diabetes. Estos virus se representan en el grupo que consiste en virus coxsackie B serotipos 1, 2, 3, 4, y 6, virus echo serotipos 3, 4, 6, 9, 11, 22 y, y virus coxsackie A serotipos 9 y 16. Sin embargo, también otros serotipos de enterovirus no polio podrían estar involucrados en la inducción de la diabetes. Cada uno de los tres serotipos de virus de la polio puede producir enfermedad paralítica. La vacuna del virus de la polio oral usada en la presente invención puede contener sólo uno de ellos o de sus diferentes combinaciones. Preferentemente contiene una combinación de los tres serotipos (serotipos 1-3). Los virus de la vacuna OPV usados son virus de la polio atenuados, cuya virulencia se ha reducido. Esto puede llevarse a cabo por diferentes procedimientos que incluyen pasos seriados del virus en cultivos celulares, modificación antigénica mediante tratamientos químicos, construcción de virus recombinantes o quimeras, mutaciones del genoma viral, deleciones de ciertas regiones genéticas, selección de mutantes sensibles a la temperatura o irradiación. De forma alternativa, los virus de la vacuna pueden ser virus de la polio aislados naturales atenuados o ARN o ADNc del virus de la polio infecciosos que tienen reducida la capacidad de producir enfermedad clínica. Típicamente, el régimen de inmunización presentado se basa en el uso de la ampliamente usada y disponible comercialmente vacuna del virus de la polio oral Sabin, que contiene los tres

6 serotipos de virus de la polio en cada dosis de vacuna. Se administra de forma oral y se replica en el intestino, pero no produce polio paralítica ni otras manifestaciones clínicas. 2 3 Cada dosis inmunizante de la OPV incluye virus infectivos o ARN o ADNc infectivos en un título que es capaz de producir infección en humanos. Esta dosis correspondería a la que se usa en la tradicional vacuna del virus de la polio oral viva tipo Sabin que incluye un mínimo de, - 6 TCID 0 para virus de la polio tipo 1, TCDI 0 para virus de la polio tipo 2 y, -,8 TCDI 0 para virus de la polio tipo 3 de cargas de virus de la polio vivos atenuados Sabin. La dosis también puede ser otra, si se ha confirmado que es segura e infecciosa. (TCDI = dosis infecciosa de cultivo tisular; TCDI 0 = la dosis que infecta el 0% de los cultivos.) Las nuevas vacunas de enterovirus no polio del presente régimen de inmunización pueden incluir tanto virus completos, cuya infectividad se ha inactivado, o vacunas de subunidades que contienen ciertas estructuras antigénicas del virus, o su combinación, o fragmentos de ARN o ADNc viral que codifican para estructuras antigénicas del virus. Las vacunas inactivadas pueden producirse mediante la propagación del virus en cultivos celulares y la purificación de células infectadas y medios de cultivo mediante centrifugación a alta velocidad en un gradiente de densidad formado por sacarosa u otros medios de alta densidad. De forma alternativa el virus podría purificarse mediante cromatografía. La infectividad de los virus purificados se destruye mediante la inactivación de los virus mediante tratamientos químicos (por ejemplo inactivación con formalina como la que se usa para producir la IPV), irradiación o tratamientos con calor. Las vacunas de subunidades pueden constar de proteínas virales purificadas o proteínas virales recombinantes, péptidos sintéticos que corresponden a epítopos antigénicos virales o cápsides virales vacías, que se producen durante la infección pero a las que les falta el genoma viral. Estas vacunas de subunidades se pueden administrar como tales o conjugadas con haptenos o vehículos (por ejemplo las partículas ISCOM). Las nuevas vacunas de enterovirus no polio se pueden administrar vía parenteral o mucosa como per os, per rectum o de forma intranasal. Cada dosis inmunizante incluye estructuras virales en un título que es capaz de inducir respuesta inmune propia en humanos. Esta dosis correspondería a la usada en la vacuna del virus de la polio inactivada tipo Salk que incluye 1,8-2 µg de proteínas virales por cada dosis y - unidades D antigénicas del virus de la polio tipo 1, 4-8 unidades D antigénicas del virus de la polio tipo 2 y unidades D antigénicas del virus de la polio tipo 3. La dosis también puede ser otra, si se ha comprobado que sea segura e inmunógena. Además de los ingredientes activos que provocan una respuesta inmune, las vacunas OPV y de enterovirus no polio usadas en la presente invención pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos, haptenos y adyuvantes. Los excipientes, vehículos, haptenos y adyuvantes pueden incluir por ejemplo fenoxietanol, cloruro de magnesio, sacarosa, tiomersal, formaldehido, fenol, antibióticos (conservadores) o sales de aluminio, partículas ISCOM, proteínas transportadoras (por ejemplo la toxina del cólera), liposomas o micelas proteicas (haptenos/adyuvantes). Se introduce un nuevo régimen de inmunización para la prevención de enfermedades producidas por enterovirus no polio (tabla 1). TABLA 1 Régimen de inmunización principal 4 0 Acción 1. OPV durante el embarazo Se administra preferentemente durante el primer trimestre pero también se puede administrar más tarde durante el embarazo. Acción 2. OPV en la infancia. Se administra a la edad de 3, 6 y 12 meses, con recuerdos en la edad adulta. También se puede administrar en madres embarazadas. Acción 3. Vacuna muerta/de subunidades. Administrada a la edad de 3, 6 y 12 meses, recuerdos a edades posteriores. También se puede administrar a madres embarazadas. 6 Las acciones 1, 2 y 3 se pueden usar de forma separada o en diferentes combinaciones. El periodo de vacunaciones de OPV de la infancia de la acción 2 puede variar pero las primeras deberían administrarse preferentemente a la edad de 3 meses. La vacuna muerta o de subunidades incluye uno o más de los siguientes serotipos de enterovirus o de sus estructuras antigénicas: virus coxsackie B serotipos 1, 2, 3, 4, y 6, virus echo serotipos 3, 4, 6, 9, 11, 22 y, virus coxsackie A serotipos 9 y 16. Pueden administrarse durante el embarazo y en distintas edades durante la infancia con recuerdo administrado más tarde. La vacuna de enterovirus muertos o de subunidades se pueden administrar simultáneamente, antes o después de ser administrada la OPV. 6

7 La protección frente a los enterovirus no polio se induce mediante inmunización masiva con dosis repetidas de vacuna de virus de la polio oral vivos atenuados (OPV). El régimen incluye vacunaciones OPV prenatales y postnatales, que se pueden usar en combinación o por separado. La vacunación prenatal se lleva a cabo mediante la administración de la OPV a las mujeres embarazadas para proteger al niño in utero y en la infancia (acción 1 en tabla 1). Esta protección se basa en la respuesta inmune de memoria, que se induce mediante la vacunación OPV. La respuesta de memoria se debe a la activación de clones de células T de memoria específica de enterovirus cruzada y conducen a incrementos en los niveles de anticuerpos frente a esos serotipos de enterovirus a los que la madre se ha expuesto antes de la vacunación de OPV. La respuesta de anticuerpos de memoria de la madre protege al niño porque los anticuerpos maternos de clase IgG se transfieren al feto a través de la placenta y de este modo protegen al niño hasta la edad de 6-12 meses cuando los anticuerpos maternos desaparecen de la circulación del niño. La vacunación postnatal (acción 2) se lleva a cabo como las tablas de vacunación en general pero pueden ser más masivas para conseguir la máxima estimulación de la inmunidad de células T cruzada (tabla 1). Incluye en vacunaciones repetidas, las primeras administradas al nacimiento y durante las primeras semanas de vida y seguidas por vacunaciones de recuerdo en la infancia con intervalos de algunos años (como en el programa WHO-EPI). La vacunación OPV per os induce también una respuesta inmune local fuerte en las superficies mucosas, particularmente en el intestino. Esto es importante porque el lugar de replicación principal de los enterovirus es el tejido linfoide asociado al intestino. Esta inmunidad local se dirige también a los enterovirus no polio debido a la respuesta de células T cruzada y la inducción de la producción local de interferón. Las acciones 1 y 2 de este régimen se pueden combinar con las nuevas vacunas de enterovirus no polio, que inducen inmunidad específica de serotipo para alcanzar el máximo efecto protector frente a los enterovirus no polio (acción 3 en tabla 1). La inmunidad específica de serotipo puede inducirse mediante partículas de enterovirus muertos o vacunas de subunidades que llevan estructuras o péptidos de ciertos enterovirus. Esta vacuna específica de serotipo puede administrarse a madres embarazadas así como a niños como se describe en la tabla 1. La vacuna específica de serotipo preferentemente incluye uno o más de los siguientes serotipos de enterovirus (virus coxsackie B serotipos 1, 2, 3, 4, y 6, virus echo serotipos 3, 4, 6, 9, 11, 22 y, y virus coxsackie A serotipos 9 y 16). Este tipo de vacunas muertas o de subunidades inducen una respuesta de anticuerpos eficiente pero la protección es específica para aquellos virus que se incluyen en la vacuna (la protección mediante anticuerpos neutralizantes es específica de serotipo). En tal combinación la OPV se puede usar para proporcionar una protección adicional mediante respuestas de células T cruzadas frente a los serotipos que no están incluidos en la vacuna muerta/de subunidades. La OPV también se puede usar para reforzar las respuestas de anticuerpos que se inducen mediante las vacunas muertas/de subunidades. La OPV también se puede usar para dirigir las respuestas inmunes inducidas por las vacunas muertas/de subunidades hacia respuestas de tipo Th-1 más que respuestas de tipo Th-2. Las respuestas de tipo Th-2 se inducen típicamente mediante vacunas muertas/de subunidades y se pueden asociar con efectos secundarios importantes que conduce a un curso más grave de la infección natural en los individuos vacunados (como se observa en individuos vacunados con RSV muerta o vacunas de sarampión). La OPV como otras vacunas vivas induce respuestas de tipo Th-1 principalmente que conducen a respuestas de células T citotóxicas y de este modo pueden contrarrestar las respuestas de tipo Th-2 inducidas por vacunas muertas/de subunidades mediante la inducción de respuestas cruzadas de células T tipo Th-1. Para evitar las respuestas de tipo Th-2 la OPV puede administrarse tanto antes, como simultáneamente o después de administrarse las vacunas muertas o de subunidades. De este modo, el régimen presente incluye vacunaciones OPV para inducir respuestas de células T sistémicas e inmunidad mucosa local así como respuestas de anticuerpos de memoria en madres embarazadas (acciones 1 y 2). Las vacunaciones OPV se pueden combinar con nuevas vacunas de enterovirus inactivadas o de subunidades (acción 3). Esta combinación proporcionaría el máximo efecto preventivo (anticuerpos neutralizantes inducidos mediante vacunas muertas/subunidades son las primeras barreras frente a las infecciones y la inmunidad de células T inducida por la OPV ayuda en la erradicación de la invención). La OPV también puede usarse en combinación con vacunas inactivadas o de subunidades para aumentar o reforzar su efecto o para prevenir los posibles efectos secundarios prejudiciales causados por la acción biológica tipo Th-2 en la respuesta inmune a enterovirus que pueden producirse mediante vacunas inactivadas o de subunidades. Hemos encontrado que hay efectos secundarios inesperados en vacunas IPV, que incrementan el riesgo de complicaciones de las infecciones por enterovirus no polio como la diabetes tipo I mediante la dirección de la respuesta inmune frente a los enterovirus no polio en la dirección de Th-2. Sin embargo, la OPV es beneficiosa, porque disminuye el riesgo de complicaciones de las infecciones por enterovirus no polio y las vacunaciones de vacunas de enterovirus no polio inactivadas/de subunidades (por ejemplo frente a la diabetes) mediante la inducción de células T de memoria cruzada, mediante la dirección de la respuesta inmune a los enterovirus no polio en dirección Th-1 y mediante la inducción de protección local en los tejidos mucosos. Una ventaja de esta invención es que se basa en una vacuna ampliamente usada y muy segura (OPV) pero proporciona una nueva indicación para esta vacuna, que no se había sugerido previamente. Los aspectos novedosos son también que la invención utiliza respuestas de células T fuertes inducidas por una vacuna OPV viva, la reacción cruzada de estas respuestas entre diferentes serotipos de enterovirus, la inducción de respuestas inmunes locales mediante la OPV en las superficies mucosas de intestino y faringe, vacunación tanto en madres embarazadas como en los niños, y combinación opcional de la OPV con nuevas vacunas muertas/de subunidades específicas de serotipo para reforzar su efecto y para evitar sus efectos secundarios relacionados con las respuestas basadas en Th-2. Un nuevo aspecto adicional es que la vacuna inactivada/de subunidades incluye serotipos, que son los más importantes en la patogénesis 7

8 de las enfermedades por enterovirus no polio graves incluyendo la diabetes tipo I Este régimen de vacunación se puede usar en toda la población o en grupos específicos de alto riesgo como los niños con alelos genéticos de riesgo para la diabetes tipo I, niños con diabetes en familiares de primer grado o niños con autoanticuerpos relacionados con diabetes positivos. Este régimen de vacunación es la única posibilidad actualmente disponible para la prevención de las enfermedades por enterovirus no polio en el hombre. Se puede aplicar a la práctica clínica inmediatamente ya que se basa en una vacuna ampliamente utilizada actualmente y bien tolerada (OPV). Se puede combinar con vacunas de enterovirus inactivadas o de subunidades para incrementar su efecto preventivo y evitar sus efectos secundarios. En Finlandia prácticamente toda la población se vacunó con una dosis de OPV en febrero-marzo del año 198 para erradicar la última epidemia de polio (Hovi y cols., 1986; Harjulehto-Mervaala y cols., 1994). Esto proporciona una posibilidad excelente para analizar los posibles efectos de la vacunación con OPV sobre el riesgo de la diabetes tipo I porque la IPV se ha usado como la única vacuna del virus de la polio durante décadas y también se ha usado después de la epidemia. La vacunación OPV también se administró a mujeres embarazadas (Harjujehto-Mervaala y cols., 1993). Hemos analizado la prevalencia acumulada de la diabetes tipo I en cohortes de niños que han recibido vacunación OPV en el año 198 tanto en la infancia como in utero y se ha comparado con la prevalencia acumulada en cohortes de niños que no habían recibido nunca la OPV (figura 1). La figura muestra la prevalencia acumulada de la diabetes tipo I (IDDM) por cada niños de 8 años de edad en Finlandia en cohortes de niños que tampoco han recibido nunca la vacuna del virus de la polio oral (OPV) o que se han vacunado con una dosis de OPV en la infancia o in utero durante la campaña de vacunación masiva de 198. La prevalencia acumulada de la diabetes tipo I fue significativamente inferior en las cohortes de vacunados con OPV comparada con las cohortes no vacunadas: la prevalencia media en las cohortes vacunadas con OPV en nacidos en los años fue 272 comparada con 326 en las cohortes no vacunadas en nacidos e (p<0,01 en el test de la t de Student). La prevalencia de diabetes también fue inferior en los niños cuya madre se había vacunado durante el embarazo (261 por cada 0.000, figura 1). Estos hallazgos indican que tanto la acción 1 como la 2 del propuesto régimen de inmunización (ver tabla 1) tienen un efecto protector frente a la diabetes tipo I. También hemos encontrado que la incidencia de diabetes tipo I se correlaciona con el tipo de vacuna de virus de la polio usada en diferentes países. Esta correlación no es absoluta pero hay una tendencia general a una menor incidencia de diabetes tipo I en países donde se usa la OPV comparada con los países donde se usa la vacuna del virus de la polio inactivada (muerta) (IPV). En Finlandia la incidencia de diabetes tipo I es la más alta del mundo, y Finlandia es también uno de los pocos países donde la IPV se ha usado como única vacuna del virus de la polio durante varias décadas (excepto en el año 198 como se mencionó anteriormente). Un posible papel de los diferentes regímenes de vacunación de la polio como causa de las diferencias internacionales en la incidencia de la diabetes tipo I se apoya también por nuestros hallazgos en los niños estonios y finlandeses. En Estonia, donde la incidencia de la diabetes tipo I es un tercio de la de la vecina Finlandia, la OPV se usa como única vacuna del virus de la polio en contraste con Finlandia donde se usa la IPV. Analizamos las respuestas de células T al toxoide tetánico, virus de la polio tipo I, virus coxsackie B4 (CBV4) y antígenos de adenovirus en niños de 9 meses de edad en ambos países. Las respuestas al virus de la polio y al CBV4 fueron significativamente más altas en los niños estonios que en los finlandeses (p<0,0) mientras que las respuestas a otros antígenos no se diferenciaron entre los grupos. Los anticuerpos neutralizantes frente a los enterovirus del grupo CBV no se diferenciaron entre los grupos lo que sugiere que la diferencia observada en las respuestas de células T no se debían a la diferente exposición de los niños a los enterovirus en los dos países. De forma consecuente, la respuesta de células T más alta a los virus CBV4 purificados en los niños estonios probablemente refleja reactividad cruzada de las células T producidas por vacunaciones previas de OPV. En Finlandia, la vacuna IPV se usa sin que induzca respuestas de células T tan altas como la OPV y se administra también a mayores edades que la OPV en Estonia (los niños estonios habían recibido tres dosis de OPV comparado con una dosis de IPV en los niños finlandeses de 9 meses de edad). Esto sugiere que el calendario de vacunación OPV en Estonia induce una respuesta inmune cruzada más intensa a los enterovirus no polio que el calendario de vacunación IPV usado en Finlandia. Esto indica que la acción 2 de nuestro régimen de inmunización (ver tabla 1) tiene un efecto protector frente a la diabetes tipo I. En el estudio Finlandés para la Predicción y Prevención de la Diabetes (DIPP) hemos analizado la frecuencia y el serotipo de las infecciones por enterovirus en 21 niños a los que se les había seguido desde el nacimiento que habían manifestado diabetes tipo I clínica o que habían positivizado los anticuerpos relacionados con diabetes como marcador de daño de las células beta subclínico. Las infecciones por enterovirus fueron más frecuentes en estos niños que en 4 niños control que coincidían en la fecha de nacimiento, género y alelos HLA de riesgo para la diabetes tipo I (p<0,03). Esta diferencia fue particularmente clara en las infecciones que ocurrían 0-6 meses antes de que aparecieran los autoanticuerpos: el 7% de los sujetos con autoanticuerpos positivos tuvieron una infección de enterovirus durante ese periodo comparado con el 31% de los sujetos control de la misma edad (OR 3,7 9% CI 1,2-11,4) (observación no publicada). Durante este periodo el 29% de los niños con autoanticuerpos positivos fueron positivo para el ARN de enterovirus en suero comparado con el 6% de los sujetos control (OR 8,4, 9% CI 1,7-,2). Los resultados sugieren que las infecciones por enterovirus son importantes factores de riesgo para la diabetes tipo I y capaces de iniciar el proceso de lesión de las células beta en individuos genéticamente susceptibles. La edad media de los niños en la apariciñon de los autoanticuerpos fue de 9 meses lo que sugiere que las infecciones por enterovirus diabetogénicos pueden ocurrir ya durante los primeros meses de vida. 8

9 2 El serotipo de las infecciones por enterovirus relacionado con la inducción de autoanticuerpos o manifestaciones de diabetes clínica se han analizado en el estudio DIPP y en el estudio previo de Diabetes Infantil en Finlandia (DiMe). Estos serotipos se incluyen en la vacuna muerta/de subunidades del presente régimen de inmunización (acción 3 en tabla 1). Las vacunaciones OPV se pueden combinar con vacunas no sólo específicas de serotipo sino también con regímenes de inmunización pasiva frente a enterovirus. Este tipo de inmunización pasiva puede incluir por ejemplo inmunoglobulinas que contienen anticuerpos específicos de enterovirus y que se administran de forma intravenosa u oral. Ejemplo 1 Hemos analizado el efecto de la vacunación OPV el curso de la infección por virus coxsackie B3 (CVB3) subsiguiente en ratones. En estos estudios hemos usado una carga transgénica BALB/c que expresa el receptor del virus de la polio humano y que puede por lo tanto infectarse por los virus de la polio humanos (Horie y cols., 1994). Los ratones transgénicos BALB/c se inmunizaron primero mediante vacunas de virus de la polio vivos (carga Sabin de virus de la polio tipo 1) o vacunas de virus de la polio inactivadas IPV, y más tarde se les infectó con una carga de virus coxsackie B3 pancreatotropos (carga Nancy). (La IPV fue la vacuna Novum de virus de la polio oral disponible comercialmente comprada por el Instituto de Salud Pública Nacional de Holanda). Se administraron de forma intramuscular dos dosis de vacuna de carga tipo 1 de virus de la polio oral (Sabin) con un intervalo de dos semanas). Se administraron de forma intramuscular dos dosis de vacuna de virus de la polio muertos de la misma forma (0,1 µg por ratón). Dos semanas después de la última inyección de virus de la polio el ratón se infectó con virus coxsackie B3. Las respuestas de proliferación de células T se analizaron dos semanas después de la infección por virus coxsackie B3 usando una prueba de transformación de corriente estándar y virus altamente purificados como antígenos. Las respuestas de células T se expresan como cantidades específicas (cpm media), y los resultados se muestran en la tabla 2. TABLA 2 Efecto de la inmunización previa por virus de la polio en las respuestas de proliferación durante la infección subsiguiente con virus coxsackie B3 en ratones transgénicos que expresan receptor para el virus de la polio humano La gradación de virus coxsackie B3 inducía pancreatitis y miocarditis y la detección de la viremia se hizo dos semanas después de la infección por el virus coxsackie B3. La presencia de viremia se analizó al mismo tiempo mediante detección de ARN viral en suero usando un procedimiento de RT-PCR sensible. Los resultados se muestran en la tabla

10 TABLA 3 Efecto de la inmunización previa por virus de la polio en la patogénesis de la infección subsiguiente por virus coxsackie B3 en ratones transgénicos que expresan receptor para el virus de la polio humano En los experimentos la vacuna de virus de la polio vivos (cepa Sabin) incrementó in vitro las respuestas de proliferación de células T durante la infección subsiguiente por virus coxsackie B3. Este incremento se observó en las respuestas de proliferación frente a virus coxsackie B3 purificado y virus de la polio tipo 1 (tabla 2). Esto sugiere que la vacunación previa con virus de la polio vivos puede aumentar las respuestas inmunes celulares durante la infección subsiguiente por enterovirus no polio. La vacunación previa con IPV también aumenta las respuestas de células T durante la infección subsiguiente por virus coxsackie B3 pero el efecto es más débil que el de la vacuna viva (tabla 2). La inmunización previa con vacuna de virus de la polio vivos (virus de la polio tipo 1, cepa de vacuna Sabin) incrementa la infiltración de células T en el páncreas durante la infección subsiguiente con una carga pancreatotrópica de virus coxsackie B3 (tabla 3). Por el contrario, la vacunación previa con IPV se asoció con una infiltración de células T débil del páncreas comparado con la observada después de la vacuna de virus de la polio vivos o de la de los ratones control. Estos resultados sugieren que la vacunación con virus de la polio vivos aumenta in vivo las respuestas de células T durante la infección subsiguiente por enterovirus no polio mientras la vacuna de virus de la polio muertos puede tener un efecto opuesto. Hubo también tendencia a una baja frecuencia de viremia en ratones previamente inmunizados con virus de la polio vivos. Esto sugiere que la vacunación con virus de la polio vivos facilita la erradicación de las infecciones subsiguientes por enterovirus no polio. En otro experimento se encontró que 9 (92%) de los doce ratones vacunados de polio tenían infiltración de células T en el corazón comparado con 7 (3%) de los quince ratones no vacunados. Esto sugiere que la infección previa por virus de la polio vivos exagera la respuesta de células T durante la infección con CBV3 in vivo. Ejemplo 2 Hemos producido y probado vacunas de virus coxsackie B inactivadas con formalina en ratones. Estas vacunas se produjeron mediante la inactivación en gradiente de sacarosa virus purificados en 14 días de incubación a 37º C en 0,01% de formalina en PBS. Los niveles medios de anticuerpos IgG1 frente a virus coxsackie B3 purificado se determinaron en ratones Balb/c inmunizados con 3 inyecciones intramusculares repetidas de vacuna de virus coxsackie B inactivado con formalina o de salino tamponado con fosfato (PBS). Las inyecciones se administraron con intervalos de dos semanas (la primera a las 8 semanas de vida) y los anticuerpos se midieron 2 semanas después de la última vacunación. Los niveles de anticuerpos se expresan como valores OD 492 en EIA (tabla 4).

11 TABLA 4 Niveles de anticuerpos inducidos por la vacuna de virus coxsackie B3 inactivados en ratones 2 La presencia de viremia (virus en la suero) se determinó en ratones BALB/c inmunizados con tres inyecciones intramusculares repetidas de vacuna de virus coxsackie B3 inactivado con formalina o de salino tamponado con fosfato (PBS) e infectados subsiguientemente con una cepa pancreatotrópica de virus coxsackie B3 (carga Nancy, 6 TCID 0 /ratón). Las inmunizaciones se hicieron con intervalos de dos semanas (la primera a las 8 semanas de edad) y los ratones se infectaron 2 semanas después de la última inyección. La presencia de virus en el suero (viremia) se analizó tres días después de la infección usando el ensayo de dilución final de infectividad. La dilución final de infectividad en los cultivos de células de LLC se presenta en la tabla. TABLA Protección frente a la viremia mediante la inmunización con una vacuna de virus coxsackie B3 inactivados ND: no detectable (título < 1 ) Como se muestra en la tabla 4 la inmunización con vacuna de virus coxsackie B3 inactivada induce niveles altos de anticuerpos medidos frente al virus coxsackie B3 purificado en la prueba EIA. También encontramos que la vacunación protege completamente a los ratones frente a la infección de una cepa pancreatotropa de virus coxsackie B3. Los virus podrían no detectarse en el suero de cualquiera de los animales vacunados mientras que todos los ratones control fueran positivos para el virus (tabla ). Esta vacuna también protege a los ratones de las pancreatitis inducidas por virus: ninguno de los animales vacunados tuvieron infiltración por células T en el páncreas mientras que todos los animales control tuvieron una respuesta inflamatoria muy intensa. Estos resultados sugieren que las vacunas de enterovirus no polio inactivadas son efectivas en la protección frente a las infecciones por enterovirus no polio. Esta protección está mediada probablemente por anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacuna. 11

12 Ejemplo 3 Los ratones SJL/J se inmunizaron primero con vacuna de virus de la polio inactivada con formalina (IPV; 0,1 µg/ratón), o con salino (PBS). Después de 14 días los ratones se infectaron con virus coxsackie B3 de forma intramuscular ( 6 TCID 0 /ratón). Se analizó la histopatología del páncreas 14 días después de la infección. Los resultados se muestran en la tabla 6. TABLA 6 Reacción de inflamación (infiltración por células T) del páncreas de ratones SJL/J infectados de forma intramuscular con una cepa pancreatotropa de virus coxsackie B3 (carga Nancy) Nuestras observaciones indican que la IPV incrementa la gravedad de las infecciones por enterovirus no polio. Hemos encontrado que los ratones, que se han inmunizado primero mediante IPV y después se han infectado con un enterovirus no polio, llamado cepa Nancy pancreatotropa de virus coxsackie B3, tuvieron pancreatitis más graves que los ratones que no se habían inmunizado previamente con IPV (tabla 6). Los niveles medios de anticuerpos IgG1 frente a virus coxsackie B3 purificado se determinaron en ratones BALB/c inmunizados con tres inyecciones intramusculares de vacuna de virus de la polio inactivado con formalina (IPV; 0,1 µg por ratón) o de salino tamponado con fosfato (PBS) y se infectaron subsiguientemente con una cepa pancreatotropa de virus coxsackie B3 (cepa Nancy, 6 TCID 0 /ratón). Las inmunizaciones se hicieron con intervalos de dos semanas (la primera a las 8 semanas de edad), los ratones se infectaron 2 semanas después de la última inyección y se midieron los anticuerpos 2 semanas después de la infección. Los niveles de anticuerpos se expresan como valores medios de OD 492 en EIA (tabla 7). La IPV fue la vacuna Novum del virus de la polio disponible comercialmente comprada por el Instituto de Salud Pública Nacional de Holanda. TABLA 7 Efecto de la inmunización con la vacuna de virus de la polio inactivados sobre la respuesta de anticuerpos durante la infección subsiguiente con virus coxsackie B3 0 6 La vacunación IPV se asoció con una respuesta de anticuerpos anormalmente baja durante la infección subsiguiente con virus coxsackie B3 en ratones BALB/c (tabla 7). Esto sugiere que la inmunización con la vacuna de virus de la polio muertos puede debilitar las respuestas de anticuerpos durante las infecciones subsiguientes por enterovirus no polio in vivo. Esto, en cambio, puede incrementar la gravedad de las infecciones por enterovirus no polio. 12

13 2 3 4 Asumimos que el efecto perjudicial de la IPV se debe a su capacidad para inducir respuestas inmunes tipo Th-2. Se ha mostrado previamente que las vacunas inactivadas inducen principalmente respuestas de tipo Th-2 y que este tipo de efecto biológico puede incrementar la gravedad de las infecciones naturales (como en el caso de la vacuna del virus sincitial respiratorio o del sarampión). Este efecto perjudicial se manifiesta particularmente en las infecciones causadas por otros serotipos distintos de los usados en la vacuna mientras que las infecciones por el mismo serotipo que el usado en la vacuna están totalmente protegidas por la vacuna (como se muestra en nuestros experimentos con ratones descritos en la tabla ). Esta protección específica de serotipo se basa en los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacuna. De este modo la vacunación con IPV en la infancia produce respuesta inmune específica del virus de la polio en dirección Th-2, lo que genera memoria de células T en infecciones por enterovirus posteriores. Debido a la reacción cruzada de las células T este efecto biológico Th-2 se extiende a las respuestas inmunes frente a los enterovirus no polio que incrementa de este modo la gravedad de las infecciones por enterovirus no polio y el riesgo de sus complicaciones como la diabetes tipo I. Al contrario del efecto perjudicial de la IPV sobre la protección inmune frente a las infecciones por enterovirus no polio, la OPV tiene un efecto beneficioso. Como es una vacuna viva induce respuestas de células T más intensas que la IPV. Además, esta respuesta inmune es más equilibrada recordando a la observada en las infecciones por enterovirus naturales que incluyen tanto respuestas inmunes de tipo Th-1 como Th-2. Esta respuesta se dirige tanto a las proteínas del virus estructurales como no estructurales, mientras que la IPV induce sólo respuesta frente a las proteínas del virus estructurales. Mediante la inducción de respuestas de células T intensas la OPV activa también las células T de memoria, lo que puede producir reacción cruzada entre los enterovirus polio y no polio y reforzar tanto la respuesta de células T como la de anticuerpos frente a los enterovirus no polio. Mediante este mecanismo, la OPV facilita la eliminación de las infecciones por enterovirus no polio previniendo de este modo sus complicaciones. De este modo, el riesgo de complicaciones de las infecciones por enterovirus no polio (como la diabetes tipo I) se pueden prevenir mediante la OPV. Además de las infecciones por enterovirus no polio naturales, la OPV puede usarse también para convertir respuestas inmunes, que se han inducido mediante vacunas de enterovirus inactivadas o de subunidades de respuestas tipo Th-2 a Th-1. De esta forma La OPV se puede usar para proteger de los efectos secundarios dependientes de Th-2 de las vacunas de enterovirus no polio inactivadas o de subunidades. Este tipo de efectos secundarios se han descrito en el contexto del uso de vacunas inactivadas del virus respiratorio sincitial y el virus del sarampión y incluyen un curso anormal de las infecciones, gravedad incrementada de la infección, riesgo incrementado de complicaciones de la infección y posible desarrollo de alergia y asma. De forma consecuente, la OPV se puede usar para dictar la respuesta inmune inducida mediante vacunas de enterovirus inactivadas o de subunidades a respuestas de tipo Th-1 protegiendo de este modo frente a los efectos secundarios de tales vacunas. Por el contrario, la IPV puede tener un efecto opuesto incrementando el riesgo de complicaciones de las infecciones por enterovirus no polio mediante la dirección de la respuesta inmune hacia Th-2. Una ventaja adicional de la OPV sobre la IPV es que como es un virus vivo induce la producción de interferón alfa. Se induce sólo durante las infecciones por virus y es la citoquina antiviral más potente (parte de la inmunidad innata). Protege específicamente frente a infecciones virales y proporciona protección antes de inducir las respuestas inmunes específicas de antígenos. Debido a que la OPV es de virus vivos induce interferona alfa y su inducción ocurre tanto en las superficies mucosas como de forma sistémica. Los virus de la vacuna se replican en el intestino durante varias semanas, lo que significa que la producción local de interferón alfa persiste durante períodos prolongados en los niños vacunados repetidamente con OPV. Esto aumentará el efecto protector de la OPV frente a las infecciones por enterovirus no polio. Referencias 0 Beck MA, Tracy SM. Evidence for group secific enterovirus antigens recognized by human T-cells. J. Clin. Microbiol. 28: , Classen, BJ. 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14 pregnancy: lack of impact on fetal development and perinatal outcome. Clin Infect Dis 18:414-, Harjulehto-Mervaala T, Aro T, Hiilesmaa VK, Saxen H, Hovi T, Saxen L. Oral polio vaccination during pregnancy: no increase in the occurrence of congenital malformations. Am. J. Epidemiol. 138:7-14, Harris RW, Isacson P, Karzon DT. Vaccine-induced hypersensitivity: reactions to live measles and mumps vaccine in prior recipients of inactivated measles vaccine. J. Pediatr. 74: 2-63, Hiltunen M y col. Immunisation and Type I Diabetes Mellitus. Drug Safety, (3): 7-212,1999. Horie H, Koike S, Kurata T, y col., Transgenic mice carrying human poliovirus receptor: New animal model for study of poliovirus neurovirulence. J. Virol. 68: , Hovi T, Cantell K, Huovilainen A, Kinnunen E, Kuronen T, Lapinleimu K, Poyry T, Roivainen M, Salama N, Stenvik M, y col. Outbreak of paralytic poliomyelitis in Finland: widespread circulation of antigenically altered poliovirus type 3 in a vaccinated population. Lancet 1: , Juhela S, Hyöty H, Lönnrot M, Roivainen M, Simell O Ilonen J. Enterovirus infections and enterovirus specific T-cell responses in infancy. J. Med. Virol. 4: , Kapikian AZ, Mitchel RH, Chanock RM, Shvedoff RA, Stewart CE. An epidemiological study of altered clinical reactivity to respiratory syncytial (RS) virus infection in children previously vaccinated with an inactivated Rs virus vaccine. Am. J. Epidemiol. 89: -421, Véase DM, Tilles JG. Occurrence of coxsackievirus hepatitis in baby rabbits an protection by a formalin-inactivated polyvalent vaccine. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 216:2-6, Véase DM, Tilles JG. Efficacy of a polyvalent inactivated-virus vaccine in protecting mice from infection with clinical strains of group B coxsackievi-ruses. Scand. J. Infect. Dis. 26:739.47,

15 REIVINDICACIONES Uso de la vacuna del virus de la polio oral (OPV) para la fabricación de una vacuna frente a las enfermedades por enterovirus no polio. 2. Uso de acuerdo con la reivindicación para la fabricación de una vacuna frente a la diabetes mellitus tipo 1 (IDDM). 3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de una vacuna que se administre en dosis repetidas a los niños. 4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3 para la fabricación de una vacuna que se administre a la edad de tres meses.. Uso de acuerdo con la reivindicación 4 para la fabricación de una vacuna que se administre a la edad de 0, 6,, y 14 semanas y recuerdos en edades posteriores. 6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de una vacuna que se administre a las mujeres embarazadas para proteger a su descendencia frente a dichas enfermedades. 7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6 para la fabricación de una vacuna que se administre de forma prenatal a la mujer embarazada y de forma postnatal al niño. 8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de una vacuna que se administre en combinación con una vacuna, que induce inmunidad específica de serotipo frente a los enterovirus no polio. 9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 en la que la vacuna que induce dicha inmunidad específica de serotipo es una vacuna de enterovirus muertos o una vacuna de subunidades.. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 en la que la vacuna que induce dicha inmunidad especifica de serotipo es una vacuna que comprende antígenos de enterovirus que representan serotipos de enterovirus diabetogénicos o sus combinaciones. 11. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 en la que la vacuna que induce dicha inmunidad especifica de serotipo es una vacuna frente a uno o más serotipos seleccionados del grupo que consta de virus coxsackie B serotipos 1, 2, 3, 4, y 6, virus echo serotipos 3, 4, 6, 9, 11, 22 y y virus coxsackie A serotipos 9 y Una composición de vacuna que comprende la vacuna del virus de la polio oral (OPV) y una vacuna de enterovirus no polio, que induce inmunidad específica de serotipo frente a enterovirus no polio. 13. La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12 en la que la vacuna que induce dicha inmunidad específica de serotipo es una vacuna de enterovirus no polio muertos o una vacuna de subunidades. 14. La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12 en la que la vacuna que induce dicha inmunidad específica de serotipo comprende antígenos de enterovirus que representan serotipos de enterovirus diabetogénicos o sus combinaciones.. La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 14 en la que la vacuna que induce dicha inmunidad específica de serotipo es una vacuna frente a uno o más serotipos seleccionados del grupo que consta de virus coxsackie B, serotipos 1, 2, 3, 4, y 6, virus echo serotipos 3, 4, 6, 9, 11, 22 y y virus coxsackie A serotipos 9 y Uso de una vacuna, que induce inmunidad específica de serotipo frente a uno o más serotipos de enterovirus no polio diabetogénicos seleccionados del grupo que consta de virus coxsackie B, serotipos 1, 2, 3, 4, y 6, virus echo serotipos 3, 4, 6, 9, 11, 22 y y virus coxsackie A serotipos 9 y 16 para la fabricación de una vacuna frente a la diabetes mellitus tipo I (IDDM). 17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16 para la fabricación de una vacuna que se administre a mujeres embarazadas o niños. 18. Uso de acuerdo con la reivindicación 16 para la fabricación de una vacuna que se administre de forma prenatal a la mujer embarazada y de forma postnatal al niño. 6

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