COCULTIVO CON CÉLULAS DE CÚMULO, MADURACIÓN OVOCITARIA Y CALIDAD EMBRIONARIA. Trabajo de grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por

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1 UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES Coordinación de Biología COCULTIVO CON CÉLULAS DE CÚMULO, MADURACIÓN OVOCITARIA Y CALIDAD EMBRIONARIA. Trabajo de grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por Br. Ana Karina Herrera. Realizado bajo la asesoría del Tutor: René Utrera Co-tutor: Gustavo D Ommar

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3 Sartenejas, Junio 2012 COCULTIVO CON CÉLULAS DE CÚMULO, MADURACIÓN OVOCITARIA Y CALIDAD EMBRIONARIA. Por: Ana Karina Herrera Miralles C.E.N.: La maduración in vitro (IVM) por sus siglas en ingles consiste en la maduración extracorpórea de ovocitos en estadio de vesícula germinal (Majerfeld de Piras Marta, 2008). El presente trabajo tiene como objetivo determinar el efecto de diferentes sistemas de cultivo sobre la maduración in vitro de ovocitos humanos, y sus posibles consecuencias en la calidad embrionaria. El diseño consta de un estudio retrospectivo de 124 pacientes con edad promedio de 33,0 ± 3,9 años, y uno prospectivo de 40 pacientes con edad promedio de 34,0 ± 3,9 años. Encontrando en el estudio retrospectivo una tasa de fertilización de 69,6 % en el grupo control, 68,3 % en ovocitos inmaduros sin denudar y 35,2 % en el grupo de ovocitos inmaduros denudados; en cuanto a la calidad embrionaria se encontró que el 43,7 % del grupo control eran embriones de calidad óptima, el 43,3 % pertenecían a embriones óptimos en el grupo de ovocitos inmaduros sin denudar y solo el 24 % eran óptimos en el grupo de ovocitos inmaduros sin denudar. Y en el prospectivo encontramos una tasa de fertilización de 75 % en el grupo control, 64,2 % en el cultivo 3D, 50 % en el cultivo 2D y solo 11,8 % en el cultivo unidimensional; con respecto a la calidad embrionaria observamos 47,2 % de embriones óptimos en el grupo control, 39,5 % en cultivo 3D y ninguno en los sistemas bi y unidimensional. En conclusión madurar ovocitos con sus células de cúmulo, equipara la tasa de fertilización y la calidad embrionaria a niveles similares a los obtenidos con ovocitos recolectados maduros. 2

4 DEDICATORIA A Dios por escucharme y protegerme en cada segundo de mi día A mi familia por ser incondicionales conmigo, apoyarme en cada momento, ayudarme a seguir adelante y brindarme felicidad. 3

5 Quisiera agradecer a la Universidad Simón Bolívar, a todos mis profesores porque han contribuido en mi formación profesional y personal. Agradecer a mi familia por su apoyo incondicional, por compartir conmigo en los momentos difíciles y en los momentos más alegres. A mis amigos, por acompañarme en este viaje de cinco años de desafíos y logros A mi tutor Gustavo D Ommar por depositar esa confianza en mí, que es la palanca que me impulsa a dar este gran paso. A mi tutor René Utrera por guiarme durante estos cinco años y apoyarme en las decisiones que he tomado. A la Doctora Marta Piras por ofrecerme realizar este proyecto en su laboratorio y haberme acompañado en este viaje. A la Clínica de Fertilidad del Centro Médico Docente La Trinidad por haberme recibido en su laboratorio con tanto aprecio y por su colaboración en el suministro de reactivos. Al Laboratorio de Pruebas Especiales del Centro Médico Docente La Trinidad por su disposición a colaborar en este proyecto y por su colaboración en el suministro de muestras. GRACIAS 4

6 La maduración in vitro como técnica emergente y controversial, se intenta utilizar en reproducción asistida por sus ventajas sobre la tradicional estimulación ovárica controlada. Una de ellas es la reducción de los costos, minimizando el uso de gonadotropinas y análogos de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRh), que a su vez conlleva a una reducción del síndrome de hiperestimulación ovárica, destinada principalmente a pacientes con síndrome de ovario poliquístico, por tener éstas mayor riesgo a hiperestimulación ovárica o a una pobre respuesta. Otra de las ventajas se presenta en pacientes en las que no es recomendable la estimulación hormonal, debido a la presencia de tumores hormonodependientes. Es aceptado que la maduración completa de los ovocitos y la sincronización entre los eventos de reanudación de la meiosis y maduración citoplasmática, son necesarios para el desarrollo de su competencia. Algunas intervenciones en la fase de crecimiento de los ovocitos presenta efectos negativos en la fertilización y subsecuente desarrollo embrionario (Trounson y col, 2001). El ovocito desempeña un rol importante regulando su propio desarrollo por la producción de factores de crecimiento paracrinos, que actúan en las células vecinas de la granulosa y que a su vez contribuyen al desarrollo de su competencia (Gilchrist y col, 2008). Los factores de crecimiento identificados más conocidos pertenecen a la superfamilia del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), siendo el factor de crecimiento de diferenciación-9 (GDF-9) y la proteína morfogenética ósea-15 (BMP-15) los más destacados (Otsuka y col, 2011). El presente trabajo tiene como objetivo determinar el efecto de diferentes sistemas de cultivo sobre la maduración in vitro de ovocitos humanos. Dado que se conoce que existe comunicación molecular y celular, entre el ovocito y las células somáticas que lo rodean, se han creado sistemas de cultivo que cuentan con la participación de células del cúmulo o células epiteliales de las Trompas de Falopio. Estos son denominados sistemas de cocultivo y tienen como objetivo semejar las condiciones in vivo. (Ma y col, 2007). Las intenciones de este estudio son probar que es factible mejorar los resultados obtenidos en las técnicas de maduración in vitro de ovocitos, con el uso de sistemas de maduración mono, bi y tridimensional de cocultivo; y que estos tienen como resultado una mejora en la fertilización y subsecuente desarrollo embrionario. 5

7 I. MARCO TEÓRICO I.1 Introducción a la maduración ovocitaria I.1.1. Desarrollo del gameto femenino I.1.2. Crecimiento y adquisición de competencia meiótica I.1.3. Maduración citoplasmática I.1.4. Regulación de la maduración nuclear del ovocito I.2. Factores secretados por el ovocito I.2.1. Regulación ovocitaria de la función de las células del cúmulo y las células de la granulosa I.2.2. Señalización paracrina del ovocito a. Base molecular b. Base celular I.2.3. Regulación de la calidad ovocitaria por los factores secretados por el ovocito I.3. Conceptos y técnicas para mejorar los resultados de la maduración in vitro I.3.1. Definición de la maduración in vitro de ovocitos I.3.2. Cultivos bidimensionales I.3.3. Cultivos tridimensionales I.4. Fecundación de los ovocitos y desarrollo embrionario I.4.1. Técnicas de reproducción asistida de alta complejidad I.4.2. Desarrollo embrionario II. OBJETIVOS II.1. Generales II.2. Específicos III. METODOLOGÍA III.1. Retrospectivo III.2. Prospectivo III.2.1. Pacientes III.2.2. Estimulación ovárica controlada (EOC) III.2.3. Recuperación de ovocitos III.2.4. Preparación de las cajas de cultivo

8 III.2.5. Denudación de ovocitos III.2.6. Maduración in vitro III Preparación del medio IVM III Cocultivos de ovocitos con CC III Cocultivo con amniocitos III.2.7. Microinyección de ovocitos III.2.8. Calidad embrionaria III.2.9. Determinación de hormonas III Medios de cultivo IV. RESULTADOS IV.1. Retrospectivo IV.2. Prospectivo IV.2.1. Cultivo de cigotos poliploides IV.2.2. Determinación de hormonas V. DISCUSIÓN VI. CONCLUSIONES VII. RECOMENDACIONES VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS IX. ANEXOS IX.1. CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA MADURACION IN VITRO DE OVULOS (IVM) IX.2. Poster presentado en el IV Congreso Nacional de Avemere

9 Figura 1. Etapas del desarrollo folicular Figura 2. Ovogénesis Figura 3. Clasificación de los ovocitos Figura 4. Señalización celular que conduce a la detención meiótica Figura 5. Base molecular de la señalización paracrina entre el ovocito y las CC Figura 6. Regulación de la función de las CC y la calidad del ovocito por los OSFs Figura 7. Diferencia entre los cultivos bidimensionales y tridimensionales Figura 8. Esquema de la fecundación en humanos Figura 9. Imagen de la fertilización del ovocito Figura 10. Procedimiento de ICSI Figura 11. Esquema del desarrollo inicial en mamíferos Figura 12. Cajas de denudación de los ovocitos Figura 13. Caja de microinyección Figura 14. Diagrama esqeumático de la preparación para el ICSI Figura 15. Representación gráfica de la tasa de fertilización, proveniente de ovocitos maduros, inmaduros denudados (D) e inmaduros no denudados (ND) Figura 16. Representación gráfica de la calidad embrionaria obtenida por ICSI, proveniente de ovocitos maduros, inmaduros denudados (D) e inmaduros no denudados (ND) Figura 17. Representación gráfica de la tasa de fertilización, proveniente de ovocitos cultivados en diferentes sistemas de cultivo, unidimensional (1D), bidimensional (2D) y tridimensional (3D), los maduros representan el grupo control Figura 18. Representación gráfica de la tasa de fertilización, proveniente de ovocitos cultivados en sistema tridimensional (3D) con diferentes medio de cultivo IVM y Global (GL), el grupo de los maduros representa el control Figura 19. Representación gráfica de la calidad embrionaria obtenida por ICSI, proveniente de ovocitos cultivados en diferentes sistemas de cultivo, unidimensional (1D), bidimensional (2D) y tridimensional (3D), los maduros representan el grupo control Figura 20. Representación gráfica de la calidad embrionaria, proveniente de ovocitos cultivados en sistema tridimensional (3D) con IVM y Global (GL), el grupo de los maduros representa el control Figura 21. (a) Monocapa de las células de cúmulo en culltivo y (b) Monocapa de amniocitos. 61 Figura 22. (a) Embrión del grupo control, cultivado solo en Global, de calidad no óptima. (b) Embrión cultivado con CC, de calidad óptima (la calidad de imagen se debe a la presencia de la monocapa de CC en el fondo de la placa) Figura 23. Representación gráfica de la determinación de estradiol en el sobrenadante de las monocapas de CC y amniocitos

10 Tabla I. Clasificación de los dos grupos experimentales del estudio retrospectivo Tabla II. Clasificación de los sistemas de maduración de ovocitos en medio de cultivo Tabla III. Clasificación de los sistemas de cocultivo del estudio retrospectivo Tabla IV. Clasificación de la calidad de los embriones según la fragmentación, multinucleación y simetría de las células. Para que sea un embrión clasificado como bueno es necesario que cumpla con todos los puntos de descripción Tabla V. Tiempo de observación de ovocitos fertilizados y embriones, y el estado de división esperado para cada momento Tabla VI. Análisis estadístico que representa la asociación entre ovocitos maduros e inmaduros denudados y sin denudar, con respecto a la tasa de fertilización y la calidad embrionaria Tabla VII. Análisis estadístico que representa la asociación entre ovocitos de diferentes sistemas de cultivo, unidimensionales (1D), bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D), los maduros representan el grupo control, con respecto a la tasa de fertilización y calidad embrionaria Tabla VIII. Análisis estadístico que representa la asociación entre ovocitos de sistemas tridimensionales (3D) en diferentes medio de cultivo IVM y Global (GL), los maduros representan el grupo control, con respecto a la tasa de fertilización y calidad embrionaria Tabla IX. Representación de los valores de la calidad embrionaria observada en embriones obtenidos de cigotos con fertilización anormal cultivados en sistemas de cocultivo con diferentes tipos de células, amniocitos y células del cúmulo (CC). Los maduros representan el grupo control Tabla X. Representación de los valores de la determinación de hormonas de estradiol y progesterona, de las CC en los días 2, 3, 4 y 5 de cultivo. El blanco corresponde al medio de cultivo Global. Todos los valores están representados en pg/ml

11 AC: Adenil ciclasa ADN: Ácido desoxirribonucleico ALK: Receptor activina tipo quinasa AMPc: Adenosín monofosfato cíclico ARN: Ácido ribonucleico BMP: Proteína morfogenética ósea BMPRII: Receptor tipo II de la proteína morfogenética ósea CC: Células de cúmulo CG: Células de la granulosa COC: Complejo cúmulo-ovocito CSF: Factor citostático EGF: Factor de crecimiento epidérmico EOC: Estimulación ovárica controlada FIV: Fertilización in vitro FSH: Hormona folículo estimulante GC: Gránulos corticales GDF: Factor de crecimiento de diferenciación GnRh: Hormona liberadora de gonadotropinas GPR: Receptor ligado a una proteína G HCG: Gonadotropina coriónica humana HRP: Peroxidasa de rábano Hysa: Hialuronidasa ICSI: Inyección intracitoplasmática de espermatozoides IVM: Maduración in vitro LH: Hormona luteinizante 10

12 MI: Metafase I MII: Metafase II MAPK: Proteínas quinasas activadas por mitógenos MCG: Células de la granulosa mural MPF: Factor promotor de la meiosis OSFs: Factores secretados por el ovocito PDE3A: Fosfodiesterasa 3 A PKA: Proteína quinasa A PN: Pronúcleo PVP: Polivinilpirrolidona TGF: Factor de crecimiento transformante TRA: Tratamientos de reproducción asistida VG: Vesícula germinal ZP: Zona pelúcida 11

13 I. MARCO TEÓRICO. I.1 Introducción a la maduración ovocitaria. La maduración ovocitaria comprende por una parte, la maduración nuclear (donde ocurre la reanudación de la meiosis y el progreso de la ruptura de la vesícula germinal a metafase II) (Lin y Hwang, 2006), y por otra la maduración citoplasmática (donde ocurren cambios bioquímicos en el citoplasma del ovocito). La sincronización de estos procesos asegura una normal fertilización y desarrollo embrionario. (Liu y col, 2010). I.1.1. Desarrollo del gameto femenino. La ovogénesis abarca procesos de diferenciación, crecimiento y maduración del gameto, durante el cual se prepara al ovocito para la fertilización y subsecuente desarrollo embrionario. En el inicio del desarrollo embrionario aparecen las células germinales primordiales. Estas células migran hacia las gónadas y se convierten en ovogonias. Las ovogonias experimentan sucesivas mitosis y luego dan lugar a la primera división meiótica que es detenida en el estadio de profase (profase I); de esta manera las ovogonias se diferencian a ovocitos primarios. Estos se encuentran rodeados por una capa de células foliculares planas que provienen de la superficie del ovario. Al conjunto compuesto por el ovocito primario y estas células epiteliales se le denomina folículo primordial (Gilbert, 2005). El ovocito va aumentando su tamaño y las células foliculares planas adoptan una forma cúbica que se diferencian a células de la granulosa. El conjunto de ovocito primario y células de la granulosa comprende el folículo primario (Palma, 2001). Este continua creciendo y aparecen espacios entre las células de la granulosa que van a ser ocupados por el líquido folicular, formando de esta manera el antro folicular que corresponde al folículo 12

14 secundario. Este aumenta consideradamente en volumen y cuando alcanza la madurez es denominado del folículo terciario o de Graaf (Palma, 2001). (Figura 1). Figura 1. Etapas del desarrollo folicular. El folículo primordial se encuentra compuesto por el ovocito primario y las células foliculares aplanadas. Las células foliculares adoptan forman cúbica y se diferencian en células de la granulosa, estas células junto con el ovocito producen la ZP y formando el folículo primario. El ovocito experimenta una fase de crecimiento, donde aparecen espacios que se llenan con el líquido folicular y se forma el antro folicular que corresponde al folículo secundario. El folículo secundario aumenta su tamaño para formar el folículo terciario, cuando el folículo ha madurado y está preparado para ser expulsado hablamos de folículo de Graaf. (Tomado de Lerner y Urbina, 2008). La maduración nuclear ocurre en los folículos preovulatorios después del pico de la hormona luteinizante (LH). La presencia de las células somáticas en la pared folicular es necesaria para la comunicación con el ovocito y para la respuesta a las gonadatropinas. (Febres y col, 2008). En cada ciclo ovárico comienzan a desarrollarse varios folículos, en donde por lo general solo uno alcanza la madurez, los demás se degeneran. Cuando el folículo ha madurado, el ovocito primario es capaz de reanudar la primera división meiótica 13

15 (que se encuentra detenida en el estadio de profase) y forma dos células hijas (cada una con la mitad del número inicial de cromosomas), el citoplasma se divide asimétricamente, dando lugar al primer cuerpo polar (que posee muy poco citoplasma) y al ovocito secundario que recibe casi todo el citoplasma. Los ovocitos secundarios permanecen en metafase de la segunda división meiótica (metafase II) y esta división se reanuda solo si el ovocito es fecundado (Palma, 2001). Cuando el ovocito secundario se encuentra preparado para ser expulsado está rodeado de células de la granulosa que forman el cúmulo oóforo y de una capa de células más interna que constituye la corona radiada (Matorras y Hernández, 2007). (Figura 2). Figura 2. Ovogénesis. Durante la etapa embrionaria las células germinales se dividen por sucesivas mitosis para generar millones de ovogonias con dotación genética diploide. Las ovogonias dan origen al ovocito primario, estos comienzan a dividirse por meiosis I, pero al llegar a la fase profase se detiene la primera división meiótica. Al alcanzar la pubertad el ovocito primario aumenta de tamaño y poco antes de la ovulación finaliza la primera meiosis, dando origen al ovocito secundario haploide que obtiene la mitad de la carga genética y casi todo el contenido citoplasmático y el primer cuerpo polar con la otra mitad de la carga genética y poco contenido citoplasmático. Cuando ocurre la fecundación activa el ovocito que se encontraba detenido en la metafase de la segunda división meiótica y expulsa el segundo cuerpo polar, que contiene el complemento de los cromosomas del ovocito; y debería convertirse en cigoto diploide. (Tomado de 14

16 La valoración de la maduración del ovocito se basa en el grado de expansión de las células del cúmulo y en la morfología del ovocito. Las características del ovocito en profase I corresponden a un ovocito inmaduro diploide, no posee cuerpo polar, presenta vesícula germinal (VG) y las células del cúmulo (CC) y corona están compactas. Las características de un ovocito en metafase I (MI): ovocito inmaduro, diploide, no tiene cuerpo polar ni vesícula germinal, y las células de cúmulo y corona están un poco expandidas. Y las características de un ovocito en metafase II (MII): ovocito maduro, haploide, con cuerpo polar, y las células de cúmulo y la corona radiada expandidas. (Matorras y Hernández, 2007). (Figura 3). La valoración de la calidad del ovocito está basada en su morfología. Un ovocito morfológicamente normal y de buena calidad, presenta una zona pelúcida bien definida y proporcionada, un espacio perivitelino en el que cabe el cuerpo polar, un cuerpo polar único de forma esférica y un citoplasma homogéneo. (Matorras y Hernández, 2007). 15

17 Figura 3. Clasificación de los ovocitos. (a) Ovocito en Profase I que presenta VG, no ha reiniciado su primera división meiótica. (b) Ovocitos en MI, en los cuales la meiosis se ha re-iniciado pero no ha alcanzado aún la extrusión del primer cuerpo polar. (c) Ovocitos en MII, corresponde a ovocitos maduros se caracterizan por presentar un cuerpo polar localizado en el espacio perivitelino (EPV). (Tomado de Red Latinoamericana de Reproducción Asistida, 2006). I.1.2. Crecimiento y adquisición de competencia meiótica. Durante la fase de crecimiento los ovocitos permanecen en la profase I, pero se observa un incremento en la actividad metabólica, experimentan alteración en el comportamiento celular y un notable aumento de su volumen. (Vanhoutte, 2009). Durante este período ocurre la síntesis y el almacenamiento de muchas macromoléculas como ARN mensajero (ARNm) y proteínas esenciales para completar la maduración y promover el desarrollo del embrión (Trounson y col, 2001). También se observa la reorganización de organelos, entre ellos el re arreglo del retículo endoplasmático rugoso y el aparato de Golgi que se encuentran involucrados en la secreción de algunas proteínas, y la síntesis y 16

18 empaquetamiento de gránulos corticales. Además ocurre un aumento en la división mitocondrial preparando al ovocito para la intensa actividad metabólica a la que es sometido antes, durante y después de la fertilización. La comunicación entre el ovocito y las células somáticas que lo rodean (como de la granulosa y células de la teca), apoya al ovocito durante este período de crecimiento proporcionándole nutrientes esenciales, precursores metabólicos, factores de crecimiento y hormonas. (Vanhoutte, 2009). Al final de la fase de crecimiento ocurre la adquisición de la competencia meiótica, esto es cuando el ovocito adquiere la capacidad para reanudar la meiosis en diferentes pasos. En primer lugar el ovocito tiene la habilidad para llevar a cabo la ruptura de la vesícula germinal, luego progresa a la primera división meiótica y se detiene en la metafase de la segunda meiosis (metafase II). La evidencia que indica que el ovocito ha adquirido la competencia meiótica es la extrusión del primer cuerpo polar. Cuando se logra la adquisición de la competencia meiótica el ovocito ha alcanzado un nivel adecuado de proteínas que promueven la maduración. (Vanhoutte, 2009). Sin embargo, la adquisición de la competencia meiótica no implica que el ovocito ha adquirido la competencia para el desarrollo, es necesario que ocurra la maduración citoplasmática. (Vanhoutte, 2009). I.1.3. Maduración citoplasmática. La maduración citoplasmática es el proceso donde ocurren cambios en el gameto femenino, que genera una célula con la capacidad para mantener eventos como la fertilización y las primeras etapas del desarrollo embrionario. (Vanhoutte, 2009). El proceso de maduración citoplasmática es importante, ya que los ovocitos con maduración citoplasmática insuficiente no son capaces de promover la formación del pronúcleo 17

19 masculino, y se incrementan las anomalías cromosómicas luego de la fertilización. (Cha y Chian, 1998). Durante la maduración citoplasmática ocurren cambios en la relocalización de algunos organelos, entre ellos tenemos la disposición periférica de los gránulos corticales (en una posición justo por debajo de la membrana plasmática); (Vanhoutte, 2009). La redistribución de las mitocondrias en la región periférica al citoplasma interno, una falla en esta redistribución produce una incompleta maduración citoplasmática y una reducción en el desarrollo de competencia. (Liu y col, 2010). Debido a la importante función del Ca +2 durante la fertilización, el desarrollo de un sistema de señalización sensible a Ca +2 es considerado un elemento fundamental en la adquisición de desarrollo de competencia durante la maduración citoplasmática de los ovocitos (Herbert y col, 1997). Con la liberación de Ca +2 que se encuentra almacenado en el retículo endoplasmático rugoso aumenta la concentración de Ca +2 que se encuentra libre en el citosol del ovocito (Cha y Chian, 1998). Los eventos de maduración citoplasmática ocurren mientras el ovocito espera por las señales de ovulación dentro del folículo preovulatorio, y del ovario, es solo durante esta fase de desarrollo que el ovocito puede alcanzar su completa capacidad de desarrollo. (Vanhoutte, 2009). I.1.4. Regulación de la maduración nuclear del ovocito. La detención meiótica se encuentra regulada por variaciones en los niveles de adenosin monofosfato cíclico (AMPc) dentro del ovocito. Altos niveles de AMPc previenen la maduración nuclear, debido a que promueven la fosforilación del complejo proteico p34 cdc2 quinasa/ciclina B, también conocido como factor promotor de la mitosis o la 18

20 meiosis (MPF), haciéndolo inactivo. Por lo tanto bajos niveles de AMPc conduce a la desfosforilación del complejo MPF activándolo y así el ovocito puede volver a entrar en meiosis. Entre las principales proteínas por las cuales la AMPc es capaz de activar o inactivar a MPF se encuentra la proteína quinasa A (PKA), que regula la actividad de la fosfatasa CDC25 y la quinasa WEE1/MYT1. La proteína CDC25 desfosforila a MPF, mientras que WEE1/MYT1 la fosforila (Figura 4). El ovocito es capaz de producir su propio AMPc a través de un receptor ligado a una proteína G, GPR3 que se encuentra en la membrana plasmática del ovocito y promueve la acción de una adenilil ciclasa (AC). Actualmente no se conoce si la actividad constitutiva de GPR3 es suficiente para producir las cantidades necesarias de AMPc que mantienen la detención meiótica, o si las células foliculares que rodean el ovocito estimulan la síntesis de AMPc dentro de la célula produciendo el ligando que aumenta la actividad de GPR3. Otra propuesta es que los altos niveles intracelulares de AMPc se puedan lograr por la producción de hipoxantinas y otras purinas, gracias a las células somáticas, y que por una vía paracrina sean capaces de bloquear la acción de la fosfodiesterasa 3A (PDE3A), (enzima involucrada en el control de los niveles de AMPc en el ovocito). (Vanhoutte, 2009). 19

21 PDE3A Figura 4. Señalización celular que conduce a la detención meiótica. GPR3 activado constitutivamente o por un ligando desconocido de las células foliculares (?), activa una proteína G, que estimula la acción de AC y causa una elevación en AMPc. AMPc activa a PKA, que causa la regulación del complejo P34/ciclina B cuando lo fosforila (P) y por lo tanto inactiva. PKA fosforila la fosfatasa CDC25 (CDC25-P) inactivándola. PKA estimula la acción de la quinasa WEE1/MYTI que fosforila a P34 para mantenerlo inactivo y prevenir la reanudación meiótica. La actividad de PDE3A se mantiene a bajos niveles en los ovocitos inmaduros para prevenir la ruptura de AMPc y mantener altos niveles de AMPc. (Tomado de Vanhoutte, 2009). La LH produce cambios en la señalización molecular que ocurre dentro del ovocito y que promueve la reanudación de la meiosis. Este proceso se puede lograr por la eliminación de las sustancias que detienen la maduración o puede proveer al ovocito de sustancias que promuevan la maduración. Una de las hipótesis propuestas es que la hormona LH conduce a la activación de PDE3A del ovocito y por tanto a la hidrólisis de AMPc. (Vanhoutte, 2009). El ovocito y las células foliculares se encuentran comunicados por una red de uniones tipo gap junctions, que permiten la transferencia de pequeñas moléculas como nutrientes y moléculas mensajeras en ambas direcciones entre las células somáticas y el ovocito. Esta comunicación se encuentra implicada en el control de la detención meiótica y la maduración de los ovocitos. Durante la ovulación inducida por el pico LH el número de 20

22 gap junctions disminuye, al mismo tiempo que ocurre la reanudación meiótica. Por otra parte la hormona LH y la hormona folículo estimulante (FSH) activan los receptores de membrana que producen AMPc a través de la adenilil ciclasa. (Luciano y col, 2004). Las moléculas de AMPc son reguladores clave en la reanudación de la meiosis; estas tienen efectos inhibitorios y estimulatorios, ya que un aumento de los niveles de AMPc foliculares inducidos por LH produce la maduración meiótica, mientras que un aumento en los niveles de AMPc del ovocito mantiene la detención meiótica. (Vanhoutte, 2009). En la progresión del ciclo celular meiótico la proteína MPF es la principal molécula involucrada. Se encuentra regulada por la fosforilación y desfosforilación de P34 cdc2. Su activación involucra la asociación entre ciclina B y P34 cdc2 y la desfosforilación de P34 cdc2 en los residuos tirosina 15 y treonina 14 (Trounson y col, 2001). La detención meiótica esta explicada en términos de activación e inactivación de las proteínas que controlan el ciclo celular como P34 cdc2. Los ovocitos necesitan la activación de P34 cdc2 para entrar en la metafase meiótica y la inactivación de P34 cdc2 para continuar a través de la anafase, al próximo ciclo celular (Cha y Chian, 1998). Por lo tanto cuando el ovocito alcanza la metafase II la actividad de MPF se mantiene a altos niveles por la interacción con el factor citostático (CSF) (Trounson y col, 2001). El gen c-mos juega un rol importante en la regulación de la actividad de MPF; éste codifica para una proteína quinasa serina/treonina llamada Mos expresada en los ovocitos (Trounson y col, 2001). Esta proteína mejora la actividad de la proteína MPF, por la fosforilación de su subunidad ciclina B o indirectamente por la acción de una proteína quinasa MAP (MAPK). Mos inhibe la degradación proteolítica de la ciclina B entre la meiosis I y II, manteniendo altos niveles de la actividad de MPF. Mos actúa de manera 21

23 similar que CSF detiene la meiosis en metafase con una alta actividad de P34 cdc2. (Cha y Chian, 1998). La proteína MAP quinasa (MAPK) es una proteína quinasa serina/treonina activada por la proteína Mos por la fosforilación de una tirosina, MAPK regula la meiosis y tiene actividad CSF (Cha y Chian, 1998). Las MAPK tienen su propia actividad citostática, tienen como función estabilizar la proteína MPF y mantener los cromosomas condensados. MAPK mantiene la molécula MPF estabilizada por dos mecanismos; uno de ellos es la inactivación de la quinasa MYT1 encargada de la fosforilación de MPF y el segundo mecanismo impide el paso de las moléculas P34 cdc2 /ciclina B al ciclosoma (aparato de degradación proteica) (Palma, 2001). Otros autores revelan que la activación de la proteína MAPK es necesaria para prevenir que ocurra una fase de síntesis de ADN entre la meiosis I y la meiosis II (Pagés y Aller, 2006). I.2. Factores secretados por el ovocito. La coordinación entre los procesos de proliferación de células somáticas, y el crecimiento y maduración del ovocito, es importante en el desarrollo del folículo ovárico (Thomas y Vanderhyden, 2006). Durante el curso de la foliculogénesis, al final de la fase de crecimiento ovocitario, las células de la granulosa (CG) se dividen en dos linajes que se diferencian anatómica y funcionalmente: células de la granulosa mural (MGC) aquellas que forman la pared del folículo y células del cúmulo (CC). Estas se encuentran en íntimo contacto metabólico con el ovocito, a través de proyecciones citoplasmáticas trans-zonales que forman gap junctions conformando el complejo cumulo-ovocito (Gilchrist y col, 2008). Las interacciones paracrinas entre el ovocito y las células somáticas que lo rodean, forman parte de un punto crítico en la correcta coordinación del desarrollo de los folículos 22

24 promoviendo funciones celulares (Thomas y Vanderhyden, 2006). El ovocito tiene la capacidad de regular la función celular folicular, la ovogénesis y la fecundidad secretando factores de crecimiento solubles (OSFs). Estos actúan en células foliculares vecinas para regular un amplio rango de funciones de células de la granulosa y del cúmulo. Recientes estudios demuestran que dos miembros de la familia del factor de crecimiento transformante-β (TGF-β), el factor de crecimiento de diferenciación-9 (GDF-9) y la proteína morfogenética ósea-15 (BMP-15), son requeridos en las primeras etapas de la foliculogénesis y son reguladores centrales en las funciones de CG y las CC. (Gilchrist y col, 2008). Varios factores endocrinos también están involucrados en el proceso de crecimiento folicular ovárico y maduración ovocitaria, los principales son las gonadotropinas como, la FSH y LH. La hormona LH produce proteínas responsables en la producción de andrógenos en las células de la teca y la diferenciación final de las CG. Además de estas funciones, el pico LH que ocurre durante la ovulación produce la reanudación de las meiosis, luteinización de las CG, la expansión de las CC y la ruptura de la pared folicular. Autores han propuesto que la acción de la hormona LH durante la ovulación es mediada por la acción de factores paracrinos que pertenecen a la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). La función de la hormona FSH es esencial para la esteroidogénesis; estimula la actividad enzimática aromatasa para la diferenciación de las CG induciendo la expresión de receptores de LH, y regula la interacción trans-zonal entre CG y el ovocito. También interactúa con algunos factores de crecimiento que inducen el crecimiento folicular como el ligando kit (KL), EGF, BMP-15, activina A, inhibina o factor de crecimiento parecido a la insulina (IGF-1). La presencia de gonadotropinas produce la 23

25 expresión o inhibición de proteínas que inducen apoptosis por acción de las CG. (Demeestere y col, 2005). I.2.1. Regulación ovocitaria de la función de las células del cúmulo y las células de la granulosa. Experimentos realizados con los OSFs proporcionan información sobre la comunicación entre las células somáticas y el ovocito, y los aspectos relacionados en la regulación de las funciones de CG y CC. Se ha concluido de estos experimentos, que la regulación de la foliculogénesis por parte del ovocito ocurre por la modulación de algunas funciones de las células de cúmulo y de la granulosa, asociadas con su crecimiento y diferenciación a través de la secreción de OSF (Gilchrist y col, 2008). Algunas de las funciones de CC y CG reguladas por los OSF son: 1.- La modulación de Kit ligand que se encuentra relacionado con la estimulación del crecimiento ovocitario (Thomas y Vanderhyden, 2006). 2.- Regulación de la proliferación celular de las MGC y las CC (Otsuka y col, 2011). 3.- Inducción de apoptosis de las CC (Otsuka y col, 2011). 4.- La expansión de las CC a través del factor BMP-15, potenciando la expresión de factores de crecimiento parecidos a EGF (Otsuka y col, 2011). 5.- La biosíntesis de algunas moléculas necesarias para el desarrollo del ovocito (Otsuka y col, 2011) y por último, 6.- la prevención de la luteinización (Gilchrist y col, 2008). I.2.2. Señalización paracrina del ovocito. El ovocito es capaz de controlar el desarrollo de las células somáticas que lo rodean y de esta manera puede regular activamente su propio microambiente. El control que tiene el ovocito sobre las funciones de CG, CC y la foliculogénesis es importante porque altera la expresión de factores paracrinos conocidos secretados por el ovocito (Gilchrist y col, 2008). 24

26 a. Base molecular. La base molecular de la comunicación paracrina entre el ovocito y las células somáticas CC y CG sigue siendo investigada, algunos de los OSFs han sido identificado y algunas de sus vías de señalización en CG y CC han sido caracterizadas. Hoy en día los investigadores se han enfocado en los OSF que pertenecen a la familia de TGFβ, entre ellos GDF-9, BMP-15 y BMP-6 (Gilchrist y col, 2008). La vía de señalización paracrina que actúa en la comunicación entre el ovocito y las células somáticas que lo rodean involucra la acción de los factores de crecimiento de la superfamilia TGFβ secretados por el ovocito. Estos se unen a dos tipos de receptores: el receptor tipo II y el receptor tipo I que se refiere a un receptor de activina tipo quinasa (ALK). El receptor conduce la fosforilación de ALK. Seguido por la fosforilación de una proteína intracelular que transduce señales y es regulado por un receptor llamado SMAD. La inducción de un ligando para la transcripción genética se encuentra mediada por el complejo SMAD, regulado por un receptor y un co- SMAD independiente de receptor, como es el SMAD4. La señalización intracelular de los factores de crecimiento pertenecientes a TGFβ se encuentra dividida en dos grupos; la vía de señalización TGFβ/activina y la vía BMP. Los factores BMP-15 y BMP-6 utilizan la vía clásica BMP para señales en las CG, donde se unen al receptor BMP tipo II (BMPRII) y a ALK6, activando la vía intracelular de las moléculas SMAD1, SMAD5 y/o SMAD 8. A diferencia de estos factores, GDF-9 utiliza el otro sistema de señalización, donde este factor se une a BMPRII pero utiliza el receptor TGFβ tipo I, ALK5 permitiendo la activación de los transductores de señales SMAD2 y SMAD3 (Figura 5). (Gilchrist y col, 2008). Una vez activada la molécula SMAD dependiente de receptor interactúa con la SMAD4 independiente de receptor. Este complejo luego se transloca al núcleo para interactuar con 25

27 los factores de transcripción específicos que regulan la expresión de los genes objetivos (Thomas y Vanderhyden, 2006). Otsuka y colaboradores postulan que el ovocito secreta otra molécula que pertenece al factor de crecimiento fibroblástico (FGF) en particular el FGF-8, que interactúa con el factor BMP-15 para promover la glicolisis en las CC. (Otsuka y col, 2011). Figura 5. Base molecular de la señalización paracrina entre el ovocito y las CC. La señalización de la superfamilia TGFβ es esencial para esta comunicación. Los OSFs claves son GDF-9, BMP-15 y BMP-6. Las CC y CG expresan un gran complemento de receptores para la familia TGFβ, co-receptores y SMAD. BMPRII es el receptor tipo II utilizado por los tres ligandos OSF. GDF-9 se une a BMPRII/AlK5 produciendo la activación de AlK5 que fosforila a SMAD2/3. SMAD2/3 se asocia con SMAD4 luego este complejo es translocado al núcleo que interactúa con específicas secuencias de ADN y reguladores transcripcionales, permitiendo la expresión de genes objetivos. BMP-15 y BMP-6 también se unen a BMPRII, la activación de AlK6 lleva a la señalización por la vía BMP mediada por la activación de SMAD1/5/8. (Tomado de Gilchrist y col, 2008). b. Base celular. Se han mencionado previamente las vías paracrinas por las cuales los OSFs ejercen su acción en las células somáticas que rodean el ovocito. Actualmente la integración de un mecanismo fisiológico coherente del conocimiento de los OSF y las funciones que emplean 26

28 en la foliculogénesis, funciones de las CC, desarrollo embrionario, ovocitario y la fecundidad; presentan un reto a los investigadores de esta área (Gilchrist y col, 2008). Durante el curso de la ovogénesis la transferencia de pequeñas moléculas entre células somáticas, CC y CG; y entre el ovocito y las CC, se puede llevar a cabo por las gap junctions. A través de estas uniones los ovocitos se mantienen unidos física y metabólicamente a las células somáticas. Sin embargo la comunicación entre el ovocito y las CC por medio de las gap junction es más compleja de lo que parece, debido a que el ovocito y las CC se encuentran separados por una considerable distancia proporcionada por la zona pelúcida que rodea al ovocito. Para superar esta distancia y permitir la comunicación por gap junctions, las CC desarrollan proyecciones citoplasmáticas transzonales especializadas, que penetran a través de la ZP y la membrana del ovocito, al final de las proyecciones son capaces de formar gap junctions (Gilchrist y col, 2008). La comunicación entre estos dos tipos de células durante los estadios antral y preantral es necesaria para poder alcanzar el desarrollo de competencia del ovocito (Thomas y Vanderhyden, 2006). La interacción entre los OSF y las señales foliculares maternas no ha sido muy bien caracterizada. Sin embargo existen ocasiones donde se observa la cooperación entre los OSF y las señales maternas para regular las funciones de las células somáticas CC y CG; como la expansión de las CC, donde la acción de OSF activa las señales generadas por las moléculas SMAD de las CC y a su vez es necesaria la acción de la hormona FSH que induce la activación de MAPK (Gilchrist y col, 2008). 27

29 I.2.3. Regulación de la calidad ovocitaria por los factores secretados por el ovocito. Las CC son indispensables para el correcto desarrollo de los ovocitos dentro del folículo y para que este sea capaz de adquirir desarrollo de competencia, además se ha visto que presentan beneficios durante el proceso de la ovulación. Algunos estudios evidencian que la secreción de estos factores de crecimiento por los ovocitos y la apropiada regulación de las funciones de las CC, son esenciales para que el ovocito sea capaz de llevar a cabo su futuro desarrollo (Figura 6). Se ha observado que la suplementación con OSF durante la maduración del ovocito tiene un profundo efecto en la programación de su desarrollo y que este efecto persiste a través del desarrollo preimplantación y desarrollo fetal. Por tanto, la capacidad que tiene un ovocito para regular su propio microambiente por medio de los OSF, presenta un importante componente de la maduración citoplasmática del ovocito o en la adquisición de competencia. (Gilchrist y col, 2008). Figura 6. Regulación de la función de las CC y la calidad del ovocito por los OSFs. El ovocito y las CC regulan las funciones entre ellas por comunicación paracrina y por medio de gap junctions. El ovocito secreta factores de crecimiento solubles, GDF-9 y BMP-15, que permiten la activación de la señalización de SMAD y MAPK en las CC, que regula la expresión de varios genes y algunas funciones claves de CC. Apropiada función de CC y mantenimiento del microambiente del complejo cúmulo-ovocito (COC) depende de OSF. En conjunto con algunas señales maternas como FSH y EGF, las CC pasan factores de crecimiento regulatorios 28

30 de vuelta al ovocito vía paracrina y de gap junctions. Esta comunicación bidireccional entre el ovocito y las CC parece regular procesos desconocidos en el ovocito que mejoran su calidad, mejorando el desarrollo potencial. (Tomado del Gilchrist y col, 2008). I.3. Conceptos y técnicas para mejorar los resultados de la maduración in vitro. La maduración in vitro es una técnica cuya base consiste en la maduración extracorpórea de ovocitos que se encuentran en VG o MI (Majerfeld de Piras, 2008). Para mejorar la eficiencia de esta técnica, es fundamental entender cuáles son los mecanismos que constituyen el desarrollo de competencia de los ovocitos. Estos nuevos conocimientos se traducen a progresivas adaptaciones en técnicas de cultivo para IVM. Esta sección se enfoca en dos principales técnicas de IVM, cultivos bidimensionales y cultivos tridimensionales, que tienen como objetivo restablecer el microambiente del complejo cúmulo-ovocito (COC). (Vanhoutte, 2009). I.3.1. Definición de la maduración in vitro de ovocitos. La aplicación de la técnica de maduración in vitro en ovocitos humanos para tratamientos de reproducción asistida ha llamado la atención debido a la posibilidad de aspirar y madurar ovocitos en cualquier momento del ciclo menstrual (Majerfeld de Piras, 2008). Esta técnica ofrece varias ventajas como: la disminución de costos, protocolos de estimulación más cortos y reduce el riesgo de síndrome de ovario poliquístico (Lin y Hwang, 2006). Las técnicas de reproducción asistida moderna utilizan estimulación ovárica para aumentar el número de ovocitos disponibles; estas estimulaciones ováricas están asociadas a efectos secundarios como el síndrome de hiperestimulación ovárica y este a su vez puede 29

31 llevar a otras complicaciones como disfunción hepática y tromboembolismo. (Vanhoutte, 2009). Las principales candidatas para la aplicación de esta técnica son aquellas mujeres con ovarios poliquísticos (PCO) o con síndrome de ovarios poliquísticos (PCOS). Otras pacientes candidatas son aquellas que presentan alta respuesta a la estimulación hormonal y corren riesgo de síndrome de hiperestimulación ovárica (OHSS), o al contrario mujeres con baja respuesta a la estimulación ovárica. Como se menciono anteriormente esta técnica es muy exitosa evitando la exposición de las pacientes a elevadas dosis hormonales, sin embargo las tasas de implantación son menores en ciclos de IVM, por lo que se han desarrollado nuevas técnicas de cultivo que permiten incrementar los resultados obtenidos. (Vanhoutte 2009). I.3.2. Cultivos bidimensionales. El desarrollo de un folículo ovárico competente in vivo, se basa en un complejo proceso que requiere de la comunicación celular y molecular entre el ovocito y el ambiente que lo rodea (Johnson y col 2008). Se conoce que las condiciones de cultivo cuando se realizan técnicas de maduración in vitro, tienen una influencia significativa en la tasa de maduración y el subsecuente desarrollo embrionario (Johnson y col 2008). Es desventajoso la eliminación de las CC de los ovocitos antes de la IVM (Ge y col, 2008). Los sistemas de cocultivo se usan en técnicas de reproducción por los factores embriotróficos secretados, y tienen como objetivo mejorar el desarrollo embrionario y aumentar la tasa de embarazos clínicos en pacientes infértiles (Lee y col 2008). 30

32 Se han observado resultados favorables en el desarrollo de blastocitos equinos cuando los embriones son expuestos a un sistema de cocultivo con células amnióticas. Las monocapas con células epiteliales amnióticas promueven un microambiente necesario para la activación celular y la proliferación de los embriones en crecimiento (Lange-Consiglio y col, 2010). Se ha propuesto que estas células pueden tener efectos beneficiosos debido a que secretan factores que favorecen los embriones y que pueden contribuir en la madurez de los ovocitos y por esta razón es uno de los objetivos de estudio de este trabajo. Es necesaria la presencia de las CC rodeando los ovocitos para lograr una maduración citoplasmática normal, ya que estas tienen una función importante en la regulación del metabolismo como el uso de fuente de energía, por esta razón este tipo de células son usadas en cocultivo de IVM (Johnson y col 2008). En un estudio realizado por Ge y colaboradores (2008) concluyeron que los ovocitos cultivados con CC, exhiben un desarrollo similar al que presentan los ovocitos madurados in vivo con respecto a: tiempo de maduración, ensamblaje del huso, redistribución de los gránulos corticales (GC) y la redistribución de las mitocondrias. Por otra parte, Johnson y colaboradores (2008) reportaron que ovocitos VG, madurados en cocultivo con CC presentaban mayor tasa de maduración en comparación con aquellos madurados solo en medio; sin embargo, ambas tasas de maduración eran bajas, lo que proporciona pocos beneficios en la subsecuente fertilización. I.3.3. Cultivos tridimensionales. El principal desafío en el desarrollo de técnicas de maduración in vitro es crear un ambiente similar al de maduración in vivo, que sean capaces de mantener el desarrollo ovocitario (Vanhoutte y col, 2009). In vitro los ovocitos reanudan meiosis prematuramente, 31

33 sin que ocurra la adecuada maduración citoplasmática, esta prematura reanudación parece ser inducida por la interrupción en la comunicación bidireccional del ovocito con su microambiente. (Ma y col, 2007). Múltiples funciones celulares se ven influenciadas por la matriz extracelular (ECM), incluyendo migración, proliferación, morfogénesis, metabolismo, comunicación y la respuesta a estímulos externos. Resultados han demostrado que los ambientes tridimensionales en comparación con los ambientes bidimensionales, muestran un perfil de expresión genética y un comportamiento celular similar a los tejidos in vivo (Ma y col 2007). El objetivo de los cultivos tridimensionales es desarrollar un sistema de cocultivo, donde se pueda ver favorecida la función y el desarrollo tanto de los ovocitos, como de las CC (Figura 7) (Combelles y col, 2005). Los resultados de estos estudios indican que los ovocitos denudados y cultivados en un sistema tridimensional de cocultivo con CC, presentan características morfológicas similares a la de los ovocitos madurados in vivo; tomando en cuenta: el patrón de distribución de los GC, un nivel normal de MPF y nivel de endurecimiento de la ZP. (Ma y col, 2007). 32

34 Figura 7. Diferencia entre los cultivos bidimensionales y tridimensionales. Diferencia correlativa microscopia de interferencia (A, B, C), tinción Hoechst (a, b. c) y α/β tubulina total (a, b, c ) patrones para células de cúmulo humanas cultivadas en un ambiente bidimensional sin (A, a, a ) o con (B, b, b ) colágeno, o en un gel de colágeno tridimensional (C, c, c ). La flecha indica núcleo condensado y fragmentado. Escala = 10 µm. (Tomado de Combelles y col, 2005). I.4. Fecundación de los ovocitos y desarrollo embrionario. La fecundación es un proceso de interacción celular entre los gametos, que se fusionan para generar un nuevo individuo con un genoma derivado de ambos padres (Gilbert, 2005). Este proceso se lleva a cabo en varias horas, y es necesario que ocurran varios eventos en cascada (Sepúlveda, 2008). Para comenzar los espermatozoides se capacitan, y esta reacción ocurre por la adhesión de los espermatozoides al epitelio de las Trompas de Falopio. La unión al epitelio prolonga la vida fértil de los espermatozoides, mientras que esperan a que ocurra la fertilización y promueve la capacitación, donde adquieren movilidad hiperactiva (Croxatto, 2003). Estos cambios estructurales y 33

35 fisiológicos en el espermatozoide, van a permitir que más adelante ocurra la reacción acrosómica (Sepúlveda, 2008). La zona pelúcida (ZP) presenta tres proteínas (ZP1, ZP2, ZP3) que actúan como receptores primarios y secundarios, y son necesarios para la unión entre la ZP y el espermatozoide. En primer lugar para que ocurra la unión de los gametos, la proteína ZP3 se une con baja afinidad (reacción primaria) al espermatozoide. De esta manera provoca la reacción acrosómica, donde la membrana acrosomal externa del espermatozoide se fusiona con la membrana plasmática del ovocito (Sepúlveda, 2008). A continuación la membrana acrosomal interna interactúa de manera específica con la proteína ZP2 (reacción secundaria), los espermatozoides se activan liberando calcio intracelular, que lleva a la liberación de vesículas acrosómicas que contienen hialuronidasa y acrosina. Estas enzimas permiten que el espermatozoide sea capaz de atravesar la ZP y llegar al espacio perivitelino (Boiso y col, 2003), donde la membrana plasmática postacrosomal se fusiona con la membrana plasmática del ovocito, y el espermatozoide se incorpora al citoplasma (Sepúlveda, 2008). En el momento de la fecundación, el espermatozoide libera en el ovocito un factor termosensible que desencadena el aumento de los iones de calcio (Sepúlveda, 2008). El incremento de los niveles de calcio promueve la fusión de la membrana de los gránulos corticales (GC) con la membrana plasmática del ovocito, lo que causa la exocitosis de los GC (reacción cortical) (Gilbert, 2005), la difusión de este contenido impide que ocurra la poliespermia (Sepúlveda, 2008). 34