INMUNOENSAYO VISUAL DE ENTEROTOXINA ESTAFILOCÓCICA

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1 INSTRUCTIONS INMUNOENSAYO VISUAL DE ENTEROTOXINA ESTAFILOCÓCICA PARA DETECCIÓN DE LAS ENTEROTOXINAS ESTAFILOCÓCICAS A, B, C 1, C 2, C 3, D, E Y ESTAFILOCOCOS ENTEROTOXIGÉNICOS EN ALIMENTOS Y MUESTRAS RELACIONADAS CON ALIMENTOS Estas instrucciones deben seguirse cuidadosamente; no hacerlo puede producir resultados inexactos. Para fines diagnósticos in vitro solamente

2 ÍNDICE DE MATERIAS Pág. 1. INTRODUCCIÓN FUNDAMENTOS DE LA PRUEBA MATERIALES REQUERIDOS INSTRUCCIONES GENERALES PREPARACIÓN DE LA MUESTRA SELECCIÓN DEL PROTOCOLO PARA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PROTOCOLOS PARA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PROCEDIMIENTO ADICIONAL PARA MUESTRAS CON ACTIVIDAD PEROXIDÁSICA RESIDUAL PREPARACIÓN DEL MEDIO Y MATERIALES PREPARACIÓN DEL REACTIVO REALIZACIÓN DEL INMUNOENSAYO BIBLIOGRAFÍA GUÍA DE RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS...16

3 1. INTRODUCCIÓN El TECRA STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN (SET) VISUAL IMMUNOASSAY (VIA ) ha sido diseñado como un sistema de investigación rápido y específico 1 para la detección in vitro de enterotoxinas estafilocócicas en alimentos, muestras relacionadas con alimentos y cultivos supernatantes. Los presuntos resultados positivos deberán confirmarse por medio de métodos estándar 2 (ver la Sección 11, Paso 11 de las presentes Instrucciones). Esto es especialmente importante en casos tales como retirada de productos del mercado. Es importante que la preparación de las muestras se efectúe usando el método que sea más adecuado para el alimento que se está examinando. Ver la sección 6. Trascendencia de la Enterotoxina Estafilocócica La intoxicación alimenticia debida a ingestión de enterotoxinas preformadas, estables al calor, producidas por ciertas cepas de Staphylococcus aureus es una de las causas más frecuentes de intoxicación alimenticia en todo el mundo. Hay siete enterotoxinas estafilocócicas serológicamente distintas: A,B,C 1,C 2, C 3, D y E 3,4,5. El kit SET VIA de TECRA está diseñado para investigación directa de alimentos a fin de determinar la presencia de cualquiera de las siete toxinas, las cuales podrían detectarse en concentraciones tan bajas como 1ng por ml de la muestra 6,7. Sin embargo, este kit no puede usarse para identificación de un tipo específico de toxina. Para este fin, se puede usar el SET ID de TECRA. El ELISA se puede ejecutar manualmente, determinándose visualmente los resultados al cabo de 4 horas. El uso de lectores automáticos de placas de microtitulación y lavadoras es opcional. Consulte a TECRA o su distribuidor de TECRA para mayor información. Status de Acción Final de Métodos Oficiales de AOAC El Consejo de Métodos Oficiales de AOAC ha concedido el Status de Acción Final para el Método Oficial AOAC Enterotoxinas Estafilocócicas en Alimentos Seleccionados, lo que incluye el SET VIA de TECRA. 1

4 2. FUNDAMENTO DE LA PRUEBA El SET VIA de TECRA es un Ensayo Inmunoabsorbente enzimático (Enzyme-linked Immunosorbent Assay/ELISA), realizado en una configuración tipo "sandwich" (ver la Figura 1). Figura 1: El sandwich ELISA para detectar enterotoxina Estafilocócica 1. Anticuerpos con alta afinidad de "captura" epecíficos de SET han sido absorbidos en la superficie de los pocillos. 2. Si en la muestra hay presentes antígenos SET, son capturados por los anticuerpos. Cualquier otro material en la muestra es eliminado. 3. El sandwich se completa con la adición de anticuerpos enzimáticos (Conjugados) específicos para SET. 4. La presencia de SET es indicada cuando el Conjugado anexo cambia el Sustrato a un color verde. Alternativamente, NO SET NO COLOR VERDE. E E 2 3. MATERIALES REQUERIDOS 3.1 Materiales Suministrados por TECRA Número de Reactivo Reactivo 1 Concentrado de Lavar 2 Control Positivo 3 Control Negativo 4 Conjugado 5 Diluyente del Conjugado 6 Sustrato 7 Diluyente del Sustrato 8 Solución de Paro 9 Pocillos recubiertos de anticuerpos en bolsa resellable 10 Aditivo para Muestras Sujetador para pocillos o tiras individuales Instrucciones Hoja de Registro de Muestras Tarjeta de Colores 2

5 3.2 Materiales Requeridos para Preparación de la Muestra Licuadora u homogenizadora Centrífuga ( g y g) Jeringas desechables de polipropileno (aproximadamente 25mL) Algodón absorbente Papel ph (rango 0-14) Tris [Tris(hidroximetil)aminometano] Hidróxido de sodio 1M (NaOH) Ácido hidroclórico 10M (HCl) Azida de Sodio en solución al 30% w/v 3.3 Materiales Requeridos para el Inmunoensayo Incubadora: 35-37ºC Tubos de polipropileno (aprox. 10mL) Botella plástica con tapa de rosca (500mL) Pipetas dispensadoras 20µL, 50µL y 200µL Puntas de Pipetas Film transparente adherente para envolver Agua deionizada o destilada Hipoclorito de sodio: 2% (NaOCl) 3.4 Materiales disponibles por intermedio de TECRA Código del Producto Descripción Tamaño TSGMED500 Medio de Crecimiento de Estafilococos de TECRA 500g SIDVIA72 VIA para Identificación de Enterotoxina Estafilocócica de TECRA 72 pocillos 3 Los productos TECRA están disponibles a través de distribuidores ubicados en todo el mundo. Si desea información o asistencia técnica, póngase en contacto con TECRA o su Distribuidor local de TECRA durante horas de trabajo normales. Para datos de contacto de Distribuidores o consultas de emergencia, contacte a TECRA en Australia. Consulte los detalles en la última página de este libro. 4. INSTRUCCIONES GENERALES Para su conveniencia, hemos decidido indicar los puntos de importancia crítica con el símbolo C. Rogamos tomar especial nota de esos puntos. Todos los reactivos deben prepararse cuidadosamente. Se debe escribir la fecha de reconstitución en la etiqueta externa de la caja. Debe usarse el kit dentro de los 2 meses siguientes a la reconstitución y antes de la fecha de vencimiento (Use-by date) indicada en la etiqueta de la caja. Ésta es la última fecha en que se podría usar el kit. Todos los componentes deben mantenerse refrigerados (2-8 C) cuando no están siendo efectivamente usados. NO CONGELAR.

6 Los componentes del SET VIA de TECRA están destinados a uso como una unidad integral. El Control Positivo[2], Conjugado[4] y los pocillos recubiertos de Anticuerpos[9] que llevan el mismo número de serie están correlacionados. El Control Positivo[2] (un estándar interno calibrado) y el control negativo deben efectuarse cada vez que se realiza el ensayo. Se suministran dos juegos de Conjugado[4] y Diluyente Conjugado[5]. Reconstituya un juego inicialmente y el otro juego según se requiera, ya que luego de reconstituido el Conjugado[4] debe usarse en el plazo de un mes. Se deberá preparar un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 2% y usarlo para desechar todas las muestras que contengan toxinas. Los pocillos sin usar deben guardarse siempre en la bolsa provista y sellarla nuevamene usando la Tira de Resellado. C Control Positivo[2] contiene enterotoxina Estafilocócica. Tratar con cuidado. En caso de ingestión, consultar al médico. 5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Es importante observar los siguientes puntos antes de empezar la prueba: Algunas muestras tales como las de rábanos y vegetales escabechados contienen altos niveles de actividad peroxidásica residual. Como el sistema ELISA de TECRA utiliza un sustrato de peroxidasa, esto muy ocasionalmente origina falsos resultados positivos. Consulte la Sección 8 antes de probar la muestra en el ELISA. Los alimentos deshidratados tales como pastas, anchoas secas, etc. deben remojarse aproximadamente 30 minutos antes de mezclar, cualquiera que sea el protocolo usado. El volumen y tipo de líquido a usarse es determinado por el protocolo que se sigue. Cuando se prueba un nuevo tipo de alimento, se debe incluir en el ensayo un control negativo del alimento. (Ver la Sección 10 - Preparación del Reactivo.) La mayoría de los protocolos para preparación de muestras requieren que se mezcle la muestra como 4

7 parte de la preparación. La elección del método de mezclar dependerá del tipo de alimento que se está probando y del protocolo que se sigue. Si se pretende seguir el método aprobado por la AOAC, la muestra de alimento debe ser homogenizada usando una licuadora como la Waring. Se deberá usar también la licuadora Waring para alimentos con bajo contenido de humedad tales como carnes y pastas. Si se usa una licuadora, se debe cuidar de limpiarla y secarla totalmente entre cada muestra. Para alimentos con un alto contenido de humedad, como el queso y los camarones pelados, como así también ingredientes alimenticios deshidratados, tales como el polvo de suero lácteo y la caseína, se podría usar un stomacher, si se prefiere. Los alimentos secos tales como pastas, anchoas, etc, deben remojarse antes de mezclarlos. C Para todos los grupos de muestras, al ajustar el ph, no permitir que el ph baje de 3. Con valores de ph 3 o menores podría occurrir una desnaturalización de la toxina. 6. SELECCIÓN DE PROTOCOLO PARA PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Consultar la Tabla 1 para determinar cuál es el protocolo más apropiado para la muestra que se va a probar. Tabla 1: Selección de Protocolo GRUPO DE MUESTRA PROTOCOLO PÁG. Nº Leche, leche en polvo 1 6 Queso, alimentos empanados o rebozados 2 6 Ingredientes de alimenticios deshidratados, 3 6 por ejemplo suero lácteo en polvo, caseína Fórmula láctea para bebés 4 6 Alimentos procesados, pastas, productos de 5 7 confitería, productos a base de carne y otros alimentos no enumerados anteriormente, por ejemplo, pasta de soya, champiñones enlatados Análisis de Estafilococos productor de 6 7 enterotoxina Los extractos alimenticios deben prepararse de preferencia el mismo día de la prueba. Si fuera necesario, los extractos alimenticios podrían guardarse a 4 C durante una noche. 5

8 7. PROTOCOLOS PARA PREPARACIÓN DE MUESTRAS Protocolo 1 - Leche y leche en polvo Leche: Verificar que el ph de la muestra sea 7-8. Ajustar si fuera necesario. Agregar 50µL de Aditivo para Muestras[10] a 1mL de la muestra y mezclar completamente. Realizar el ELISA Leche en polvo: Agregar 10g de muestra a 50mL de Tris Buffer y mezclar bien. Proceder igual que como se indica más arriba para la leche. Protocolo 2 - Queso, Alimentos empanados o arrebozados Agregar 10g de muestra a 20mL de agua y mezclar completamente. Usar 10M HCl para ajustar el ph a 4. Centrifugar la muestra durante 10 min a g. Filtrar a través de una jeringa preparada (Sección 9.3). Ajustar el eluato a ph 7-8. Agregar 50µL de Aditivo para Muestras[10] a 1mL de eluato y mezclar bien. Realizar el ELISA 6 Protocolo 3 - Ingredientes alimenticios deshidratados Agregar 10g de muestra a 50mL de Tris Buffer y mezclar bien. Centrifugar la muestra por 10 min. a g. Filtrar el supernatante a través de una jeringa preparada (Sección 9.3). Ajustar el eluato a ph 7-8. Agregar 50µL de Aditivo para Muestras[10] a 1mL d eluato y mezclar bien. Realizar el ELISA Protocolo 4 - Formula láctea para bebés Agregar 10g de muestra a 40mL de agua y mezclar bien. Usar 10M HCl para ajustar el ph a 4. Centrifugar la muestra por 15 min. a g. Filtrar el supernatante a través de una jeringa preparada (Sección 9.3). Ajustar el eluato a ph 7-8. Agregar 50µL de Aditivo para Muestras[10] a 1mL de eluato y mezclar bien. Realizar el ELISA

9 Protocolo 5 - Otros alimentos Agregar 10g de muestra a 20mL de Tris Buffer y mezclar bien. Centrifugar la muestra por 10 min. a g. Filtrar el supernatante a través de una jeringa preparada (Sección 9.3). Ajustar el eluato a ph 7-8. Agregar 50µL de Aditivo para Muestras[10] a 1mL de eluato y mezclar bien. Realizar el ELISA Protocolo 6 - Análisis de Estafilococos productores de enterotoxinas Si se va a analizar una muestra de alimentos o una cepa de Staphylococcus spp. para determinar la producción de enterotoxinas, se deberá enriquecer la muestra de la manera siguiente: Agregar 10g de muestra de alimentos a 90mL de TSGM (ver Sección 9.2) y mezclar bien, o efectuar una inoculación pesada de cultivo en TSGM. Incubar durante la noche a 35-37ºC. Centrifugar la muestra por 10 min. a g. Decantar el supernatante y ajustar el eluato a ph 7-8. Agregar 50µL de Aditivo para Muestras[10] a 1mL de eluato y mezclar bien. Realizar el ELISA 7

10 8. PROCEDIMIENTO ADICIONAL PARA MUESTRAS CON ACTIVIDAD PEROXIDÁSICA RESIDUAL Para determinar si una muestra tiene actividad peroxidásica residual, tomar 200µL de extracto preparado de la muestra y colocar en un tubo. Agregar 200µL de Sustrato Reconstituido[6] y guardar a temperatura ambiente (20-25ºC) por 2 minutos aproximadamente. Las muestras propensas a causar interferencia convertirán el sustrato a un color verde oscuro. Si no se observa cambio en el color, proceder a efectuar el ELISA. Si se observa un cambio en el color, tomar 800µL de extracto de la muestra y agregar 200µL de solución al 30% w/v de azida de sodio. Agregar otros 10µL de Aditivo para Muestras[10], mezclar bien, y en seguida proceder a efectuar el ELISA. La azida superará la interferencia sin comprometer la detección de enterotoxina. C La azida de sodio es peligroso, siendo muy tóxico al tragarlo. Consultar la Hoja de Datos de Seguridad de Materiales del fabricante de azida de sodio antes de usarlo. 9. PREPARACIÓN DEL MEDIO Y MATERIALES 9.1 Preparación del Tris Buffer (0.25M, ph 8) Agregar 30.3g de Tris a 800mL de agua destilada o deionizada. Mezclar para disolver. Agregar 10M HCl hasta que el ph del buffer sea 8.0. Completar 1L agregando agua destilada Medio de Crecimiento de Estafilococo de TECRA Disolver 70g de polvo en 1 litro de agua destilada. Usar calor suave para disolver si fuera necesario. Verificar que el ph sea Esterilizar en el autoclave a 121ºC por 15 minutos. Es normal que este medio contenga un precipitado levemente turbio. Mezclar bien antes de usar. 9.3 Preparación de las Jeringas para Filtración de la Muestra Introducir un trozo de algodón absorbente de 0.5cm-1cm de espesor dentro de una jeringa plástica desechable de 25mL. Vertir dentro 5mL de agua destilada y bombear con el émbolo para formar un trozo apretado de algodón. Retirar el émbolo, verter en la muestra y luego introducir el émbolo para bombear la muestra, recolectando el eluato. Usar una jeringa diferente para cada muestra. 10. PREPARACIÓN LOS REACTIVOS Antes de usar el SET VIA de TECRA, es necesario preparar los reactivos. C Evitar contaminación cruzada de los reactivos. Cuidar de no cambiar inadvertidamente las tapas de las botellas de reactivos.

11 Solución de Lavar Diluir el Concentrado de Lavar[1] a 2L con agua destilada o deionizada. Para lavar los pocillos se recomienda una botella plástica con tapa de rosca con boca ancha. Guardar la solución de lavar a 4 C cuando no esté en uso. Cuidar que los envases utilizados para guardar solución de lavar sean limpiados cuidadosamente cada vez que se usen. Cuando la contaminación microbiana es un problema, se recomienda el uso de agua destilada. Conjugado Se suministran dos juegos de Conjugado[4] y Diluyente de Conjugado[5]. Reconstituir solamente un juego inicialmente. Agregar todo el contenido del vial de Diluyente de Conjugado[5] al vial de Conjugado[4]. Volver a colocar el tapón rojo y la tapa antes de guardar. Dejar que el Conjugado[4] se disuelva completamente a temperatura ambiente. NO AGITAR VIGOROSAMENTE EL CONTENIDO DEL VIAL DE CONJUGADO. ANOTAR LA FECHA DE RECONSTITUCIÓN EN LA ETIQUETA DE LA BOTELLA. DESECHAR EL CONJUGADO RECONSTITUIDO AL CABO DE 1 MES. Solución de Paro y Aditivo para Muestras La Solución de Paro[8] y el Aditivo para Muestras[10] están listos para usarlos. Control Positivo de Toxina El Control Positivo[2] contiene enterotoxina C Estafilocócica. Tratar con cuidado. El control de toxina debe ser preparado el día mismo en que se use, haciendo una dilución al 1:100 de Control Positivo[2] en Solución de lavar. Agregar 50µL de Control Positivo[2] a 4.95mL Solución de lavar. Para la dilución del Control Positivo[2] DEBEN USARSE tubos de polipropileno, ya que la toxina diluida se adherirá a los tubos de vidrio o polistireno, reduciendo su concentración efectiva. Se deberá efectuar un Control Positivo de Toxina cada vez que se realiza un ensayo para indicar que todos los reactivos son funcionales y el ensayo ha sido ejecutado correctamente. La toxina diluida no usada deberá desecharse cuidadosamente en una solución de hipoclorito de sodio al 2%. Si se desea, para reducir la posibilidad de contaminación Sustrato cruzada, tomar una alicuota de 50mL de Solución de lavar Agregar el Diluyente de Sustrato[7] al Sustrato[6]. Cuidar de los 2L y usarlo solamente para hacer el Control que el Sustrato Reconstituido se haya disuelto totalmente. El Positivo[2]. Sustrato Reconstituido aparecerá entre incoloro y verde 9 pálido.

12 Control Negativo de Alimentos Se deberá usar un alimento del mismo tipo del alimento sospechoso, pero que se sepa que está libre de enterotoxina. El control negativo de alimentos debe prepararse exactamente de la misma manera que el alimento sospechoso. Este control indicará si hay algún componente alimenticio que interfiera con los resultados de la prueba y si el lavado de los pocillos ha sido correcto. Si no hay disponible un control negativo de alimentos, se debe usar el Control Negativo[3] provisto en el kit. No se necesita dilución. Control Positivo de Alimentos (Opcional) Se puede agregar un cociente exacto del Control Positivo[2] a un producto alimenticio que se sabe es negativo para que actúe como control positivo de alimentos. 11. REALIZACIÓN DEL INMUNOENSAYO Verificar que todos los componentes del kit estén a temperatura ambiente (20-25 C) antes de usarlos. Paso 1: Preparación de los Pocillos con la Muestra Abrir la bolsa y sacar de la película selladora el número requerido de pocillos, asignando un pocillo para cada muestra, (incluir los controles negativos de alimentos) uno para el control positivo y uno para el control negativo. Presionar firmemente los pocillos al colocarlos en el sujetador provisto. Se requerirá un pocillo adicional si se ha preparado el control positivo opcional de alimentos. Poner de nuevo los pocillos sin usar dentro de la bolsa de papel de aluminio y volver a sellarla. El producto alimenticio negativo (10g) debe ser homogenizado según se describe en las Secciones 5 a 7. Agregar una alicuota de 500µL del Control Positivo[2] no diluido y re-homogenizar para asegurar la mezcla total. Continuar con la preparación de la muestra en la forma habitual. Se deberá hacer un ensayo de este extracto al mismo tiempo que se efectúa el de las muestras de alimentos sospechosos. 10 Paso 2: Remojo previo de los Pocillos Usando una botella de apretar llena de Solución de Lavar, llenar cada pocillo con Solución de Lavar y dejar reposar por 10 minutos a temperatura ambiente (20-25 C). Vaciar los pocillos invirtiendo rápidamente el sujetador y eliminar el residuo de líquido golpeando varias veces el sujetador boca abajo sobre toallas de papel.

13 Paso 3: Adición de Muestras Usando una punta nueva en la pipeta para cada muestra, transpasar 200µL de alicuotas de los controles y muestras a pocillos individuales, anotando la posición de cada muestra en la Hoja de Registro de Muestras provista. Cubrir los pocillos con film transparente adherente e incubar por 2 horas a C. Paso 4: Primer Lavado Lavar los pocillos cuidadosamente es un paso C crítico, esencial para una interpretación clara de los resultados. Vaciado de los Pocillos Para asegurarse de que los pocillos no sean desplazados durante el lavado, presionarlos firmemente dentro del sujetador. Invertir rápidamente el sujetador, vaciando su contenido en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 2%. Eliminar el residuo de líquido golpeando varias veces firmemente el sujetador boca abajo sobre una pila gruesa de toallas de papel absorbente. Esto es importante para una eliminación efectiva de residuo de la muestra. Llenado de los Pocillos con Solución de Lavar Usando una botella de exprimir de boca ancha sujeta sobre la placa y un chorro pesado de solución de lavar, llenar por completo cada pocillo, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire en el fondo de los pocillos. Lavar y vaciar los pocillos por completo un total C de cuatro (4) veces como se indica anteriormente. Se pueden usar lavadoras automáticas de placas de ELISA en vez del lavado manual. Sin embargo, para que los resultados sean satisfactorios es esencial programar las lavadoras para usarlas con este VIA de TECRA. CONSULTE A SU REPRESENTANTE DE TECRA RESPECTO A RECOMENDACIONES ESPECÍFICAS PARA LAVADORAS AUTOMÁTICAS. Paso 5: Adición del Conjugado Verificar que los pocillos estén vacíos antes de proceder. Agregar 200µL de Conjugado[4] a cada pocillo. Cubrir el sujetador con película de plástico adherente e incubar por 1 hora a temperatura ambiente (20-25 C). 11

14 Paso 6: Segundo Lavado Vaciar los pocillos y lavarlos cuidadosamente un total de cinco veces (no cuatro), siguiendo la secuencia anteriormente descrita en el Paso 4. Paso 8: Lectura de los Resultados Los resultados pueden leerse visualmente usando la Tarjeta de Colores provista o un lector de placas. Uso de la Tarjeta de Colores Paso 7: Adición del Sustrato Verificar que los pocillos estén vacíos antes de proceder. Agregar 200µL de Sustrato[6] a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente (20-25 C). No incubar los pocillos junto al aire acondicionado o en otro lugar donde la temperatura pudiera variar del rango aceptable. El desarrollo del color tiende a concentrarse en torno a las paredes de los pocillos. Antes de leer el resultado golpetee suavemente el sujetador para distribuir el color uniformemente. Incubar por un mínimo de 30 minutos y luego leer el resultado. C A los 30 minutos el Control Positivo deberá ser equivalente al Panel 4 de la Tarjeta de Colores, o por lo menos a 1.0 usando un lector de placas. Sólo se debe prolongar la incubación por más de 30 minutos si el control positivo aún no ha alcanzado el Panel 4 ó 1.0 como se indica en el Paso C Antes de proseguir, verificar que se está usando la Tarjeta de Colores 2. Colocar el sujetador sobre un fondo blanco, comparando luego pocillos individuales con la Tarjeta de Colores. Después de 30 minutos, si el color del Control Positivo[2] es equivalente al del Panel 4 en la Tarjeta de Colores, proseguir con los Pasos 9 y 10. Continuar la incubación del sustrato hasta que el Control Positivo[2] haya alcanzado una absorbancia equivalente al Panel 4 y proseguir con los Pasos 9 y 10. Si después de 45 minutos la absorbencia no ha alcanzado un color equivalente al del Panel 4, no se puede usar el resultado de la prueba. Consultar la Guía de Resolución de Problemas antes de repetir la prueba. Uso de un Lector de Placas Se puede leer la absorbancia de las muestras en nm usando un lector de placas.

15 Los lectores de longitud de onda doble deberán ser puestos a cero contra el aire y la segunda longitud de onda de referencia se deberá fijar a nm. Un instrumento de longitud de onda única deberá ser puesto a cero en un pocillo que contenga 200µL de Sustrato o agua, o bien en el pocillo de control negativo inmediatamente después de la adición del Sustrato a dicho pocillo. Agregar 20µL de Solución de Paro[8] a cada pocillo. Golpear suavemente los costados del sujetador para mezclar el contenido y leer luego el resultado dentro de los 30 minutos. Paso 10: Interpretación de los Resultados Los resultados se pueden leer visualmente usando la Tarjeta de Colores provista o con un lector de placas. Pasados 30 minutos, si el color del pocillo de Control Positivo[2] da una lectura de por lo menos 1.0, proseguir con los Pasos 9 y 10. Continuar la incubación del sustrato solamente hasta que el Control Positivo[2] haya alcanzado una absorbancia de 1.0, prosiguiendo luego con los Pasos 9 y 10. Si la absorbancia no ha alcanzado 1.0 después de 45 minutos, no se puede usar el resultado de la prueba. Consultar la Guía de Resolución de Problemas antes de repetir la prueba. Paso 9: Adición de la Solución de Paro La adición de la Solución de Paro[8] es opcional, pero se la debe agregar si una placa no se puede leer inmediatamente. La Solución de Paro[8] hará más lenta la velocidad de la reacción; sin embargo, los resultados deben leerse dentro de los 30 minutos siguientes a su adición. 13 Uso de la Tarjeta de Colores C Antes de proceder, verificar que se está usando la Tarjeta de Colores 2. Colocar el sujetador sobre un fondo blanco, comparando luego pocillos individuales con la Tarjeta de Colores. PARA QUE LA PRUEBA SEA VÁLIDA: El control positivo debe ser por lo menos tan oscuro como el del Panel 4 de la Tarjeta de Colores Y El control negativo debe estar dentro de la gama negativa de la Tarjeta de Colores. Si estos criterios no han sido satisfechos, los resultados no se pueden usar. Consultar la Guía de Resolución de Problemas antes de repetir la prueba.

16 Se considera que una muestra es NEGATIVA cuando la prueba es válida y el pocillo de la muestra tiene un color dentro de la gama negativa de la Tarjeta de Colores. Se considera que una muestra es POSITIVA cuando la prueba es válida y el color en el pocillo de la muestra es mayor o igual que el del Panel 3 de la Tarjeta de Colores. Uso de un Lector de Placas PARA QUE LA PRUEBA SEA VÁLIDA: el control positivo debe haber alcanzado una absorbencia de por lo menos 1.0 Y el control negativo debe tener una absorbencia de menos de 0.2. Si estos criterios no han sido satisfechos, los resultados no se pueden usar. Consultar la Guía de Resolución de Problemas antes de repetir la prueba. Se considera que una muestra es NEGATIVA cuando la prueba es válida y el pocillo de la muestra tiene una lectura de menos de 0.2. Paso 11: Confirmación de las Muestras Positivas Los presuntos resultados positivos según el STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN VIA de TECRA deberán confirmarse por la técnica de difusión doble de gel en micro portaobjetos o cualquier otro método equivalente aprobado por la AOAC 2. Esto es especialmente importante en casos tales como retirada de productos del mercado. La identificación del tipo de enterotoxina puede también realizarse usando el kit SET ID de TECRA. Paso 12: Eliminación de Desechos Cuando se ha finalizado la prueba, desechar todas las muestras que contienen toxinas, incluyendo los Controles Positivos, en hipoclorito de sodio al 2%. Remojar todos los pocillos usados durante 30 minutos en hipoclorito de sodio al 2%, colocar luego los pocillos en el autoclave a 121 C por 30 minutos como mínimo o incinerar como desechos especiales. Los demás componentes del kit y los pocillos pueden enviarse entonces para reciclaje o eliminarlos de acuerdo con las disposiciones reglamentarias locales. Se considera que una muestra es POSITIVA cuando la prueba es válida y el pocillo de la muestra da una lectura mayor o igual a

17 12. BIBLIOGRAFÍA 1. Bennett, R.W., and McClure, F. (1994) Visual Screening with Enzyme Immunoassay for Staphylococcal Enterotoxins in Foods: Collaborative Study. J. AOAC Int 77 (2): Section Staphylococcal Enterotoxin in Food, Microslide Gel Double Diffusion Test. AOAC, Official Methods of Analysis, 16th Edition, Baird-Parker, A.C., (1971) Factors affecting the production of bacterial food poisoning toxins. J. Appl. Bact. 34 (1): Bergdoll, M.S., Huang, I-Y., Schantz, E.J., (1974) Chemistry of Staphylococcal Enterotoxins. J. Agr. Food Chem. 22 (1): Freed, R.C., Evenson, M.L., Reiser, Bergdoll, M.S., (1982) Enzyme-linked Immunosorbent assay for detection of Staphylococcal Enterotoxins in Food. Appl. Environ. Micro. 44 (6): Park, C.E., Warburton, D., Laffey, P.J., and Collaborators. (1996) A collaborative study on the detection of Staphylococcal Enterotoxins in Food with an Enzyme Immunoassay Kit (TECRA). Journal of Food Protection 59 (4): Cheung, P.C.K., (1997) Staphylococcal enterotoxin detection with the TECRA SET Visual Immunoassay Kit. AIFST 9th Australian Food Microbiology Conference, Poster P7. 15

18 13. GUÍA DE RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS PROBLEMA El Control Positivo[2] no alcanza una absorbancia de 1.0 dentro de 45 minutos. El Control Negativo[3] da una absorbancia de más de 0.2. CAUSA PROBABLE 1. No se dejó que el Sustrato Reconstituido[6] alcanzara la temperatura ambiente (20-25 C) antes de agregarlo. 2. Se ha pasado la fecha de vencimiento. 3. Kit guardado a temperatura elevada o bajo cero. 4. Concentración efectiva de Control Positivo de Toxina más baja que la requerida. 1. Lavado incorrecto de los pocillos. 2. Contaminación cruzada con Control Positivo[2]. 3. Interferencia de componentes alimenticios. 4. El agua usada para preparación del lavado tiene alta carga microbial. 5. Placa dejada demasiado tiempo antes de la lectura (Paso 7). ACCIÓN Cuidar de dar a los componentes del kit el tiempo suficiente para alcanzar la temperatura ambiente. Verificar la fecha de vencimiento del kit y la fecha de reconstitución del conjugado. El kit debe guardarse entre 2-8 C cuando no está en uso. Usar tubos de polipropileno para dilución del Control Positivo[2]. Consultar el Procedimiento para Lavar (Paso 4 y Paso 6). Se debe usar una nueva punta de pipeta para cada muestra. Revisar el protocolo para preparación de la muestra. Usar agua estéril. Leer a los 30 minutos. Sólo prolongar la incubación del sustrato hasta que el PC sea igual al del Panel 4 o una absorbancia de 1.0. El Sustrato Reconstituido[6] es verde oscuro. Todos los pocillos parecen verdes. No hay desarrollo de color en el Control Positivo[2]. 1. Contaminación con Conjugado[4]. 1. Contaminación de la pipeta. 2. Lavado incorrecto de los pocillos. 1. Se usó Diluyente de Conjugado[5] en vez de Conjugado reconstituido[4]. 2. Se usó Control Negativo[3] en vez de Control Positivo[2]. No usar la misma punta de pipeta o recipiente dispensador para el conjugado y el sustrato. Preparar nuevo sustrato para usar. Limpiar periódicamente el pipetor. Revisar el Procedimiento para Lavar (Paso 4 y Paso 6). Cuidar que la solución de lavar sea correctamente reconstituida y guardada a 2-8 C. Asegurar que el vial de Diluyente Conjugado[5] y el conjugado reconstituido estén aparte. Verificar que se haya usado el reactivo correcto. 16

19 Resumen del Procedimiento del ELISA Remojar previamente los pocillos (10 min C) Vaciar los pocillos y agregar las muestras (2 hr, C) Lavar 4 veces Agregar el Conjugado (1 hr, C) Lavar 5 veces Agregar el Sustrato (mínimo 30 min C) Leer el resultado 17

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