PROTEON TRIGO PROTEON WHEAT

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1 Espacio para el men saje. Para causar un mayor impacto, escriba dos o tres frases. PROTEON TRIGO PROTEON WHEAT Título Test Inmunoenzimático para la Detección y Cuantificación de Proteína de Trigo Immunoenzymatic Test for Detection and Quantitation of wheat Protein S.L. María de Luna 11, Nave Zaragoza (SPAIN) Phone/Fax: info@zeu-inmunotec.com 1 G-COM-PR.04 S.L. JUN 05 Rev 0

2 ESPAÑOL PRINCIPIO DEL ENSAYO El kit PROTEON Trigo es un ensayo inmunoenzimático tipo ELISA competitivo indirecto basado en la detección específica de proteína de trigo en productos lácteos. El ensayo se basa en la competición entre la proteína de trigo presente en las muestras o patrones y la proteína inmovilizada en la superficie de la placa microtiter, por su unión a un anticuerpo específico. La unión de este primer anticuerpo con la proteína inmovilizada se podrá cuantificar colorimétricamente usando una enzima conjugada a un segundo anticuerpo. La cantidad de proteína de la muestra o patrón será inversamente proporcional a la intensidad de color del producto final. La determinación cuantitativa de proteína de las muestras se realizará por interpolación en una curva de calibrado en la que se representarán los porcentajes de proteína de trigo de las soluciones patrón frente a sus absorbancias a 450 nm. El límite de detección del test es de 0,26% (p/p) de proteína de trigo en proteína total. CONTENIDO DEL KIT 1 placa microtiter divisible de 96 pocillos (12 tiras de 8 pocillos) tapizada con el antígeno. 6 viales con soluciones patrón de proteína de trigo x 10 (al 0%, 1%, 2%, 4%, 8%). 1 vial con el Primer Anticuerpo x vial con Anticuerpo Conjugado x vial con solución de Substrato/cromógeno (TMB) Listo para usar. 1 vial con Solución Stop (Acido sulfúrico). 1 vial con Solución Tampón x 10. Certificado de Producto. MATERIAL ADICIONAL NECESARIO Micropipetas de µl y de µl. Agitador tipo noria para tubos de 25 ml. Balanza analítica. Espectrofotómetro para placas ELISA con filtro de 450 nm. 2

3 ESPAÑOL PRECAUCIONES DE USO Solo para diagnóstico in vitro La Solución Stop contiene ácido sulfúrico y es corrosiva. Manejar los reactivos con extrema precaución, evitar el contacto con la piel, ojos y membranas mucosas. Hacer uso de unas buenas prácticas en el laboratorio, así como de ropa y material adecuado. La hoja de seguridad del kit está disponible a través de su proveedor habitual o de Z.E.U- INMUNOTEC,SL. MANEJO Y ALMACENAMIENTO DEL KIT 1. Todos los componentes del kit deben ser conservados entre 4 y 12ºC y en oscuridad. (Nunca en congelador). El kit tiene una caducidad de 1 año, cuando se conserva en estas condiciones. 2. No se asegura la calidad de los componentes del kit después de su fecha de caducidad. 3. La Solución de Conjugado puede ser preparada para su uso inmediato o puede almacenarse en refrigeración (4-12ºC). 4. La solución de Substrato/cromógeno es sensible a la luz por lo que se debe evitar la exposición directa a ésta. La aparición de coloración en la solución de Substrato/cromógeno es indicativo del deterioro del mismo y éste debe ser desechado. Es aconsejable trasvasar la cantidad que se vaya a utilizar en el ensayo a otro tubo. 5. No cambiar ningún procedimiento del ensayo, en particular los tiempos y la temperatura de incubación. Una vez iniciado el ensayo realizar todos los pasos sin interrupción, no se deben dejar secar completamente los pocillos. 6. Evitar que incida la luz directamente sobre la placa durante la incubación. 7. Evitar que se formen burbujas de aire en los pocillos, ya que podrían interferir en la lectura fotométrica. 8. La reproducibilidad de los resultados de los ensayos ELISA depende en gran medida de un lavado eficiente y uniforme de los pocillos. Es importante incidir en este paso y repetirlo cuantas veces sea necesario. 9. La temperatura óptima de análisis debe situarse entre 20-24ºC. Temperaturas por encima o por debajo pueden originar curvas de calibrado que no conserven la linealidad o curvas con absorbancias más bajas de lo normal respectivamente. 3 S.L.

4 ESPAÑOL PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Y SOLUCIONES Preparación de los patrones de trigo: Diluir los patrones 1/10 con la Solución Tampón. Ejemplo: Diluir 0,1 ml de la Solución Patrón con 0,9 ml de Solución Tampón. Mezclar bien. Preparación del Primer Anticuerpo: Diluir el Primer Anticuerpo 1/20 con la solución tampón. Ejemplo: Diluir 0,05 ml de Anticuerpo con 0,95 ml de Solución Tampón. Mezclar bien. Preparación de las muestras: Pesar 100 mg de la muestra (leche en polvo) y disolverla en 9,9 ml de Solución Tampón. Mezclar hasta que las partículas estén bien dispersas y homogeneizar en un rotatubos tipo noria durante 30 minutos. Este tests también se puede usar con muestras de queso y yogurt. Consultar con la extracción de la muestra. Preparación del Anticuerpo Conjugado: Preparar solo el volumen de solución necesario para el ensayo. Para ello, mezclar 1 volumen del Anticuerpo Conjugado con 99 volúmenes del Tampón. Por ejemplo: Para analizar 8 muestras, es necesario 1,6 ml (0,2 ml/pocillo) de Solución de Anticuerpo Conjugado diluida. 2 ml de esta solución se preparan mezclando 0,020 ml del tubo del Anticuerpo Conjugado con 1,980 ml de Solución Tampón. 4

5 ESPAÑOL PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO: Es imprescindible antes de realizar el ensayo, leer con atención los consejos sobre manejo y almacenamiento del kit. 1. Para una mayor fiabilidad de los resultados es aconsejable realizar los ensayos con los patrones y las muestras por duplicado. 2. Acondicionar a temperatura ambiente todos los componentes y reactivos necesarios para la realización del ensayo. Sacar la placa microtiter de la bolsa y cortar las tiras que vayan a ser utilizadas. Guardar el resto en la bolsa con el desecante. 3. Aplicar 100 µl de muestra o patrón diluidos y 100 µl del Primer Anticuerpo diluido en cada pocillo de la placa y agitar suavemente. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 4. Lavar la placa 4 veces con Solución Tampón usando un frasco lavador o una micropipeta multicanal (añadiendo aproximadamente 0,3 ml/pocillo). Eliminar después el líquido volcando la placa sobre un recipiente. Para asegurarse de que se ha retirado completamente el líquido tras el último lavado, golpear la placa con los pocillos mirando hacia abajo sobre un papel absorbente. 5. Añadir 200 µl del Anticuerpo Conjugado diluido en cada pocillo. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 6. Repetir la secuencia de lavados como en el paso Aplicar a cada pocillo 100 µl de Solución de Substrato/cromógeno. Cubrir la placa e incubar a temperatura ambiente (20-24ºC) durante 30 minutos, tiempo en el que se desarrollará el color azul. No lavar la placa en este paso. 8. Añadir a cada pocillo 50 µl de Solución Stop para parar la reacción. Mezclar bien, dando unos golpes suaves en el borde lateral del marco hasta que aparezca la coloración amarilla en todos los pocillos. 9. Leer la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 450 nm con un espectrofotómetro para placas microtiter. Si es necesario tomar como referencia un blanco, usar el aire. Muestra Buffer Extrac. 100 µl Anticuerpo 100 µl Conjugado 200 µl TMB 100 µl Sol. Stop 50 µl lavado lavado 30 min 30 min 30 min 30 min Lectura 450 nm EXTRACCIÓN ETAPA INMUNOLÓGICA ETAPA REVELADO 5 S.L.

6 ESPAÑOL REPRESENTACIÓN Y CÁLCULO DE LOS RESULTADOS. 1. Dividir el valor medio de absorbancia de cada patrón o muestra por el valor medio de absorbancia del patrón al 0 % (patrón Bo de máxima señal) y multiplicar por 100, para obtener el cociente B/B 0 como se indica a continuación: Media de la absorbancia del patrón o muestra X 100 = B (%) Media de la absorbancia del Patrón 0% B 0 2. Representar el valor de % B/Bo de cada patrón frente a la concentración de proteína en escala semilogarítmica, como en el ejemplo que se expone a continuación: B/B0 (%) y = -21,105 Ln(x) + 77,92 R 2 = 0, % Proteína de trigo 3. Interpolar el valor %B/Bo, calculado para cada muestra, en la curva de calibrado para obtener así el correspondiente valor de concentración. (No hay que olvidar que en muestras diluidas hay que multiplicar estas concentraciones por el correspondiente factor de dilución) BIBLIOGRAFÍA: M.A. Manso, T.M.Cattaneo, S. Barzaghi, M.D. Pérez, L. Sánchez, M. Calvo, C. Olieran G.Brett & R. López-Fandiño. Determination of Wheat Protein in Milk and Milk Products Using Idirect Competive ELISA 2002, Bulletin IDF371, Lourdes Sánchez, María D.Pérez, Pilar Puyol, Gary Brett, Miguel Calvo. Determination of Vegetal Proteins in Milk Powder by Enzyme linked Immunosorbent Assay: Interlaboratory Study Journal of AOAC International, vol 85, 6,

7 ENGLISH TEST PRINCIPLE PROTEON wheat is a competitive ELISA test for detection and quantitation of wheat protein in dairy products. The test is based on the competition of wheat proteins, extrated from the sample, and those immobilised on the plate to bind a specific anti-wheat antibody. The antigen (wheat protein) will react with the antibody to form an antigen-antibody complex. A second antibody marked with peroxidase will bind specifically the first antibody and colour will be developed when adding the peroxidase substrate. A standard curve is obtained to determine the amount of wheat protein contained in the sample. Samples containing high concentration of wheat protein will produce less colour intensity and viceversa. The limit of detection for the test is 0.26% (w/w) wheat protein / total protein. KIT COMPONENTS 96-well microtiter (12 strips of 8 wells) coated with the antigen 6 vials wheat protein standards x10 (0%, 1%, 2%, 4%, 8%) 1 vial First Antibody x 20 1 vial Conjugate antibody x vial Substrate/chromogen (TMB) Ready to use 1 vial Stop Solution (Sulphuric Acid 1M) 1 vial Buffer x 10 Product Certificate ADDITIONAL MATERIAL NOT PROVIDED Micropipettes ( µl and µl) ELISA reader (450 nm filter) End-over-end rotation homogenizer (for 25 ml tubes) Analytical balance WARNINGS AND PRECAUTIONS FOR THE USERS For in vitro diagnostic use only. Some reagents can be dangerous. The stop solution contains sulphuric acid and is corrosive. Good laboratory practices and protective clothing should be used. Handle the reagents with extreme caution, avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. Safety data sheet is available on request from your local distributor or Z.E.U.-INMUNOTEC. 7 S.L.

8 ENGLISH HANDLING AND STORAGE RECOMMENDATIONS 1. The kit must be stored at 4-12ºC (never frozen) and protected from light. This kit has a shelf life of one year, when stored at the recommended conditions 2. Prepare the solutions according to the next section (Preparation of Samples and Solutions) immediately before use. 3. Strip wells must be stored hermetically sealed in the provided bag when not in used. 4. The diluted conjugate solution is stable for several days. 5. The Substrate Solution is sensitive to light and must be stored protected from any direct light exposure. This solution is transparent and must be discharged if becomes coloured. Avoid the reagent contamination by using a clean container. 6. The assay must be followed as indicated in a later section, specifically the incubation times. Once the assay has started, all the steps must be followed without any delays and avoiding the plate desiccation. 7. The plate must be protected from light while the assay is performed. 8. Avoid air bubbles in the wells any time during the assay. They may interfere with OD readings. 9. The performance of the kit can not be guaranteed after the expiry date. 10. Very important: The reproducibility of ELISA results depends on the efficiency and uniformity of washing of wells. The number of washes can be increased to improve the results. 11. The test should be carried out at 20-24ºC. Higher or lower temperatures could produce non-linear calibration curves or low absorbance readings respectively. 8

9 ENGLISH PREPARATION OF SAMPLES AND SOLUTIONS Preparation of wheat protein standards: Dilute the standards 1/10 with the provided Buffer. For example: mix 0.1 ml of standard and 0.9 ml of buffer solution. Preparation of the first antibody solution: Dilute the First Antibody 1/20 with the provided Buffer. For example: mix 0.05 ml of the First Antibody and 0.95 ml of Buffer Solution. Preparation of the samples: Weight 100 mg of the sample (powdered milk) and add 9.9 ml of Buffer Solution. Mix until all particles are dispersed. Place the solution in an end-over-end rotation for 30 min at room temperature. Yogurt and cheese samples can also be tested with this kit. Please, contact for information on samples extraction. Preparation of the Conjugate Antibody solution: Prepare only the volume to be used in the assay. Mix 1 volume of the Conjugate Antibody with 99 volumes of buffer solution. For example: for analysis of 8 samples; mix ml of the Conjugate Antibody solution and ml of Buffer Solution. 9 S.L.

10 ENGLISH TEST PROCEDURE Read the handling and storage recommendations prior running the assay 1. Standards and samples should be run in duplicate for a good reliability of results. 2. Take the kit out of the fridge until all the reagents have reached the room temperature (approximately 30 min). 3. Add 100 µl of diluted sample (or standard) and 100 µl of the diluted solution of the First Antibody into each well. Cover the plate with a lid and incubate for 30 minutes at room temperature (20-24ºC). 4. Wash the wells 4 times with the squeeze bottle or the multichannel pipette (add approximately 0.3 ml of Buffer Solution per well). Pour the liquid out from the wells and remove the remaining droplets by tapping the microplate upside down vigorously against absorbent paper. 5. Add 200 µl of the diluted solution of the Conjugate Antibody into each well, cover the plate with the lid and incubate for 30 minutes at 20-24ºC. 6. Wash the wells/plate 4 times following the washing procedure described above (Step number 4). 7. Add 100 µl of Substrate/Chromogen solution into each well. Place a lid on the plate and incubate for 30 minute at 20-24ºC. A blue colour will appear during this step. Do not wash the plate in this step. 8. Add 50 µl of Stop Solution into each well and mix very gently until the solution turns to yellow. 9. Read the results at 450nm using a microplate reader. Use an empty well as blank if necessary. Buffer Sample Extrac. Antibody 100 µl Conjugate 200 µl TMB 100 µl Stop sol. 50 µl wash wash 30 min 30 min 30 min 30 min Reading 450 nm EXTRACTION IMMUNOLOGICAL STEP DEVELOPING STEP 10

11 ENGLISH CALCULATION OF RESULTS 1. Divide the mean of each standard (or sample) absorbance (B) by the mean of absorbance obtained for the 0% standard (B 0, maximum binding), and multiply by 100 following the equation below: Mean of Standard (or Sample) Absorbance X 100 = B % Mean of Maximum Binding Absorbance B 0 2. Plot B/B 0 obtained for the standards in the y axis and the % of wheat protein in a logarithmic x axis. Calculate the % of wheat protein contained in the sample by interpolating the B/B 0 value obtained for the samples into the standard curve. When samples have been diluted the final result must be multiplied by the dilution factor B/B0(%) y = -21,105Ln(x) + 77,92 R 2 = 0, % Wheat Protein 10 REFERENCES: M.A. Manso, T.M.Cattaneo, S. Barzaghi, M.D. Pérez, L. Sánchez, M. Calvo, C. Olieran G.Brett & R. López-Fandiño. Determination of Wheat Protein in Milk and Milk Products Using Idirect Competive ELISA 2002, Bulletin IDF371, Lourdes Sánchez, María D.Pérez, Pilar Puyol, Gary Brett, Miguel Calvo. Determination of Vegetal Proteins in Milk Powder by Enzyme linked Immunosorbent Assay: Interlaboratory Study Journal of AOAC International, vol 85, 6, S.L.

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