INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIÓLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADOS E INVESTIGACIÓN DEPARTAMENTO DE INMUNUNOLOGÍA

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIÓLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADOS E INVESTIGACIÓN DEPARTAMENTO DE INMUNUNOLOGÍA DETECCIÓN DE MUTACIONES QUE CONDUCEN AL DESARROLLO DE INFECCIONES MICOBACTERIANAS POR SUSCEPTIBILIDAD MENDELIANA. T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INMUNOLOGÍA P R E S E N T A : Q.F.B. Noé Ramírez Alejo DIRECTORES: DRA. IRIS ESTRADA GARCÍA DR. FRANCISCO J. ESPINOSA ROSALES México, D.F. 2010

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4 ÍNDICE ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ABREVIATURAS RESUMEN ABSTRACT I II VI VII INTRODUCCIÓN 1 RESPUESTA INMUNE CONTRA M. tuberculosis 3 CITOCINAS Y RECEPTORES CLAVE EN EL CONTROL DE PATÓGENOS INTRACELULARES: MICOBACTERIAS Y SALMONELLA 9 SUSCEPTIBILIDAD MENDELIANA A INFECCIONES MICOBACTERIANAS 11 JUSTIFICACIÓN 36 HIPÓTESIS 36 OBJETIVO GENERAL 37 OBJETIVOS PARTICULARES 37 MATERIAL Y MÉTODOS 38 RESULTADOS 51 DISCUSIÓN 71 CONCLUSIONES 75 PERSPECTIVAS 75 BIBLIOGRAFÍA 76

5 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS FIGURA 1. ESPECIES DEL COMPLEJO Mycobacterium tuberculosis (MTC) 2 FIGURA 2. GRANULOMA 2 FIGURA 3. ESTRUCTURA DEL GRANULOMA 3 FIGURA 4. RECONOCIMIENTO POR PRRs 4 FIGURA 5. DIFERENCIACIÓN DE LOS LINFOCITOS T H 1. 5 FIGURA 6. SEÑALIZACIÓN DE IFN-γ. 7 FIGURA 7. ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T CD4 + 8 FIGURA 8. CITOTOXICIDAD DE LOS LNFOCITOS T CD8 + 8 FIGURA 9. ESTRUCTURA DE LA IL FIGURA 10. PREVALENCIA DE DEFECTOS EN MOLÉCULAS DEL EJE IL12/23-IFNγ 13 FIGURA 11. RECEPTOR DE IFN-γ 14 FIGURA 12. PRIMER MUTACIÓN REPORTADA 15 FIGURA 13. SEGUNDA MUTACIÓN REPORTADA 15 FIGURA 14. TERCERA MUTACIÓN REPORTADA 16 FIGURA 15. CUARTA MUTACIÓN 17 FIGURA 16. QUINTA MUTACIÓN 18 FIGURA 17. DEFECTO EN IFNGR1 18 FIGURA 18. PRIMERA MUTACIÓN 19 FIGURA 19. SEGUNDA MUTACIÓN 20 FIGURA 20. TERCERA MUTACIÓN 21 FIGURA 21. CUARTA MUTACIÓN 22 FIGURA 22. DEFECTOS EN IFNGR2 22 I

6 FIGURA 23. PRIMERA MUTACIÓN 24 FIGURA 25. TERCERA Y CUARTA MUTACIONES 25 FIGURA 26. DEFECTOS EN IL12B 26 FIGURA 27. RECEPTOR DE IL12 27 FIGURA 28. PRIMER MUTACIÓN REPORTADA 28 FIGURA 29. TOTAL DE MUTACIONES REPORTADAS PARA IL12RΒ1 28 FIGURA 30. DEFECTOS EN IL12RΒ1 30 FIGURA 31. ORGANIZACIÓN DE Stat-1 31 FIGURA 32. PRIMER MUTACIÓN EN Stat-1 32 FIGURA 33. MUTACIONES EN Stat-1 32 FIGURA 34. MUTACIONES EN Stat-1 33 FIGURA 35. ORGANIZACIÓN DE NEMO 34 FIGURA 36. MUTACIONES EN NEMO 34 FIGURA 37. ESTIMULACION DE SANGRE PERIFÉRICA CON rhil FIGURA 38. ESTIMULACION DE SANGRE PERIFÉRICA CON rhifn-γ 40 FIGURA 39. DIAGRAMA PARA LA PRUEBA TAMIZ 40 FIGURA 40. MAPA DEL VECTOR pjet1.2/blunt 48 FIGURA 41. PRODUCCIÓN DE IFN-γ EN SANGRE TOTAL DEL P1 52 FIGURA 42. PRODUCCIÓN DE IFN-γ EN PBMCs DEL P1 52 FIGURA 43. PRODUCCIÓN DE IL-12 P40 EN SANGRE TOTAL DEL P1 53 FIGURA 44. PRODUCCIÓN DE IL-12 p40 EN PBMCs DEL P1 53 FIGURA 45. EXPRESIÓN DE RECEPTORES EN MEMBRANA DEL P1 54 FIGURA 46. ESQUEMA QUE MUESTRA LA SECUENCIA DE cdna DEL GEN 55 IL12RΒ1 FIGURA 47. AMPLIFICACIÓN DE LA SECUENCIA CORRESPONDIENTE AL 55 DOMINIO CITOPLÁSMICO de IL12Rβ1 II

7 FIGURA 48. PCR DE COLONIA 56 FIGURA 49. DIGESTIÓN DEL PLÁSMIDO PURIFICADO A PARTIR DE 57 BACTERIAS FIGURA 50. SECUENCIA DE LA REGIÓN CITOPLÁSMICA DE IL12RΒ1 58 FIGURA 51. PRODUCCIÓN DE IFN-Γ EN CÉLULAS DE SANGRE TOTAL 59 DEL P2 FIGURA 52. PRODUCCIÓN DE IL-12p40 DEL P2 60 FIGURA 53. EXPRESIÓN DE CD119 E IL12RΒ1 61 FIGURA 54. PRODUCCIÓN DE IL-12 p70 EN EL P3 64 FIGURA 55. PRODUCCIÓN DE IL-12 p40 EN EL P3 64 FIGURA 57. EXPRESIÓN DE RECEPTORES EN LA SUPERFICIE CELULAR 65 FIGURA 58. EXPRESIÓN DE Stat-1 FOSFORILADO 66 FIGURA 59. EXPRESIÓN DE HLA-DR EN LA SUPERFICIE CELULAR 67 FIGURA 60. PRODUCCIÓN DE IL-12 p70 EN EL P4 68 FIGURA 61. EXPRESIÓN DE LOS RECEPTORES DE IFN-γ E IL FIGURA 62. EXPRESIÓN DE Stat-1 FOSFORILADO 70 TABLA 1 PACIENTES 18 TABLA 2. SECUENCIAS DE INICIADORES 46 III

8 ABREVIATURAS BCG cdna DCs ELISA FITC HLA-DR IFN-γ IFNGR1 IFNGR2 Bacilo de Calmette y Guérin (Mycobacterium bovis cepa BCG) DNA complementario Células dendríticas Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas Isotiocianato de fluoresceína Molécula DR del complejo principal de histocompatibilidad clase II Interferón gamma Subunidad 1 del receptor de interferón gamma Subunidad 2 del receptor de interferón gamma IL-12 Interleucina 12 IL-12 p35 Subunidad p35 de la interleucina 12 IL-12 p40 Subunidad p40 ó subunidad B de la interleucina 12 IL12Rβ1 Subunudad β1 del receptor de IL-12 IL-17 Interleucina 17 IL-23 Interleucina 23 Jak LB MOI MSMD MTC mrna NBT NEMO Janus cinasa Luria-Bertani Multiplicidad de infección Susceptibilidad mendeliana a infecciones micobacterianas Complejo Mycobacterium tuberculosis RNA mensajero Nitroazul de tetrazoilo Modulador esencial del factor nuclear κb IV

9 NK Natural killer NOS2 Óxido nítrico sintasa 2 PBS PBA PE PerCP PHA PMA rh IFN-γ rh IL-12 Stat-1 TB TLR TNF-α Regulador de fosfatos Regulador de fosfatos-albúmina bovina-azida de sodio Ficoeritrina Clorofilperhidrina Fitohemaglutinina Forbol miristato acetato Interferón gamma humano recombinante Interleucina 12 humano recombinante Transductor de señal y activador de la transcripción-1 Tuberculosis Receptores tipo Toll Factor de necrosis tumoral alfa V

10 RESUMEN La respuesta inmune contra bacterias intracelulares como Mycobacterium sp y Salmonella sp está dada principalmente por la interacción entre los macrófagos que albergan al microorganismo y los linfocitos T CD4+ que coopera con éste para lograr su eliminación. Dicha comunicación se realiza a través de la secreción de citocinas, principalmente IL-12 e IFN-γ. El papel principal de la IL-12 en esta interacción es el de polarizar la respuesta hacia T H 1 y así incrementar la producción de IFN-γ. Éste último genera diferentes efectos en el macrófago, mismos que le permiten eliminar al patógeno o al menos controlar la infección por medio de la formación de un granuloma. Han sido descritos defectos en estas moléculas así como en sus receptores o vías de señalización, los cuales condicionan a una susceptibilidad para desarrollar infecciones diseminadas por micobacterias y Salmonella. En el presente trabajo nos enfocamos a generar una metodología que permitiera diferenciar los casos en los que existe un defecto en los efectores de la respuesta IL-12/IFN-γ, de aquellos en los que la causa de la infección tiene una etiología diferente. Se midió, por el método de ELISA, la producción de IL-12 e IFN-γ en células de sangre total de los pacientes, tras la estimulación con BCG, BCG+rhIL-12 ó BCG+ rhifn-γ. La expresión en la superficie celular de los receptores de IFN-γ (IFNGR) e IL-12 (IL-12R) se realizó por citometría de flujo. Los ensayos funcionales para evaluar la actividad de ambos receptores se establecieron utilizando: células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se estimularon específicamente con rhil-12 y se incubaron durante 48 horas, después del cual se cuantificó la producción de IFN-γ por ELISA. Para el receptor de IFN-γ, las PBMCs se estimularon con rhifn-γ y se determinó por citometría de flujo la fosforilación del transductor de señal y activador de la transcripción-1 (STAT-1) y el incremento de moléculas de clase II (HLA-DR) en la superficie celular. En el caso en el que se consideró necesario se secuenció el gen correspondiente a una molécula candidato en busca de la mutación que condujera a una alteración en su función. VI

11 ABSTRACT The immune response against intracellular bacteria such as Salmonella sp and Mycobacterium sp is governed mainly by the interaction between macrophages that harbor the organism and a CD4 + T cell that cooperate with it to achieve its elimination. This communication is done through the secretion of cytokines, especially IL-12 and IFN gamma. The main role of IL-12 in this interaction is to polarize the response toward T H 1 and thus increase the production of IFN gamma. This produces different effects on the macrophage, which allows it to eliminate the pathogen or at least control the infection through the formation of a granuloma. Defects have been described in these molecules and their receptors or signaling pathways, which lead to a susceptibility to develop disseminated mycobacterial and salmonella infections. In this paper we aim to create a methodology that would distinguish those cases where a defect on these molecules causes severe infection. Therefore IL-12 and IFN-γ production was measured by ELISA in patient s whole blood cells, following stimulation with BCG, BCG + rhil-12 or BCG + rhifn-γ. Cell surface expression of IFN-γ (IFNGR) and IL-12 receptors (IL-12R) was performed by flow cytometry. Functional assays to evaluate the activity of both receptors were made as follows: peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stimulated specifically with rhil-12 and incubated for 48 hours, after this time IFN -γ production was quantified by ELISA. For IFN-γ receptor, PBMCs were stimulated with rhifn-γ and its activity was determined by flow cytometry phosphorylation of Signal Transducer and Activator of Transcription-1 (STAT-1) and increased expression of cell surface class II molecules (HLA-DR). Only in that case where it was considered necessary was sequenced a candidate gene to identify a defect that could generate any alteration in protein function. VII

12 Introducción La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa que afecta principalmente a los pulmones, aunque también puede afectar pleura, articulaciones, piel, intestinos, laringe y ojos. El agente causal es Mycobacterium tuberculosis el cual es un bacilo ácido alcohol resistente con complejos lipídicos en su pared celular (ácidos micólicos, lipoarabinomananas, lipomananas y manósidos con fostatidil inositol) que lo hacen resistente a algunos antibióticos, a agentes químicos y a la desecación. Otras bacterias responsables de tuberculosis en humanos y animales son las pertenecientes al complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) las cuales se mencionan en la Figura 1 (Brooks GF, 2005). La TB se caracteriza por una lesión primaria en el parénquima pulmonar seguida de la acumulación de macrófagos y la proliferación de células epiteloides para formar el típico tubérculo o granuloma (Figura 2). Toda el área está rodeada por linfocitos y células gigantes multinucleadas) (Figura 3). El tubérculo incrementa el reclutamiento de 2 a 10 semanas por la reacción de hipersensibilidad del sistema inmune contra el microorganismo (Flynn JL, 2001). Es una enfermedad que ataca principalmente a personas con estado nutricional deficiente, con inmunosupresión o enfermedades crónicas. Así mismo, las infecciones vírales como el sarampión y la varicela, la tosferina, el estrés, la infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), las infecciones pulmonares virales graves y el uso de esteroides puede activar un foco tuberculoso antiguo (reactivación endógena) ( En el mundo se calcula que hay más de 8 millones de casos y 2.5 millones de muertes al año. En México, en 2008, se identificaron 15,000 casos nuevos y 2,000 muertes en el año. El 10% de estos casos se asociaron a VIH/SIDA, mientras que en el 15% de los casos los pacientes tenían diabetes confirmada ( 1

13 Mycobacterium tuberculosis Complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) Mycobacterium bovis Mycobacterium africanum Mycobacterium canettii Mycobacterium microti Mycobacterium pinnipedii Mycobacterium caprae Figura 1. Especies de micobacterias pertenecientes al MTC. Figura 2. Granuloma formado por la acumulación de macrófagos (al centro) y linfocitos (células de púrpura más intenso en la periferia) ( db.doyma.es). 2

14 Linfocitos Célula gigante Macrófago Figura 3. Corte histológico de un granuloma tuberculoso. Se aprecian los linfocitos rodeando a los macrófagos y resalta la presencia de una célula gigante multinucleada (al centro) ( db.doyma.es). Respuesta inmune contra M. tuberculosis La respuesta inmune a M. tuberculosis es multifacética y compleja. Las células T son un componente esencial de la respuesta protectora y su interacción con macrófagos infectados es crucial para el control de la infección 50. Dicha respuesta se inicia cuando M. tuberculosis llega al espacio alveolar donde se encuentran con los macrófagos residentes, los cuales interactúan con los componentes bacterianos a través de los receptores tipo Toll (TLR) (Means TK, 1999). El TLR-2 interactúa con la proteína de 19 kda, y con la lipoarabinomanana. El TLR-4 reconoce por su parte a la proteína de choque térmico de 65 kda, mientras que el TLR-9 (presente en los endosomas y los fagolisosomas) reconoce DNA micobacteriano (Reiling N, 2002). Una vez habiendo reconocido sus ligandos, los TLR s señalizan a través de la proteína 88 de respuesta primaria de diferenciación mieloide (MyD88), la cual es una molécula adaptadora 3

15 presente en el citoplasma. Esto tiene como resultado la activación y traslocación al núcleo del factor nuclear kappa B (NFκB), que activa la transcripción de genes que codifican para citocinas proinflamatorias, tales como el TNF-α (Figura 4) (Tufariello J, 2003). El TNF-α actúa en el control de la infección activando de manera autócrina a los macrófagos al estimular la producción de intermediarios reactivos del nitrógeno, vía la inducción de la óxido nítrico sintasa 2 (NOS2), así como de intermediarios reactivos del oxígeno. Participa también en el reclutamiento de células del sistema inmune relevantes para el control de la infección (efecto sobre moléculas de adhesión, quimiocinas y sus receptores), lo cual permite la organización y dinámica del granuloma al favorecer el recambio de células que mantengan restringida la zona y de esta manera evitar la diseminación de la bacteria (Kindt JT, 2007). HSP 65 TNF-α Figura 4. Reconocimiento de los componentes micobacterianos por parte de los TLRs y señalización que termina con la transcripción de citocinas proinflamatorias (TNF-α) (Abbas KA, 2004). 4

16 Estas señales resultan en la migración de monocitos y células dendríticas (DC) al sitio de la infección. Una vez ahí las DC interactúan con la micobacteria a través de sus receptores de reconocimiento de patrones (PRR), como los TLRs, para después fagocitar y procesar a la bacteria. Las DCs viajan al ganglio linfático regional y maduran durante el trayecto. Una vez ahí realizan la presentación de antígenos micobacterianos a las células T CD8 + y CD4 +, en el contexto de moléculas del complejo principal de histocompatibilidad clase I (MHCI) y clase II (MHCII) respectivamente. Las células T CD4 + T H0 interactúan mediante su receptor de células T (TCR) con péptidos presentados en MHC II y se diferencian a T cooperadoras 1 (T H1 ) bajo la influencia de la IL-12 secretada por las DCs, regresando a los pulmones donde secretan IFN-γ e IL-2 (Cooper AM, 2008) (Figura 5). Figura 5. Diferenciación de los linfocitos T H1. Tras la presentación antigénica por parte de las células dendríticas, los linfocitos T H0 se diferencian a linfocitos T H1 por acción de la IL-12, produciendo a su vez IFN-γ. (Boisson-Dupuis,2008) 5

17 El IFN-γ se une a su receptor en el macrófago y su señalización involucra unas enzimas denominadas Janus cinasas (Jak) y factores de transcripción conocidos como transductores de señales y activadores de la transcripción (STAT). Las vías de transmisión de señales Jak/STAT son utilizadas por todos los receptores tipo I (IL-6, IL- 12, IL-23) y tipo II (IFN-α/β, IFN-γ) de citocinas. Las enzimas Jak inactivas están unidas débilmente a los dominios citoplásmicos de los receptores de las citoicinas (IFN-γ, IFN α/β, IL-6, IL-10, IL-12). Cuando se asocian dos receptores por interacción con su citocina, las moléculas Jak se activan por transfosforilación de sus residuos de tirosina. Una vez fosforiladas son reconocidas por monómeros de STAT en el citosol las cuales se fosforilan al asociarse a las proteínas Jak. Cuando se fosforilan los dos monómeros de STAT son capaces de reconocerse a través de una región de homología a la cinasa 2 del sarcoma de Rous (SH2) y formar un dímero que es capaz de migrar al núcleo y unirse a secuencias de DNA en las regiones promotoras de los genes regulados por citocinas y activar su transcripción (Schreiber RD, 1998) (Figura 6). De esta manera estimula a los macrófagos para que produzcan varias sustancias microbicidas (intermediarios reactivos del oxígeno, óxido nítrico y enzimas lisosómicas). La IL-2 también señaliza a través de Jak/STAT y tiene una actividad autócrina favoreciendo la proliferación de las células T (Abbas KA, 2004) (Figura 7). Las células T CD8 +, por su parte, también son reclutadas al sitio de la infección donde secretan IFN-γ y llevan a cabo su actividad citotóxica eliminando a los macrófagos infectados. Esto lo realizan a través de su interacción con el macrófago infectado, el cual le presenta antígenos micobacterianos cargados en MHC-I. Una vez reconocidos los antígenos, el linfocito secreta sus gránulos líticos los cuales contienen perforinas, granzimas y granulisinas (Figura 8), todas ellas capaces de inducir diferentes eventos en el macrófago que lo lleven a apoptosis (Stenger S, 1998) (daño a la membrana, activación de caspasas y nucleasas). La migración de monocitos y células T al sitio de la infección culmina con la formación de un granuloma, el cual es un rasgo característico de la TB. El granuloma contiene algunos linfocitos pequeños y una acumulación compacta de macrófagos que se diferencian hasta células epiteloides o células gigantes multinucleadas. La activación masiva de macrófagos que ocurre dentro del tubérculo suele ocasionar la liberación de cantidades elevadas de enzimas líticas. Estas enzimas destruyen las 6

18 células sanas vecinas, lo que da por resultado regiones circulares de tejido necrótico que por último se convierten en lesiones de consistencia caseosa (Kindt JT, 2007). Al cicatrizar, estas lesiones se calcifican y se tornan visibles en las radiografias, en las que se denominan complejos de Ghon. Es factible suponer que la necrosis elimina los macrófagos infectados y proporciona un ambiente anóxico en el que los bacilos vean reducida su proliferación (latencia). Figura 6. Señalización de IFN-γ. A. Ensamble del complejo de receptores tras la unión al IFN-γ. B. Activación de Jak y formación de los sitios de acoplamiento de STAT-1.C. Reclutamiento de STAT-1, activación y formación del homodímero. D. Traslocación al núcleo de STAT-1 y reconocimiento de las secuencias activadas por gamma (GAS) (Schreiber RD, 1998). 7

19 A B C Figura 7. A. Activación de una célula T H1 y su correspondiente cooperación con el macrófago. B. Se observan las citocinas que participan en la respuesta así como las moléculas responsables de la señalización: Jak 1 y 2/ STAT1 para el caso del IFNγ; Jak 1 y 3/STAT5 para IL-2.C. Expansión clonal de los linfocitos antígeno específico y producción de TNF-α por el macrófago el cual tiene un efecto autócrino al favorecer la producción de moléculas bactericidas, además del efecto sobre otras células (Regueiro GJ, 2002) A B Figura 8. A. Citotoxicidad por parte de los linfocitos T CD8 + sobre los macrófagos luego de la interacción entre su TCR y el MHC I del macrófago infectado, el cual presenta péptidos micobacterianos. La citotoxicidad puede darse a través la interacción Fas-Fas ligando ó por granzimas y perforina secretada por el CD8 + ( redalyc.uaemex.mx) B. Actividad de granzima y perforina sobre el bacilo (Stenger S, 1998). 8

20 Citocinas y receptores que participa en el control de patógenos intracelulares: micobacterias y salmonelas Las micobacterias, al igual que otros patógenos intracelulares, viven y se multiplican dentro de los macrófagos. Una vez que han sido interiorizados, estos patógenos intracelulares evaden los mecanismos de las células fagocíticas, evitando así su eliminación. Sin embargo, los macrófagos son capaces de reconocer PAMPS (patrones moleculares asociados a patógenos) de estos microorganismos y activarse, consecuentemente también activan a los linfocitos T, quienes a su vez cooperan con éstos a través de mecanismos que incluyen la interacción célula-célula y la secreción de citocinas, lo cual culmina con la eliminación de los patógenos por parte de los macrófagos. La comunicación celular entre la respuesta inmune innata y la adaptativa, mediada por IFN-γ e IL12 ha mostrado jugar un papel imprescindible en el control de las micobacterias y de otras bacterias intracelulares como la salmonela, listeria y otros patógenos intracelulares (Al-Muhsen SA, 2008). IFN-γ El IFN-γ, también conocido como interferón tipo II, es una citocina pleiotrópica producida por los linfocitos T y las células NK primordialmente. Su papel principal es el de estimular, en el macrófago, la transcripción de genes que codifican para las moléculas de MHC-II, para moléculas coestimuladoras como CD80, a enzimas que sintetizan sustancias microbicidas, como el óxido nítrico; y las subunidades p40 y p35 de la IL12 (Schreiber RD, 1998). Nairz et al. mostraron en el 2008, que el IFN-γ no sólo participa en la inducción de los mecanismos para la eliminación de la Salmonella, sino que también modifica la homeostasis del hierro en los macrófagos, para restringir la adquisición de este elemento por parte de la bacteria. Lo anterior es posible debido a que el IFN-γ reduce la expresión del receptor 1 de la transferrina (CD71) y aumenta la expresión de una proteína exportadora de hierro, la ferroportina 1. 9

21 IL-12 La IL-12 es un heterodímero de 70 kda, formado por las subunidades p35 (35 kda) y p40 (40 kda), la cuales están unidas por puentes disulfuro. La subunidad p35 tiene un dominio globular de cuatro hélices alfa, mientras que la subunidad p40 contiene un dominio de Ig (Figura 9). Esta subunidad se comparte con la IL-23. Esta citocina se sintetiza en los macrófagos infectados con bacterias intracelulares y virus, así como en respuesta a componentes microbianos como el LPS. Su papel principal es la activación del factor de transcripción Tbet, el cual favorece la diferenciación de los linfocitos T a T H 1 y estimula la síntesis de IFN-γ en estos y en las células NK (Trinchieri G, 2003). El IFN-γ activa a los macrófagos para que destruyan a los microorganismos fagocitados. Por consiguiente, la inmunidad contra muchos microorganismos intracelulares está mediada por citocinas que actúan en la siguiente secuencia de eventos: Figura 9. Estructura de la IL-12. En rojo se muestra la subunidad p35, formada por hélices alfa, mientras que en la subunidad p40 predomina la estructura de beta plegada y posee un dominio de inmunoglobulina. 10

22 IL-17/IL-23 La exposición de DCs a las micobacterias induce en éstas la secreción de IL-12 e IL- 23. Los linfocitos T CD4+ que reconocen péptidos que les son presentados por las DCs infectadas se diferencian a células T H 17 si en el microambiente están presentes IL-6 y TGF-β (Khader SA, ). La IL-23 también es capaz de inducir en los linfocitos T H 1 la secreción de IFN-γ en ausencia de la IL-12 p70, como ha sido demostrado en los ratones deficientes de la subunidad p35. Sin embargo, como la subunidad p40 es compartida por la IL12 y la IL23, los ratones deficientes del gen que codifique para la subunidad p40 son incapaces de producir IFN-γ por esta vía. Pero su papel fundamental es el de mantener a la población de linfocitos T H 17 (MacLennan C, 2004) Otra subpoblación células T asociadas a la respuesta primaria contra tuberculosis son las células T H 17. De manera particular, la población de células T γδ son una fuente primaria de producción de IL-17 en modelos murinos de infección con M. tuberculosis. En uno de estos modelos, en el cual se inocula el bacilo de Calmette-Guérain (BCG) por vía intratraqueal a ratones, el mrna para IL-17 se detecta apenas un día después de la infección. En ratones deficientes del gen para IL-17, la inducción de quimiocinas y la acumulación temprana de neutrófilos se ve reducida. Lo anterior ha llevado a proponer la participación de otros mediadores solubles, diferentes a los que participan en el eje IL-12/IFN-γ, abriendo un panorama más completo sobre el tipo de moléculas y mecanismos involucrados, específicamente, en el control y eliminación de las micobacterias y salmonelas (Khader SA, 2008). Susceptibilidad mendeliana a infecciones micobacterianas (del inglés Mendelian susceptibility to mycobacterial disease) La susceptibilidad mendeliana a infecciones por micobacterias (MSMD) es un síndrome congénito raro que probablemente fue descrito por primera vez en 1951, en niños que habían sido vacunados con BCG y presentaban una infección diseminada. El 11

23 padecimiento se define como una enfermedad con un cuadro clínico severo con infección diseminada o recurrente por micobacterias ambientales, y en algunos casos con una co-infección severa con Salmonella no typhi. La infección con Salmonella, sin co-infección por micobacterias, también ha sido reportada (Al-Muhsen SA, 2008). Debido a que los primeros casos reportados fueron con pacientes que presentaban infección por BCG o con micobacterias ambientales, el padecimiento recibió el nombre de susceptibilidad mendeliana a infecciones micobacterianas. Sin embargo este nombre resulta inexacto debido a que se han reportado casos en los cuales no necesariamente hay una infección por micobacterias sino por otro tipo de patógenos intracelulares (p.ej. Nocardia y Paracoccidioides). De manera que actualmente se ha propuesto el nombre de defectos innatos del eje IL-12/IFN-γ. La causa etiológica es una mutación en un gen que codifique para alguna de las moléculas involucradas en el eje IL-12/IFN-γ (citocinas, sus receptores o moléculas involucradas en la señalización de estas citocinas). Hasta la fecha se han descrito mutaciones en cinco genes autosómicos (IFNGR1, IFNGR2, IL12B, IL12BR1 y STAT-1) y un gen ligado al cromosoma X (NEMO: modulador esencial de NFκB), todos ellos involucrados en la MSMD. Este síndrome presenta un alto grado de heterogeneidad alélica, siendo los defectos del receptor de IL-12 la causa principal del padecimiento (40%), seguido por defectos en la subunidad 1 del receptor de IFNγ (39%). El resto se reparte en defectos en otras moléculas (IFNγR2, 4%), (IL12-p40, 9%), (STAT-1, 5%) y (NEMO, 3%) (Ver Figura 10). 12

24 Figura 10. Prevalencia de defectos en moléculas del eje IL12/23-IFNγ. El diagrama de pastel muestra que el principal porcentaje de defectos reportados para este eje se distribuyen entre la subunidad β1 del receptor de IL-12 y la subunidad 1 del receptor de IFN-γ. En menor porcentaje se encuentran defectos en la otras moléculas involucradas (Filipe-Santos O, 2006) El número de mutaciones reportadas hasta la fecha es de 86, las cuales se encuentran distribuidas de la siguiente manera: 41 en IL12BR1, 30 en IFNGR1, 5 en IFNGR2, 5 en IL12B, 3 en STAT-1 y 2 en NEMO. IFN-γR1 (IFNGR1) El receptor de IFN-γ es un heterodímero formada por las subunidades R1 y R2 (Figura 11). Se expresa en monocitos y células dendríticas. El homodímero de IFN-γ se une a la subunidad 1 del receptor, la cual a su vez recluta a la subunidad 2, siendo esta última quien señaliza mediante la vía Jak/STAT-1 (Figura 17). 13

25 Figura 11. Receptor de IFN-γ. Distribución de las subunidades 1 y 2 del receptor de IFN-γ. Se muestran las Janus cinasas a las cuales se encuentran asociadas. En 1996, Newport et al. reportaron dos casos de infecciones diseminadas causadas por M. bovis cepa BCG. El primero se trataba de una niña (hija de padres tunecinos, que eran primos en primer grado) quien fue vacunada con BCG subcepa Pasteur al mes de edad. Un mes después se aislaron micobacterias de los pulmones y de la médula ósea. Considerando que los casos raros de infección con BCG se asociaban a tasas elevadas de consanguineidad (30%), formas familiares (17%) y la misma distribución respecto al sexo, se propuso la existencia de una nueva inmunodeficiencia primaria con un patrón de herencia autosómico recesivo. Trabajos anteriores habían reportado que los ratones deficientes del monómero R1, del receptor de IFN-γ, son altamente susceptibles a infección por BCG. La formación del granuloma, en estos ratones, es defectuosa. Por lo tanto, se analizaron cuatro genes, los cuales codifican para el IFN- γ, el IFN-γ R1, el TNF-α y el TNF-αR1 (estas últimas debido a la participación del TNF-α en la formación del granuloma, ya que en estos pacientes la formación del granuloma era defectuosa) en niños con infección idiopática fatal por BCG. Los resultados de estos análisis demostraron la existencia de una mutación que consiste en la eliminación del 14

26 nucleótido 131 (C) en el exón 2 del gen IFN- γ R1 y que genera la formación de un codón prematuro de paro. La mutación está localizada en la región que codifica para una parte del dominio extracelular del receptor (extremo N- terminal). Figura 12. Primer mutación reportada. Eliminación del nucleótido 131 que genera un codón prematuro de paro (Filipe-Santos O, 2006). El segundo caso estaba representado por 4 niños provenientes de Malta, los cuales presentaban una infección micobacteriana diseminada atípica. Cada niño estaba infectado con diferentes especies de micobacterias (M. fortuitum, M. chelonae y dos cepas de M. avium) lo cual sugería un defecto en la respuesta inmune de los pacientes, ya que estas micobacterias no son virulentas. Además, uno de los niños presentaba un cuadro de salmonelosis. De esta manera se logró detectar una mutación diferente, que consiste en una sustitución en la posición 395 de A por C. Esta mutación trae como consecuencia un codón de paro prematuro en la secuencia del IFN-γ R1. Esto genera un receptor que carece de los dominios transmembranal e intracelular requeridos para la presencia del receptor en membrana y la transducción de señales respectivamente, causando la deficiencia completa de la subunidad R1 (Jouanguy E, 1996). Figura 13. Segunda mutación reportada. Cambio de la adenina 395 por una citosina que conduce a un codón prematuro de paro (Filipe-Santos O, 2006). 15

27 Un año después (1997) Casanova et al. describieron una nueva mutación en el gen que codifica para el IFN-γR1, la cual se detectó en dos niños hijos de padres consanguíneos portugueses. El niño fue vacunado con BCG cuando tenía un mes de edad y desarrolló rápidamente una infección diseminada. Su hermana menor no fue vacunada con BCG, pero fue diagnosticada con tuberculosis a los tres años de edad. A diferencia de los dos casos anteriores, en los cuales no había receptor en la superficie celular, se detectó la expresión del IFN- γ R1 en la membrana de las células, por citometría de flujo. En dicho alelo encontraron una nueva mutación localizada en el exón tres del gen, la cual se trata de una sustitución del nucleótido de la posición 260 (T por C), que conduce al cambio del aminoácido isoleucina (I) por treonina (T) y esto a su vez altera la estructura y función del receptor. Debido a que la mutación no afecta la presencia del receptor en membrana, se denominó deficiencia parcial del IFN-γR1. El receptor con la mutación I87T podía ser funcional a concentraciones altas de IFN-γ. Figura 14. Tercera mutación reportada. Cambio de la timina 260 por una citosina que genera un cambio de una isoleucina por una treonina la cual no impide la expresión del receptor en membrana pero si abaten su función (Filipe-Santos O, 2006). En 1999, el grupo de Jouanguy et al., encontraron una región de alta mutación (hotspot) en la que ocurre la eliminación de 4 nucleótidos a partir del nucleótido 818 (818del4). Ellos analizaron dos familias no relacionadas que en tres generaciones presentaron varios casos de infecciones por BCG y M. avium. El análisis del receptor por citometría mostró un incremento en la intensidad media de fluorescencia respecto al control, aunque estas células eran incapaces de responder al estímulo con IFN-γ. En 16

28 ambas familias se encontró que todos los individuos eran portadores del alelo 818del4 que se localiza en la región que codifica para el dominio citoplásmico del receptor y genera un codón prematuro de paro. En los individuos heterocigotos para el alelo hay una mayor proporción de receptores truncados respecto a los receptores completos (dominancia negativa). Figura 15. Cuarta mutación. Pérdida de 4 nucleótidos a partir del nucleótido 818, lo cual genera receptores sin dominio citoplásmico. Éste alelo tiene un efecto dominante negativo sobre el alelo silvestre (Filipe-Santos O, 2006). El grupo de Kobayashi et al. reportó en el 2007 la caracterizaron de una mutación en una niña japonesa de 12 años, quien fue vacunada con BCG a los 4 meses de edad. La paciente desarrolló inflamación del ganglio linfático regional dos meses después de la aplicación de la vacuna. El diagnóstico fue de linfadenitis por BCG. El análisis molecular mostró una mutación, de carácter dominante, en el gen de la subunidad 1 del receptor de IFN gamma (IFNGR1). La mutación consiste en la pérdida de 4 nucleótidos a partir del nucleótido 774 (774del4), generando un codón de paro generando una proteína truncada. Dicha mutación afecta la porción citoplásmica del receptor, aunque no afecta su presencia en la superficie celular. 17

29 Figura 16. Quinta mutación. Pérdida de 4 nucleótidos a partir del nucleótido 774, lo cual genera un codón de paro prematuro. A expresión del receptor no se ve abatida pero sí su función (Filipe-Santos O, 2006). Figura 17. Defecto en IFNGR1. Cualquier defecto en IFNGR1 afecta la respuesta del macrófago al IFN-γ incluyendo la producción de IL-12 (Filipe-Santos O, 2006). 18

30 IFN-γR2 (IFNGR2) Esta subunidad se expresa constitutivamente en los monocitos y en las células dendríticas, aunque en niveles menores respecto a la subunidad 1. Ambas subunidades son sintetizadas en el retículo endoplásmico (ER) y modificadas postraduccionalmente al ser N-glicosiladas en su paso del ER al aparato de Golgi (Ver Figura 22). Después de ser plenamente caracterizadas las mutaciones para IFN-γ R1, Holland y Dorman en 1998, describieron un caso de infección por micobacterias, pero ahora relacionado con alteración de la otra subunidad encargada de la señalización de receptor de IFN-γ, el IFN-γR2. Esta alteración genética apareció en un niño que no fue vacunado con BCG, pero que a los dos años de edad desarrolló una infección diseminada ocasionada por M. fortuitum y M. avium. La secuencia de DNA correspondiente a la subunidad R2 mostró una eliminación de los nucleótidos 278 y 279. Esta modificación provocó un corrimiento en el marco de lectura, conduciendo a un codón de paro prematuro (TGA) que corresponde a los nucleótidos 282, 283 y 284. La eliminación y el codón de paro se localizan en el exón III, el cual comprende la porción extracelular de la proteína. El resultado por citometría de flujo mostró una distribución normal para el caso de la subunidad R1, pero la ausencia total de la subunidad R2. Figura 18. Primera mutación. Eliminación de dos nucleótidos a partir del nucleótido 278, lo cual genera un codón de paro prematuro (Filipe-Santos O, 2006). 19

31 Dos nuevas mutaciones en IFN- γr2 fueron descritas por Vogt et al. en Ambas conducen a una deficiencia completa y se detectaron en 4 niños no relacionados. El paciente 1 tenía una infección con M. avium; el paciente 2 una infección por BCG; y los pacientes 3 y 4 presentaban una infección por M. fortuitum. La mutación encontrada en el P1 consiste en una eliminación de los nucleótidos (663del27) que conduce a la pérdida de los aminoácidos en la proteína, por lo que ésta cambia su conformación y no se une a la subunidad 1. Los pacientes 2, 3 y 4 eran homocigotos para una mutación con sentido equivocado, que genera un cambio de aminoácido en la posición 503 (503 C por A; cambio de codón ACC por AAC). El cambio de codón genera un cambio de los aminoácidos treonina por asparagina en la posición 168 (T168N). Este cambio modifica la secuencia de aminoácidos, dando lugar a un nuevo sitio de N-glicosilación que impide el reclutamiento de la subunidad 2 por la subunidad 1 para la posterior señalización. Figura 19. Segunda mutación. Cambio de una citosina por una adenina la cual genera un cambio de treonina por asparagina. Esto crea un nuevo sitio de N-glicosilación en el receptor, lo que lo hace disfuncional (Filipe-Santos O, 2006). 20

32 En otra familia, Döffinger et al. identificaron, en un niño con infección diseminada por BCG, un cambio de C por T en la posición 340, que genera un cambio de aminoácido en el residuo 114 (R114C). El fenotipo de este defecto no es muy grave, ya que la proteína se expresa en la membrana y aunque la respuesta a IFN-γ se ve disminuida, puede restablecerse al incrementar la concentración del IFN-γ terapéutico. Figura 20. Tercera mutación. Cambio de la citosina 340 por una timina, lo cual altera el reclutamiento de la subunidad 2 por parte de la subunidad 1 y disminuye la respuesta a IFN-γ (Filipe-Santos O, 2006). Otra mutación para este gen fue detectada en el año 2004 por Rosenzweig et al. la cual consiste en una eliminación de una G en la posición 791 (791delG) y genera un efecto dominante negativo en las células heterocigotas. El caso reportado por este grupo consistía en una niña de 15 meses cuyos padres eran consanguíneos y que fue vacunada a las 3 semanas de nacida con la BCG desarrollando una linfadenitis cervical con presencia de bacilos ácido alcohol resistentes, la cual evolucionó a hepatomegalia y osteomielitis en el fémur derecho. El análisis funcional mostró ausencia de fosforilación de STAT 1 tras la activación con IFN-γ, y el análisis molecular evidenció la ausencia de 2 guaninas en la posición , misma que se localiza en la región que codifica para el dominio transmembranal y genera un codón prematuro de paro, el cual se traduce en una proteína anclada a membrana pero sin dominio intracitoplásmico. Los padres de la paciente eran heterocigotos para el alelo 791delG. In vitro, sus células 21

33 mostraron una reducción en la fosoforilación de STAT-1 tras el estímulo con IFN-γ. Al analizar la distribución del IFNGR2 en tales células se mostró que existía una mayor proporción de receptores truncados respecto a los receptores con dominio intacitoplásmico, lo que sugiere un efecto dominante negativo por parte de este alelo. Figura 21. Cuarta mutación. Eliminación de dos guaninas, lo cual genera un codón prematuro de paro. El receptor se expresa en membrana pero no señaliza. Esta mutación ejerce un efecto dominante negativo sobre el alelo silvestre (Filipe-Santos O, 2006). Figura 22. Defectos en IFNGR2. Mutaciones presentes en IFNGR2 impiden la señalización y la respuesta al IFN-γ (Filipe-Santos O, 2006). 22

34 IL12 p40 Como se mencionó anteriormente la forma madura y funcional de la IL-12 es un heterodímero formado por la subunidad p40, la cual se comparte con la IL-23, y la subunidad p35. No obstante, se ha propuesto que la subunidad p40 puede formar un homodímero con actividad en el control de patógenos intracelulares. En los últimos 10 años se han identificado 20 pacientes, con 5 diferentes mutaciones, de las cuales solamente 4 han sido publicadas (Ver Figura 26). Todas las mutaciones son recesivas y generan deficiencia completa de IL-12 p40. El primer caso de un defecto en esta molécula fue descrito en 1998 por parte de Altare et al. en una niña que fue inmunizada después de su nacimiento con BCG, quien a los tres meses desarrolló un cuadro de tuberculosis con características clínicas bien definidas 3. A los 3.5 meses de edad, la niña desarrolló también un cuadro de gastroenteritis severa, con diarrea sanguinolenta, ocasionado por Salmonella enteritidis. Mediante el análisis molecular de los genes que codifican para las subunidades p40 y p35 del dímero de ll-12, se encontró una eliminación de 373 nucleótidos (4.4kb) entre las posiciones 482 y 854 (482+82_ del). El gen de la subunidad p40 consiste en siete exones y la eliminación de 4.4kb abarca los exones cuatro y cinco. Esta eliminación da origen a una proteína de 184 aminoácidos, mientras que la proteína nativa consiste en 328 aminoácidos. Figura 23. Primera mutación. Eliminación de 4.4 kb, lo que genera una subunidad p40 más corta (Filipe- Santos O, 2006). 23

35 La segunda se detectó en una familia de Arabia Saudita. Se analizaron tres pacientes no relacionados, los cuales habían sufrido de infección diseminada por BCG y dos de ellos presentaron co-infección por salmonela. La mutación encontrada en estos pacientes consiste en la inserción de una A en el nucleótido 315 (315insA) la cual genera un codón prematuro de paro (Figura 23). No obstante, se ha encontrado que los haplotipos _ del y 315insA están muy conservados. Los estudios poblacionales han permitido rastrear las mutaciones y encontrar que el primer haplotipo surgió en el subcontinente Indio hace 700 años, mientras que el segundo haplotipo se originó hace 1100 años en la Península arábiga. Figura 24. Segunda mutación. La inserción de adenina después del nucleótido 315 genera un codó prematuro de paro (Filipe-Santos O, 2006). Tres pacientes de origen tunecino, los cuales habían sufrido infecciones diseminadas por M. bovis BCG y por salmonela, presentaron una eliminación de 8 nucleótidos a partir del nucleótido 278 (278del8) la cual produce una proteína más pequeña y disfuncional. En un paciente iraní se detectó otra eliminación, solo que ahora de 2 nucleótidos, en la posición 526 (526del2) lo que genera un codón prematuro de paro. 24

36 Figura 25. Tercera y cuarta mutaciones. La mutación 297del 8 genera una proteína más pequeña y por lo tanto disfuncional, mientras que la mutación 526del2 produce un codón prematuro de paro (Filipe-Santos O, 2006). Otra relación interesante es aquella que guarda la aparición de infecciones diseminadas por parte de Salmonella y defectos en IL-12 p40, así como en su receptor. Aproximadamente en más de la mitad de los casos reportados, se ha presentado una co-infección de micobacterias y Salmonella sugiriendo una participación relevante de la IL-12 en el control de estas dos bacterias. No obstante no se ha encontrado la misma relación entre la susceptibilidad a la infección por Salmonella y los defectos en la vía de señalización del IFN-γ (aproximadamente 6%). 25

37 Figura 26. Defectos en IL12B. Mutaciones presentes la subunidad p40 de IL-12 impide la producción de IFN-γ (Filipe-Santos O, 2006). IL12Rβ1 El receptor de IL-12 está formado por dos subunidades: IL12Rβ1 e IL12Rβ2 y se expresa en linfocitos T y células NK. La subunidad 1 está expresada constitutivamente, mientras que la subunidad 2 se expresa luego de la activación. La expresión de ambas subunidades es crucial para tener una interacción de alta afinidad con la citocina. El receptor señaliza a través de las proteínas Janus cinasa 2 (Jak2) y Tyk2 quienes reclutan y fosforilan a monómeros de la proteína STAT 4 (Ver Figura 30). Los monómeros fosforilados forma un homodímero que se traslada al núcleo y actúa como activador de la transcripción. El gen IL12RB1 está formado de 17 exones los cuales codifican para una proteína de 662 aminoácidos y de un peso aproximado de 100 kda (Figura 27). 26

38 Figura 27. Receptor de IL12. Subunidades β1 y β2 del receptor de IL-12, las cuales se unen a las subunidades p35 y p40 respectivamente (Trinchieri G, 2003). En 1998, Altare et al. describieron la deficiencia del receptor de IL12 y su participación en la MSDM 4. En ese estudio se investigaron cuatro pacientes no relacionados que presentaron una infección diseminada por BCG y dos de ellos además presentaron infecciones por Salmonella no tiphy. Se investigaron mutaciones en las subunidades del receptor de IL-12 en células T encontrando una sustitución de A por T en la posición 913 (Figura 28) del gen que codifica para la subunidad β1 (IL-12Rβ1). Como en los casos anteriores, los pacientes eran homocigotos para esta mutación, la cual fue heredada de manera autosómica recesiva. Sin embargo, los pacientes respondieron de manera adecuada al tratamiento con IFN-γ. 27

39 Figura 28. Primer mutación reportada. La sustitución de una timina por una timina en el nucleótido 913 genera un codón prematuro de paro (Filipe-Santos O, 2006). Hasta la fecha se han reportado 89 casos de pacientes con defectos en IL12RB1 y 62 de ellos han sido publicados. Los defectos en esta molécula resultan ser la causa etiológica principal del MSMD. La mayoría de las mutaciones reportadas causan ausencia del receptor en la superficie celular (Figura 29). Figura 29. Total de mutaciones reportadas para IL12Rβ1. La mutaciones en rojo son aquellas que generan pérdida de la función con ausencia de la proteína en la membrana celular, mientras que la mutación en azul genera pérdida de la función pero con presencia de la proteína en la superficie celular (Filipe-Santos O, 2006). La susceptibilidad generada por este padecimiento genético solo había sido reportada en infecciones por micobacterias atípicas o poco virulentas y salmonela, sin embargo, en 2005, Moraes-Vasconcelos et al. reportaron el caso de un varón de 24 años, de 28

40 ascendencia portuguesa, quien fue vacunado al nacer con BCG y fue trasladado al hospital a los 7 meses debido a que presentaba una adenopatía cervical causada por M. bovis BCG. A la edad de 6 años sufrió una infección diseminada por Salmonella enterica que le ocasionó una linfadenitis múltiple, artritis en el lado derecho de la cadera, y osteomielitis en el íleon y fémur del lado derecho. A los 20 años presentó fiebre persistente, dolor abdominal, linfadenopatía diseminada y hepatoesplenomegalia. La biopsia de un ganglio linfático abdominal reveló una forma aguda de infección por Paracoccidioides brasiliensis. Una mutación con sentido equivocado en el gen de la subunidad 1 del receptor de IL-12 (IL12Rβ1) fue encontrada y consiste en una cambio de leucina por fenilalanina en el residuo 77. El patrón de herencia es recesivo y no hay presencia del receptor en la superficie celular. Al igual que los pacientes con defectos en la subunidad p40 de IL-12, un poco más de la mitad de los pacientes diagnosticados con defectos en la subunidad β1 presentaron infecciones por Salmonella. A pesar de la severidad de los defectos a este nivel, el pronóstico es alentador ya que sólo el 17% de los pacientes han fallecido. El resto han logrado mejorar y sobrevivir hasta la adultez con un largo tratamiento con antibióticos e IFN-γ recombinante. La penetrancia de los defectos en IL12RB1 es de alrededor del 40%. Un estudio en el 2004, realizado por Remus et al. que incluyó 101 familias, en las cuales se había presentado al menos un caso de tuberculosis pulmonar activa, y 78 individuos sanos, detectó la presencia de 19 mutaciones puntuales, 9 de las cuales ya habían sido descritas, siendo las otras 10 desconocidas. Dentro de estas mutaciones se detectaron 13 polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) los cuales podrían ser utilizados como marcadores de población (el estudio comprendió una población dividida en dos grupos étnicos: árabes y marroquíes) en futuros estudios de asociación de estos polimorfismos y la susceptibilidad a desarrollar tuberculosis pulmonar. En un estudio más reciente (2009), Yancoski et al. rastrearon el haplotipo 1623_1624delinsTT en el gen IL12BR1, mismo que fue detectado en 5 familias argentinas de ascendencia europea. Al realizar el análisis se estimó que la variante genética tenía aproximadamente 475 años de haber sido acarreada. Este tiempo 29

41 corresponde con el inicio de la colonización de América por parte de los españoles. Lo anterior permite suponer que algunas variantes genéticas en este gen tienen tanto un componente ancestral como étnico. Figura 30. Defectos en IL12Rβ1. Las mutaciones en el gen de IL12Rβ1 impiden la producción de IFNγ (Filipe- Santos O, 2006). STAT-1 El transductor de señal y activador de la transcripción-1 (STAT1) es crítico para la activación de los genes inducidos por IFN-γ (ver Figura 34). El homodímero de STAT-1 recibe el nombre de GAF (factor activador de gamma) y es en esa forma en la que se traslada al núcleo para unirse a secuencias reguladoras discretas llamadas GAS (secuencias activadas por gamma). El gen STAT1 se compone de 25 exones y codifica para una proteína que posee cuatro dominios: el dominio SH2, el cual interactúa con la subunidad 1 del receptor de IFN-γ; el sitio de unión al DNA (DNA-B), el segmento Tail (TS) y el dominio transactivador (TA) (Figura 31). 30

42 Figura 31. Organización de STAT-1. Esquema que muestra cada uno de los segmentos de STAT-1: CC muestra el coil colied, DNA-B es el sitio de unión al DNA, SH2, es el sitio que interactúa con el receptor de IFN-γ, TS es el segmento Tail y TA es el dominio transactivador (Dupuis S, 2001). En 2001, Dupois et al. investigaron alteraciones en la señalización de los receptores de esta vía. El caso fue de una mujer francesa de 33 años de edad que desarrolló infección diseminada por BCG en su infancia y continuaba sufriendo infecciones recurrentes de tipo viral. La señalización mediada por IFNγ y su receptor fueron evaluadas por lo que se analizaron los niveles de activación de genes dependientes de IFN-γ. Se identificó en la secuencia de STAT-1 una sustitución heterocigota (T por C) en el nucleótido 2116 que se traducía en una sustitución de serina por leucina en el residuo de la posición 706 (L706S) (Figura 32). La disfuncionalidad en STAT 1 estaba dada por la ausencia de fosforilación de su residuo de tirosina 701, de manera que no se puede formar el homodímero y por tanto no se puede trasladar al núcleo para llevar a cabo su función. Figura 32. Primer mutación en STAT-1. El cambio de timina por citosina en el nucleótido 2116 genera un cambio de leucina por serina en el segmento tail, lo que impide la formación del homodímero (Filipe-Santos O, 2006). En 2006, Chapgier et al. encontraron dos mutaciones a nivel de STAT 1, caracterizadas en dos niños no relacionados. La primera de ellas consiste en una sustitución nucleotídica en la posición 958 (G por C) del exón 11 de uno de los niños. Esta 31

43 mutación provoca un cambio de ácido glutámico por glutamina en la posición 320 (E320Q). El ácido glutámico forma un enlace iónico con residuos de histidina y lisina, lo que forma una estructura de asa que le permite al STAT 1 interactuar con los surcos del DNA. En el segundo niño se encontró una sustitución heterocigota en la posición 1389 (G por T) en el exón 17. El resultado es un cambio de glutamina por histidina en la posición 463 (Q463H). La glutamina forma puentes de hidrógeno con las bases nitrogenadas, mientras que la histidina lo hace con los grupos fosfato al exterior de la molécula de DNA, evitando la interacción con las bases (Figura 33). A B Figura 33. Mutaciones en STAT-1. A. La segunda y tercera mutaciones generan un cambio de aminoácido en la proteína lo cual afecta directamente la interacción con el DNA (Filipe-Santos O, 2006). B. La mutación que genera el cambio Q463H impide la formación del asa que interactúa con los surcos del DNA. El cambio E329Q impide la interacción directa con las bases y en cambio lo hace con el esqueleto de fosfatos (Chapgier A, 2006). 32