11 Número de publicación: Int. Cl.: 74 Agente: Arias Sanz, Juan

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 38/48 (06.01) A61P 3/00 (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Procedimientos para tratar trastornos de glándulas mamarias. Prioridad: US Titular/es: ALLERGAN, Inc. 22 Dupont Drive Irvine, California 92612, US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Brin, Mitchell, F. y Donovan, Stephen 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Arias Sanz, Juan ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Procedimientos para tratar trastornos de glándulas mamarias Referencia Esta solicitud es una continuación en parte del número de serie de solicitud 09/ , presentada el 2 de agosto de 00, que es una continuación en parte del número de serie de solicitud 09/44.842, presentada el 7 de diciembre de 1999, actualmente patente de EE.UU. número Antecedentes La presente invención se refiere a la fabricación de un medicamento para tratar tejidos atípicos, como tejidos hiperplásicos, quistes y neoplasias (incluyendo tumores y cánceres) y para prevenir el desarrollo,o para provocar la regresión o remisión, de tejidos atípicos, quistes y neoplasias. En particular, la presente invención se refiere a la fabricación de un medicamento para tratar trastornos de las glándulas mamarias, tales como quistes y neoplasias de las glándulas mamarias, tanto benignos como cancerosos, así como para tratar células hiperplásicas y/o hipertónicas de las glándulas mamarias por administración local de una toxina clostridial sobre o en la proximidad del tejido de glándula mamaria aquejado. Se sabe que muchos tejidos hiperplásicos pueden, si no se tratan, desarrollarse hasta tejidos cancerosos, por ejemplo, (1) diferentes tejidos mamarios hiperplásicos, metaplásicos o atípicos pueden desarrollarse hasta cánceres (ver, por ejemplo, Ellis I.O. y col., Tumors of the Breast, capítulo 16 (páginas 86-9) de Diagnostic Histopathology of Tumors, volumen 1, editado por Fletcher C.D.M., segunda edición, Churchill Livingstone (00), expuesto en detalle más adelante, así como Fabian C.J. y col., Beyond tamoxifen new endpoints for breast cancer chemoprevention, new drugs for breast cancer prevention, Ann NY Acad Sci Diciembre de 01; 92:44-9); (2) los tejidos intestinales hiperplásicos, como pólipos, pueden transformarse en carcinomas (ver, por ejemplo, Der, R. y col. Gastric Neoplasms, capítulo (páginas -144) de Chandraspma, P., Gastrointestinal Pathology, Appleton & Lange (1999), en particular páginas 6-7; (3) la hiperplasia epitelial oral y orofaríngea indica una lesión precancerosa. Sunaga H. y col. Expression of granulocyte colony-stimulating factor receptor and platelet-derived endothelial cell growth factor in oral and oropharyngeal precancerous lesions. Anticancer Res Julio-Agosto de 01; 21(4B):2901-6; (4) el tejido hiperplásico endometrial es un tejido precanceroso. Sivridis E. y col., Prognostic aspects on endometrial hyperplasia and neoplasia, Virchows Arch Agosto de 01; 439(2):118-26, y () la hiperplasia de células renales y prostáticas se ha documentado como un factor conducente al desarrollo de células cancerosas. Van Poppel H. y col., Precancerous lesions in the kidney Scand J Urol Nephrol Supl 00; (): Las mamas (sinónimo de glándulas mamarias) de la mujer son glándulas sudorípara apocrinas altamente modificadas con la función especializada de proporcionar nutrientes al lactante recién nacido. La mama consiste en tejido glandular epitelial del tipo túbulo-alveolar, tejido conjuntivo fibroso (estroma) circundante al tejido glandular y tejido adiposo interlobular. La inervación de la mama procede de las ramas anterior y lateral de los nervios intercostales cuarto al sexto, que transportan fibras eferentes sensoriales y simpáticas. Las actividades secretoras del tejido glandular están controladas principalmente por hormonas ováricas e hipofisarias en más que por fibras motoras eferentes. En la mujer, las mamas se desarrollan en la pubertad y retroceden en la menopausia. Durante el embarazo, los componentes secretores de la mama se expanden notablemente en tamaño y número como preparación para la lactancia. Cada mama consta de a 2 unidades glandulares independientes denominadas lóbulos mamarios, cada una consistente en una glándula túbulo-acinosa compuesta. Cada lóbulo conduce a un conducto lactífero que converge con los otros en el pezón. Los lóbulos están embebidos en una masa de tejido adiposo que se subdivide por tabiques de colágeno. Una zona especializada de piel, la areola, rodea a la base del pezón. La mama descansa en la fascia pectoral profunda, que a su vez se sobrepone al músculo pectoral y el músculo serrato anterior. El cáncer de mama es el cáncer más común en las mujeres (excluyendo el cáncer de piel y de pulmón) y en los Estados Unidos en 1999, más de mujeres recibieron un diagnóstico de cáncer de mama y se estima que de este número aproximadamente 43.0 morirán por la enfermedad. El cáncer de mama es la causa de la muerte de aproximadamente.000 mujeres cada año en los Estados Unidos. En los Estados Unidos, el cáncer de mama representa el 29% de todos los cánceres en mujeres. Se ha estimado que una mujer de cada ocho desarrollará cáncer de mama en algún momento de su vida. Aunque la detección precoz produce unas tasas de curación más altas, el cáncer de mama sigue siendo la causa principal de muerte por cáncer en mujeres adultas de menos de 4 años de edad y la segunda causa más común después de los 4 años. Entre mujeres de todas las edades, el cáncer de mama es la segunda causa de muerte por cáncer, sólo después del cáncer de pulmón, en mujeres. Menos del 1% de todos los casos de cáncer de mama se dan en hombres. Los tumores de mama benignos pueden incluir cambio fibroquístico, fibroadenoma y variantes, lesiones esclerosantes, papiloma (una estructura compuesta de núcleos fibrovasculares cubiertos por epitelio) y enfermedad mamaria proliferativa. Se cree que los quistes surgen a partir de un proceso de involución lobular. Un quiste es un saco dilatado patológicamente revestido de epitelio y que contiene fluido. Se reconocen dos formas principales de quiste mamario, los quistes revestidos por una capa de epitelio y la forma más común de quiste que está revestida por epitelio de tipo apocrino, que se asemeja al epitelio de las glándulas sudoríparas apocrinas normales. Se cree que los quistes surgen a partir de un proceso de involución lobular y son muy comunes, apareciendo en el 19% aproximadamente de la pobla- 2

3 ción general y siendo palpables en el 7%. El tratamiento suele hacerse por aspiración. Los quistes pueden encontrarse en el 77% aproximadamente de mamas portadoras de cáncer (Ellis y col., página 866). La capa epitelial apocrina de un quiste mamario puede mostrar hiperplasia. Además, la metaplasia apocrina es un hallazgo frecuente en la mama y generalmente se asocia con formación de quistes. Además, la metaplasia apocrina puede asociarse con otras dolencias benignas no quísticas de las glándulas mamarias, incluyendo adenosis esclerosante (la adenosis es un número aumentado o un agrandamiento de los componentes glandulares), papilomas y fibroadenomas. Significativamente, el cambio apocrino (atipia), que no es un trastorno inflamatorio, se contempla como indicativo como un tipo de tejido precanceroso que presenta para el paciente un riesgo significativamente aumentado de desarrollo posterior de carcinoma de mama, como carcinoma apocrino o carcinoma medular. Finalmente, la hiperplasia epitelial, la hiperplasia ductal y la hiperplasia lobular se contemplan todas también como una afección precancerosa del tejido mamario, todo lo cual apunta a un riesgo de desarrollar cáncer de mama. Ellis I.O. y col., Tumors of the Breast, más arriba, en particular páginas , 881 y 884. Así, es evidente que los cambios proliferativos o fibroquísticos benignos (enfermedad fibroquística), así como la hiperplasia, se han identificado como marcadores morfológicos de riesgo para el desarrollo de carcinoma de mama. Rosen, P.R., Rosen s Breast Pathology, segunda edición, Lippincott Williams & Wilkins (01), capítulo ( Precancerous Breast Disease ), páginas , en particular páginas y Las mutaciones génicas son responsables del % aproximadamente del cáncer de mama familiar. El síndrome de Li-Fraumeni es un raro síndrome hereditario asociado con una incidencia aumentada de neoplasias de mama, encéfalo y suprarrenales, así como sarcomas, linfomas y leucemias. Se cree que la causa de este síndrome se asocia con mutación del gen p3, que es un gen supresor de tumores. El cáncer de mama puede caracterizarse como una proliferación maligna de células epiteliales que revisten los conductos o lóbulos de la mama. Generalmente se cree que el cáncer de mama es dependiente de las hormonas, ya que las mujeres sin ovarios funcionales y que nunca reciben sustitución de estrógenos aparentemente no desarrollan normalmente cáncer de mama. Los tumores malignos pueden surgir de cualquiera de las estructuras mamarias. Los carcinomas ductales son los más comunes, seguidos por los carcinomas lobulares y malignidades que surgen de otros tejidos conjuntivos. El carcinoma ductal invasivo (infiltrante) es el tipo celular más común, que comprende del 70% al 80% de todos los casos de cáncer de mama. Los tumores aparecen en todo el intervalo de edad del carcinoma de mama, siendo más comunes en mujeres en la mitad o a finales de su quinta década. Se caracteriza por su núcleo sólido, que habitualmente es duro y firme a la palpación. Frecuentemente está presente un carcinoma ductal in situ asociado y puede producirse comedonecrosis en zonas invasivas y zonas de carcinoma intraductal. El carcinoma ductal invasivo se extiende comúnmente a los nódulos linfáticos regionales y comporta el peor pronóstico entre los diversos tipos ductales. Los grados nuclear e histológico han demostrado ser eficaces predictores de pronóstico. El carcinoma ductal in situ (CDIS) consiste en células epiteliales malignas confinadas en los conductos mamarios, sin evidencia microscópica de invasión a través de la membrana basal hacia el tejido circundante. Según la diferenciación tumoral, el CDIS puede dividirse a su vez en grado bajo, intermedio y alto. Dicha estratificación tiene implicaciones de pronóstico. Existen cinco subtipos histológicos de CDIS, que son comedo, papilar, micropapilar, cribiforme y sólido. El subtipo comedo comporta la mayor probabilidad de alto grado nuclear, microinvasión y sobreexpresión del oncogén her-2/neu. La anomalía mamográfica más característica asociada con CDIS es microcalcificaciones en racimo. Se han propuesto nuevos sistemas de clasificación que usan una combinación de arquitectura, grado nuclear y necrosis. El carcinoma lobular invasivo es relativamente infrecuente, comprendiendo sólo del % al % de los tumores de mama. Los carcinomas lobulares invasivos se caracterizan por una mayor proporción de multicentricidad en la misma mama o en la opuesta. Las lesiones suelen tener márgenes mal definidos, y ocasionalmente la única evidencia es un sutil engrosamiento o induración. Los pacientes con carcinoma lobular infiltrante son especialmente propensos a tener carcinoma bilateral. Fase por fase, el carcinoma lobular invasivo tiene un pronóstico similar al carcinoma ductal infiltrante. El carcinoma lobular in situ (CLIS) carece generalmente de signos clínicos o mamográficos específicos, y se da más frecuentemente en mujeres premenopáusicas. Por definición, estas células cancerosas están confinadas a los lóbulos mamarios sin invasión. El CLIS se caracteriza microscópicamente por una proliferación sólida de células pequeñas. Las células tienen una tasa proliferativa baja, son normalmente positivas para receptores estrogénicos y raramente sobreexpresan el oncogén her-2/neu. Dado que en esta enfermedad se ha informado de riesgo de bilateralidad, algunos investigadores han recomendado tratamiento con mastectomía simple bilateral con reconstrucción mamaria. Si se elige una espera vigilante, es imperativa la observación durante toda la vida, ya que el riesgo aumentado de cáncer de mama persiste indefinidamente. El carcinoma tubular se conoce también como un carcinoma bien diferenciado. La frecuencia de metástasis en los nódulos linfáticos axilares es aproximadamente del %, menor que la del carcinoma ductal. El pronóstico es considerablemente mejor que en el carcinoma ductal invasivo. El carcinoma medular se caracteriza por un infiltrado linfocitario prominente. Los pacientes con carcinoma medular suelen ser más jóvenes que las de otros tipos de cáncer de mama. Se cree también que el pronóstico es mejor que en el cáncer ductal invasivo. El carcinoma de mama inflamatorio se caracteriza por edema cutáneo difuso, enrojecimiento de la piel y la mama y firmeza del tejido subyacente sin una masa palpable. La manifestación clínica se debe principalmente a embolización 3

4 tumoral a linfáticos dérmicos (canales linfáticos de la piel) con congestión asociada de capilares superficiales. El cáncer de mama inflamatorio comporta un mal pronóstico y se trata preferentemente por escisión La enfermedad de Paget del pezón es una forma rara de cáncer de mama que se caracteriza clínicamente por cambios eccematoides del pezón. Se cree que la enfermedad de Paget representa la migración de células malignas de conductos mamarios subyacentes en el pezón. El pronóstico de pacientes con enfermedad de Paget parece ser similar al de mujeres con otros tipos de carcinoma de mama, fase for fase. Los tumores de mama benignos incluyen fibroademoma, fibromas periductales (un tumor del tejido conjuntivo), tumor epitelial intraductal, quistes de retención, lipomas (tumor graso), mastitis quística crónica y necrosis grasa. Con la máxima frecuencia se producen durante el período reproductor de la vida o justo después. A menudo son difíciles de distinguir de los tumores malignos y deben vigilarse por si presentan cambios de tamaño, o afectación linfática, en cuyo caso el crecimiento debe escindirse y examinarse. Las mamografías, ecografías, termografía y aspiración de formas quísticas pueden ayudar en el diagnóstico. Un diagnóstico de cáncer de mama puede realizarse mediante un examen patológico del tejido mamario. Todo bulto en la mama justifica habitualmente una biopsia aun cuando la mamografía se describa como normal. El tejido mamario puede obtenerse mediante biopsia de aspiración por aguja o biopsia quirúrgica. Algunos médicos usan la aspiración por aguja como ayuda para diferenciar entre quistes y tumores sólidos. Los quistes desaparecen frecuentemente después de la aspiración y la extracción de fluido. Los exámenes citológicos o patológicos de material extraído en la aspiración pueden usarse para identificar el cáncer. La ecografía puede ayudar a determinar si el bulto es sólido o quístico. También puede usarse RMI de la mama. La biopsia escisional, el procedimiento realizado más comúnmente, se usa cuando los bultos son pequeños. En estos casos, se escinde todo el tumor y un margen de tejido normal. Si el tumor es grande, puede realizarse biopsia incisional para extraer una pequeña cantidad de tejido para examen patológico. El tejido obtenido de la biopsia quirúrgica puede evaluarse mediante sección congelada, que permite un diagnóstico en minutos y puede estar seguido por cirugía definitiva; pero la mayoría de los cirujanos esperan a una sección permanente, que lleva aproximadamente entre 24 y 48 horas. El último enfoque da tiempo a el paciente para hablar de las opciones de tratamiento con el médico y es el enfoque más común. La ruta más común de extensión del cáncer de mama es hacia los nódulos linfáticos axilares. Aproximadamente del al % de los pacientes con cáncer de mama tienen ya nódulos axilares positivos (afectados por la enfermedad) cuando el tumor es palpable. Cuanto mayor es el número de nódulos axilares afectados, más alto es el riesgo de micrometástasis (células tumorales indetectables clínicamente) en otros puntos y de recaída o recurrencia. Los sitios comunes de recurrencia de cáncer de mama son recurrencia local en el sitio original en la mama o difusión a distancia al hueso, el hígado, el pulmón y el encéfalo. Algunas complicaciones de enfermedad metastásica incluyen compresión de la médula espinal, fracturas óseas patológicas, derrame pleural y obstrucción bronquial. Los cánceres de mama se dividen según el tipo celular, con tipos que varían en incidencia, patrones de crecimiento y metástasis y supervivencia. El carcinoma ductal infiltrante es el tipo de cáncer de mama más común, suponiendo aproximadamente el 70% de los tumores. Los raros cánceres de mama inflamatorios (del 1 al 4% de los casos de cáncer de mama) se asocian con el peor pronóstico. El carcinoma in situ (CIS) es un cáncer no invasivo que tiene un pronóstico excelente y que a menudo puede detectarse por mamografía cuando no hay nada palpable significativo. Las recomendaciones de tratamiento difieren dependiendo del tipo y la fase de enfermedad en el momento del diagnóstico. La enfermedad en fase I o II se trata generalmente por mediante cirugía de conservación de la mama, e irradiación, o mastectomía radical modificada con o sin reconstrucción mamaria. La mastectomía e irradiación son tratamientos locales y, obviamente, no afectan a las células cancerosas que se hayan ya metastatizado. Puede suministrarse también quimioterapia adyuvante a pacientes con enfermedad en fase precoz que tengan un riesgo alto de desarrollar enfermedad metastásica. En pacientes con receptores de estrógenos positivos, en la actualidad la quimioterapia adyuvante o el tamoxifeno se consideran un tratamiento convencional. El papel de la ablación ovárica de supresión para pacientes positivas para RE premenopáusicas se encuentra bajo investigación clínica. Un nódulo linfático centinela es el primer nódulo linfático en la ruta de drenaje linfático desde un tumor primario. La biopsia del nódulo linfático centinela después de inyección de radioisótopo (coloide de azufre y tecnecio-99m) y/o colorante de azul vital alrededor del tumor primario o el lecho tumoral comporta menor morbilidad y coste que una disección axilar completa. Esta técnica sigue estando en investigación. Los pacientes con cánceres de mama localmente avanzados (Fase III) tienen un peor pronóstico. Puede conseguirse un buen control local con una combinación de cirugía, quimioterapia e irradiación. La quimioterapia se considera porque los pacientes con enfermedad en fase III están en riesgo de desarrollar metástasis a distancia. Los enfoques de tratamiento para pacientes con enfermedad metastásica o recurrente localmente varían dependiendo del sitio y la extensión de la enfermedad. En muchos casos, se combinan terapias locales y sistémicas. Dado que los pacientes con enfermedad metastásica rara vez exhiben una respuesta duradera a los tratamientos estándar, los investigadores están evaluando el uso de regímenes de quimioterapia de dosis alta seguido de trasplante autólogo de médula ósea (o sustitución con células madre). La cirugía de conservación de la mama consiste en la escisión del tumor y una disección de nódulo linfático axilar parcial (inferior). Para describir la cirugía local se usan frecuentemente los términos lumpectomía, resección segmentaria, tilectomía y mastectomía parcial. La cirugía está seguida normalmente por radioterapia para todas los pacientes con carcinoma invasivo y la mayoría de los pacientes con carcinoma in situ. Estudios recientes de pacientes con tumores pequeños de hasta cm (aproximadamente 2 pulgadas) de tamaño y ausencia de evidencia de enfermedad 4

5 2 3 4 multifocal o cáncer intraductal extensivo no muestran diferencias en la supervivencia entre la cirugía de conservación de la mama seguida de radioterapia y la mastectomía radical modificada. La mastectomía radical modificada es una extirpación de toda la mama más una disección de nódulos axilares. Las desventajas de una mastectomía radical modificada son deformidad estética y posibilidad de problemas psicosociales que afectan a la imagen corporal y a la autoestima. Existen numerosas deficiencias e inconvenientes en las terapias actuales para dolencias mamarias benignas y cánceres de mama. Así, la mastectomía radical modificada da como resultado la pérdida de una parte del cuerpo, imagen corporal alterada, necesidad de una prótesis, cirugía reconstructiva opcional, compresión de la pared torácica y necrosis del colgajo cutáneo. La mastectomía parcial da como resultado disección de nódulos axilares e irradiación, fibrosis mamaria, hiperpigmentación, fracturas costales, edema mamario, cambios en la sensibilidad cutánea, miositis y duración prolongada de la terapia primaria. De hecho, las mastectomías radical y parcial pueden dar como resultado pérdida sensorial, una necesidad de asistencia a la mano y el brazo y complicaciones postoperatorias que pueden incluir seroma, hematoma, infección en la herida, linfedema, debilidad en el brazo, dolor, trastorno psicológico, deterioro en la movilidad del brazo, lesión nerviosa y fatiga. Un seroma es la acumulación de fluido seroso o serosanguíneo en el espacio muerto de la fosa axilar o la pared torácica. Los hematomas pueden retrasar la curación y promover la infección. Los hematomas se producen cuando se acumula sangre en el espacio intersticial y pueden aspirarse al licuarse o reabsorberse con el tiempo sin intervención. La lesión nerviosa puede aparecer a pesar de los esfuerzos quirúrgicos para evitar traumatismos. Los pacientes pueden quejarse de sensaciones de dolor, hormigueo, entumecimiento, pesadez o aumento de la sensibilidad cutánea del brazo o el pecho. Estas sensaciones cambian con el tiempo y habitualmente desaparecen durante o después de un año. Con menor frecuencia, puede producirse atrofia muscular como consecuencia de una lesión nerviosa y dar como resultado una disminución en la función del brazo o el hombro. Dado que pueden quedar células de cáncer de mama clínicamente indetectables después de la escisión local del cáncer, se suministra radioterapia para el control local del tumor. La radioterapia puede usarse también preoperatoriamente para reducir tumores de mama grandes y hacerlos más fácilmente reseccionables. Comúnmente se usa radioterapia paliativa para aliviar el dolor de las metástasis óseas y para el tratamiento sintomático de metástasis en otros lugares, como el encéfalo. La fatiga, las reacciones cutáneas, los cambios en la sensación, color y textura de la piel y la inflamación de la mama son comunes durante e inmediatamente después de una serie de radioterapia en la mama. Pueden usarse quimioterapia, terapia hormonal o una combinación de ambas para paliar los efectos de la enfermedad metastásica. Las recomendaciones para quimioterapia adyuvante y/o terapia hormonal adyuvante se basan habitualmente en el número de nódulos axilares positivos, el estado de la menopausia, el tamaño del tumor primario y el ensayo de receptores de estrógenos. Los fármacos quimioterapéuticos usados más comúnmente son agentes de alquilación, antimetabolitos, antitumorales, antibióticos (Herceptina) y alcaloides de la vinca. La manipulación hormonal se consigue principalmente a través de bloqueantes hormonales e infrecuentemente mediante extirpación quirúrgica de glándulas productoras de hormonas sexuales (ooforectomía, adrenalectomía o hipofisectomía). El tamoxifeno, un antiestrógeno, es el agente hormonal usado más ampliamente. Actualmente se dispone de agentes hormonales de segunda línea, como Femara y Arimidex, para pacientes negativas a RE/RP y/o pacientes en las que fracasa el tamoxifeno. Por desgracia, la quimioterapia para el cáncer de mama tiene numerosos efectos secundarios perjudiciales que incluyen fatiga, ganancia de peso, náuseas, vómitos, alopecia, trastornos del apetito y el gusto, neuropatías, diarrea, supresión de médula ósea, síntomas menopáusicos, pérdida de cabello y ganancia de peso. Además, el fármaco de elección de primera línea, tamoxifeno, puede aumentar el riesgo de cáncer uterino y coágulos sanguíneos. Toxina botulínica 0 6 La bacteria anaerobia gram-positiva Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipeptídica, toxina botulínica, que provoca una enfermedad neuroparalítica en hombres y animales referida como botulismo. Las esporas de Clostridium botulinum están presentes en el suelo y pueden proliferar en recipientes de alimentos esterilizados y sellados de forma inadecuada de envasadoras domésticas, que son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo aparecen normalmente entre 18 y 36 horas después de la ingestión de alimentos infectados con un cultivo o esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica puede pasar aparentemente no atenuada a través de la mucosa del tracto digestivo y ataca a las neuronas motoras periféricas. Los síntomas de intoxicación con toxina botulínica pueden progresar desde dificultad para caminar, deglutir y hablar a parálisis de los músculos respiratorios y la muerte. La toxina botulínica de tipo A es el agente biológico natural más letal que se conoce para el hombre. Aproximadamente 0 picogramos de toxina botulínica (complejo de neurotoxina purificado) de tipo A 1 es una DL 0 en ratones. Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la DL 0 en inyección intraperitoneal en ratones hembra Swiss Webster que pesan de 18 a gramos cada uno. Se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas inmunológicamente distintas, que son respectivamente los serotipos de neurotoxinas botulínicas A, B, C 1, D, E, F y G, cada uno de los cuales se distingue por neutralización con anticuerpos específicos del tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en las especies animales a las que afectan y en la gravedad y duración de la parálisis que provocan. Por ejemplo, se ha 1 Disponible en Allergan, Inc., de Irvine, California, con la marca comercial BOTOX.

6 determinado que la toxina botulínica de tipo A es 00 veces más potente, medida según la tasa de parálisis producida en la rata, que la toxina botulínica de tipo B. Además, se ha determinado que la toxina botulínica de tipo B no es tóxica en primates a una dosis de 480 U/kg, que es aproximadamente 12 veces la DL 0 del primate para toxina botulínica de tipo A. La toxina botulínica se une aparentemente con alta afinidad a neuronas motoras colinérgicas, se transloca en la neurona y bloquea la liberación de acetilcolina. Las toxinas botulínicas se han usado en centros clínicos para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. La toxina botulínica de tipo A ha sido aprobada por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos para el tratamiento de blefarospasmo, estrabismo, espasmo hemifacial y distonía cervical. Los serotipos de toxina botulínica de tipo A tienen aparentemente una menor potencia y/o una duración de actividad más corta en comparación con la toxina botulínica de tipo A. Los efectos clínicos de la toxina botulínica de tipo A intramuscular periférica se observan habitualmente dentro de una semana después de la inyección. La duración normal de alivio sintomático a partir de una sola inyección intramuscular de toxina botulínica de tipo A es en promedio de aproximadamente tres meses. Aunque todos los serotipos de toxinas botulínicas inhiben aparentemente la liberación de la acetilcolina del neurotransmisor en la unión neuromuscular, lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o escindiendo estas proteínas en diferentes sitios. Por ejemplo, los tipos A y E de botulinum escinden la proteína asociada sinaptosómica de 2 kilodalton (kd) (SNAP-2), pero se dirigen a diferentes secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína. Los tipos B, D, F y G de toxina botulínica actúan sobre la proteína asociada a la vesícula (VAMP, también llamada sinaptobrevina), con cada serotipo escindiendo la proteína en un sitio diferente. Finalmente, se ha demostrado que el tipo C 1 de toxina botulínica escinde la sintaxina y SNAP-2. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar a la potencia relativa y/o la duración de acción de los diversos serotipos de toxina botulínica. El peso molecular de molécula de proteína de la toxina botulínica, para los siete serotipos conocidos de toxina botulínica, es de aproximadamente 0 kd. De manera interesante, las toxinas botulínicas son liberadas por bacterias clostridiales como complejos que comprenden la molécula de proteína de toxina botulínica de 0 kd junto con proteínas asociadas no toxinas. Así, puede producirse el complejo de toxina botulínica de tipo A mediante bacteria clostridial como formas de 900 kd, 00 kd y 0 kd. La toxina botulínica de tipos B y C 1 se produce aparentemente como sólo un complejo de 00 kd. La toxina botulínica de tipo D se produce como complejos de 0 kd y 00 kd. Finalmente, los tipos E y F de toxina botulínica se producen sólo como complejos de 0 kd aproximadamente. Se cree que los complejos (es decir, peso molecular mayor que 0 kd aproximadamente) contienen una proteína hemaglutinina no toxina y una proteína no hemaglutinina no tóxica. Estas dos proteínas no toxinas (que junto con la molécula de toxina botulínica comprenden el complejo de neurotoxina relevante) pueden actuar para proporcionar estabilidad frente a la desnaturalización para la molécula de toxina botulínica y protección frente a los ácidos digestivos cuando se ingiere la toxina. Además, es posible que para complejos más grandes de toxina botulínica (peso molecular mayor que 0 kd aproximadamente) se produzca una velocidad de difusión más lenta de la toxina botulínica lejos de un sitio de inyección intramuscular de un complejo de toxina botulínica. Los estudios in vitro han indicado que la toxina botulínica inhibe la liberación inducida de cationes potasio de la acetilcolina y la norepinefrina a partir de cultivos de células primarias de tejido del tallo encefálico. Además, se ha informado de que la toxina botulínica inhibe la liberación provocada de glicina y glutamato en cultivos primarios de neuronas de la médula espinal y que en preparados de sinaptosoma encefálica la toxina botulínica inhibe la liberación de todos los neurotransmisores acetilcolina, dopamina, norepinefrina, CGRP y glutamato. La toxina botulínica de tipo A puede obtenerse estableciendo y cultivando cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador y a continuación recogiendo y purificando la mezcla fermentada según procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente como proteínas monocatenarias inactivas que deben escindirse o mellarse por medio de proteasas para hacerse neuroactivas. Las cepas bacterianas que preparan serotipos A y G de toxina botulínica poseen proteasas endógenas y los serotipos A y G pueden, por tanto, recuperarse a partir de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. En contraste, los serotipos C 1, D y E de toxina botulínica se sintetizan mediante cepas no proteolíticas y, por tanto, están normalmente inactivados cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F se producen mediante cepas proteolíticas y no proteolíticas y, por tanto, pueden recuperarse en forma activa o inactiva. Sin embargo, incluso las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de toxina botulínica de tipo B sólo escinden una parte de la toxina producida. La proporción exacta entre moléculas melladas y no melladas depende de la duración de la incubación y de la temperatura del cultivo. Por tanto, un cierto porcentaje de cualquier preparación de, por ejemplo, la toxina botulínica de tipo B será probablemente inactivo, posiblemente para dar cuenta de la potencia significativamente menor conocida de toxina botulínica de tipo B en comparación con toxina botulínica de tipo A. La presencia de moléculas inactivas de toxina botulínica en una preparación clínica contribuirá a la carga total de proteínas de la preparación, que se ha vinculado con un aumento de la antigenicidad, sin contribuir a su eficacia clínica. Además, se sabe que la toxina botulínica de tipo B tiene, en inyección intramuscular, una duración de actividad más corta y es también menos potente que la toxina botulínica de tipo A para el mismo nivel de dosis. Se ha informado de que la toxina botulínica de tipo A se ha usado en centros clínicos del modo siguiente: (1) aproximadamente de 7 a 20 unidades de BOTOX por inyección intramuscular (músculos múltiples) para tratar distonía cervical; 6

7 (2) de a unidades de BOTOX por inyección intramuscular para tratar líneas glabelares (líneas del entrecejo) ( unidades inyectadas intramuscularmente en el músculo prócero y unidades inyectadas intramuscularmente en cada músculo superciliar corrugador); (3) aproximadamente de a 80 unidades de BOTOX para tratar estreñimiento por inyección intraesfínter del músculo puborrectal; (4) aproximadamente de 1 a unidades por músculo de BOTOX inyectado intramuscularmente para tratar blefarospasmo por inyección del músculo ocular orbicular pretarsiano lateral del párpado superior y el ocular orbicular pretarsiano lateral del párpado inferior; () para tratar estrabismo, se han inyectado intramuscularmente músculos extraoculares con entre aproximadamente 1 y unidades de BOTOX, variando la cantidad inyectada basándose en el tamaño del músculo en el que se va a inyectar y la magnitud de la parálisis muscular deseada (es decir, cantidad de corrección de dioptrías deseada). (6) para tratar espasticidad de las extremidades superiores después de un accidente cerebrovascular por inyecciones intramusculares de BOTOX en cinco músculos diferentes de las extremidades superiores, del modo siguiente: (a) flexor profundo de los dedos: 7, U a U (b) flexor superficial de los dedos: 7, U a U (c) flexor cubital del carpo: U a U (d) flexor radial del carpo: U a U (e) bíceps braquial: 0 U a 0 U. Cada de los cinco músculos indicados se ha inyectado en la misma sesión de tratamiento, de manera que el paciente recibe de 90 U a 3 U de BOTOX en el músculo flexor de la extremidad superior por inyección intramuscular en cada sesión de tratamiento. El éxito de la toxina botulínica de tipo A para tratar una diversidad de dolencias clínicas ha llevado al interés en otros serotipos de toxina botulínica. Se ha realizado un estudio de dos preparaciones de botulinum de tipo A disponibles comercialmente (BOTOX y Dysport ) y de preparaciones de toxinas botulínicas de tipo B y F (las dos obtenidas de Wako Chemicals, Japón) para determinar la eficacia de debilitamiento de músculo local, la seguridad y el potencial antigénico. Las preparaciones de toxina botulínica se inyectaron en la cabeza del músculo gastrocnemio derecho (de 0, a 0,0 unidades/kg) y se evaluó la debilidad muscular usando el ensayo de valoración de abducción de dedos (VAD) en ratones. Se calcularon los valores de DE 0 a partir de las curvas de dosis-respuesta. Se proporcionaron inyecciones intramusculares a ratones adicionales para determinar las dosis DL 0. Se calculó el índice terapéutico como DL 0 /DE 0. Grupos separados de ratones recibieron inyecciones de BOTOX en las extremidades posteriores (de,0 a,0 unidades/kg) o toxina botulínica de tipo B (de 0,0 a 0,0 unidades/kg), y se probó la debilidad muscular y el aumento en el consumo de agua, siendo el último un posible modelo de boca seca. Se evaluó el potencial antigénico mediante inyecciones intramusculares mensuales en conejos (1, ó 6, ng/kg para toxina botulínica de tipo B o 0, ng/kg para BOTOX ). La debilidad muscular máxima y la duración se relacionaron con las dosis para todos los serotipos. El consumo de agua fue mayor en ratones inyectados con toxina botulínica de tipo B que con BOTOX, aunque la toxina botulínica de tipo B fue menos eficaz en el debilitamiento de los músculos. Después de cuatro meses de inyecciones, 2 de 4 (entre los tratados con 1, ng/kg) y 4 de 4 (entre los tratados con 6, ng/kg) conejos desarrollaron anticuerpos contra la toxina botulínica de tipo B. En un estudio independiente, 0 de 9 conejos tratados con BOTOX mostraron anticuerpos contra la toxina botulínica de tipo A. Los resultados de VAD indican potencias máximas relativas de toxina botulínica de tipo A iguales a la toxina botulínica de tipo F, y las de toxina botulínica de tipo F mayores que las de toxina botulínica de tipo B. En lo relativo a la duración del efecto, la toxina botulínica de tipo A fue mayor que la toxina botulínica de tipo B, y la duración del efecto de toxina botulínica de tipo B fue mayor que la toxina botulínica de tipo F. Según se muestra en los valores de los índices terapéuticos, las dos preparaciones comerciales de toxina botulínica de tipo A (BOTOX y Dysport ) son diferentes. La conducta observada de consumo de agua aumentado después de inyección en la extremidad posterior de toxina botulínica de tipo B indica que cantidades clínicamente significativas de este serotipo entraron en la circulación sistémica murina. Los resultados indican también que para conseguir una eficacia comparable a la toxina botulínica de tipo A, es necesario aumentar las dosis de los otros serotipos examinados. La dosificación aumentada puede comprender seguridad. Además, en los conejos, el tipo B fue más antigénico que con BOTOX, posiblemente por la mayor carga proteínica inyectada para conseguir una dosis eficaz de toxina botulínica de tipo B. Se sabe del uso de una toxina botulínica para tratar: dolor intratecal (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº ); paragangliomas (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº ); trastornos óticos (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº ); trastornos pancreáticos (ver, por ejemplo, patentes de EE.UU. nº y ); migraña (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº ); trastornos del músculo liso (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº ); trastornos prostáticos, incluyendo hiperplasia prostática (ver, por ejemplo, documento WO-99/ y Doggweiler R. y col., Botulinum toxin type A causes diffuse and highly selective atrophy of rat prostate, Neurourol Urodyn 1998; 17(4):363); trastornos nerviosos autónomos, incluyendo glándulas sudoríparas hi- 7

8 perplásicas (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº.766.6); curación de heridas (ver, por ejemplo, documento WO-00/24.419); pérdida de cabello reducida (ver, por ejemplo, documento WO-00/62.746); lesiones cutáneas (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº ) y trastornos inflamatorios neurogénicos (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº ). La patente de EE.UU describe de modo superficial en la columna 6 líneas 39 a 42 el tratamiento de la sinovitis vellonodular pigmentada de la dolencia articular inflamatoria y un tipo particular de cáncer articular, el sarcoma de células sinoviales. La columna 6, línea 3 de la patente de EE.UU. nº describe también, sin más explicación, que los tumores pueden tratarse. Además, se ha descrito que las toxinas botulínicas diana (es decir, con fracción de unión no nativa) pueden usarse para tratar diversas dolencias (ver, por ejemplo, patente de EE.UU. nº.989.4, así como los documentos WO- 96/33.273; WO-99/17.806; WO-98/07.864; WO-00/7.897; WO-01/21.213; WO-00/.98). Se ha inyectado una toxina botulínica en el músculo pectoral para controlar el espasmo pectoral. Ver, por ejemplo, Senior M., Botox and the management of pectoral spasm alter subpectoral implant insertion, Plastic and Recon Surg, julio de 00, Se han descrito formulaciones estables líquidas y formulaciones de toxina botulínica pura (ver, por ejemplo, el documento WO-00/.24 y el documento WO ), así como la aplicación tópica de una toxina botulínica (ver, por ejemplo, documento DE ). Acetilcolina Normalmente o en general, solamente se libera un solo tipo de neurotransmisor de molécula pequeña por cada tipo de neurona en el sistema nervioso de mamífero. El neurotransmisor acetilcolina es secretado por neuronas en muchas zonas del encéfalo, pero específicamente por las células piramidales grandes de la corteza motora, por varias o diferentes neuronas en los ganglios basales, por las neuronas motoras que inervan los músculos esqueléticos, por las neuronas preganglionares del sistema nervioso autónomo (simpático y parasimpático), por las neuronas posganglionares del sistema nervioso parasimpático y por algunas de las neuronas posganglionares del sistema nervioso simpático. Esencialmente, sólo las fibras nerviosas simpáticas posganglionares a las glándulas sudoríparas, los músculos piloerectores y algunos vasos sanguíneos son colinérgicos y la mayoría de las neuronas posganglionares del sistema nervioso simpático secretan el neurotransmisor norepinefrina. En la mayoría de los casos, la acetilcolina tiene efecto excitador. Sin embargo, se sabe que la acetilcolina tiene efectos inhibidores en algunas de las terminaciones nerviosas parasimpáticas periféricas, como inhibición del corazón por los nervios vagos. Las señales eferentes del sistema nervioso autónomo se transmiten al cuerpo a través del sistema nervioso simpático o el sistema nervioso parasimpático. Las neuronas preganglionares del sistema nervioso simpático se extienden desde los cuerpos celulares simpáticos preganglionares situados en el asta intermediolateral de la médula espinal. Las fibras nerviosas simpáticas preganglionares, que se extienden desde el cuerpo celular, realizan sinapsis con las neuronas posganglionares situadas en un ganglio simpático paravertebral o en un ganglio prevertebral. Como las neuronas preganglionares del sistema nervioso simpático y parasimpático son colinérgicas, la aplicación de acetilcolina a los ganglios excitará las neuronas posganglionares simpáticas y parasimpáticas. La acetilcolina activa dos tipos de receptores, receptores muscarínicos y nicotínicos. Los receptores muscarínicos se encuentran en todas las células efectoras estimuladas por las neuronas posganglionares del sistema nervioso parasimpático, así como en las estimuladas por las neuronas colinérgicas posganglionares del sistema nervioso simpático. Los receptores nicotínicos se encuentran en las sinapsis entre las neuronas preganglionares y posganglionares del simpático y parasimpático. Los receptores nicotínicos están presentes también en muchas membranas de fibras de músculo esquelético en la unión neuromuscular. La acetilcolina se libera a partir de neuronas colinérgicas cuando vesículas intracelulares pequeñas y transparentes se fusionan con la membrana celular neuronal presináptica. Una amplia variedad de células secretoras no neuronales, como médula suprarrenal (así como la línea celular PC12) y células de islotes pancreáticos liberan catecolaminas e insulina, respectivamente, a partir de grandes vesículas de núcleos densos. La línea celular PC12 es un clon de células de feocromocitoma de rata usado extensamente como un modelo de cultivo tisular para estudios de desarrollo simpatosuprarrenal. La toxina botulínica inhibe la liberación de ambos tipos de compuestos de ambos tipos de células in vitro, permeabilizados (por ejemplo, por electroporación) o por inyección directa de la toxina en la célula desnervada. Se sabe también que la toxina botulínica bloquea la liberación del glutamato neurotransmisor a partir de cultivos celulares de sinaptosomas corticales. Amplia distribución del sustrato de toxina botulínica Se sabe que una toxina botulínica puede desnervar células musculares, lo que produce una parálisis flácida debida a inhibición presináptica de liberación de acetilcolina de neuronas en la unión neuromuscular. El dominio proteolítico de una toxina botulínica actúa sobre un sustrato particular en el citosol de células diana, escisión del sustrato impidiendo el ensamblaje de membrana y la exocitosis de vesículas secretoras que contienen acetilcolina. La ausencia de acetilcolina en la hendidura sináptica entre neurona de inervación y célula muscular impide la estimulación de las células musculares y los resultados consiguientes de parálisis. 8

9 2 3 Las toxinas botulínicas son proteasas intracelulares que actúan específicamente en una o más de las tres proteínas diferentes que controlan el ensamblaje de acetilcolina a las vesículas secretoras que la contienen. Estos sustratos específicos para las toxinas botulínicas son sinaptobrevina, sintaxina y/o SNAP-2. Ver, por ejemplo, Duggan M.J. y col., A survey of botulinum neurotoxin substrate expression in cells, Mov Disorder (3); 376:199, y Blasi J. y col., Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the sinaptic protein SNAP-2. Nature 36; 1-163:1993. Para toxina botulínica de tipos B, D, F y G el sustrato intracelular particular es sinaptobrevina. SNAP-2, sinaptobrevina y sintaxina se conocen como SNARE (soluble Nethylmalelimide sensitive factor attachment protein receptors, receptores de proteínas de unión a factor sensible de N-etilmaleimida soluble). Significativamente, no sólo los nervios que inervan músculos contienen el sustrato para las toxinas botulínicas: La presencia de SNAP-2 en regiones presinápticas de numerosos subconjuntos neuronales y en líneas celulares de crestas neurales sugiere que esta proteína favorece una función importante en los tejidos neuronales. Oyler G.A. y col., Distribution and expression of SNAP-2 immunoreactivity in rat brain, rat PC-12 cells and human SMS-KCNR neuroblastoma cells, Brain Res Dev Brain Res 21 de febrero de 1992; 6(2): , Además, La amplia aparición de las proteínas SNARE en células endocrinas sugiere que pueden servir también como marcadores de diagnóstico generales de tumores endocrinos..., Graff L. y col. Expression of vesicular monoamine transporters, sinaptosomal-associated protein 2 and syntaxin 1: a signature of human small cell lung carcinoma, Cancer Research 61, , 1 de marzo de 01, en página Por ejemplo, se sabe que SNAP- 2 está distribuida ampliamente en células neuroendocrinas (incluyendo en células cromafínicas, PC12, GH3 e insulinomas). Además, la sinaptobrevina sustrato de toxina botulínica se ha encontrado en fibroblastos y células mieloides (por ejemplo, mastocitos). Duggan M. y col., más arriba. De hecho, las SNARE influyen en o controlan aparentemente la fusión de membrana de vesículas secretoras en la mayoría, si no todas, las células secretoras. Andersson J. y col., Differential sorting of SNAP-2a and SNAP-2b proteins in neuroblastoma cells, Eur J. Cell Bio 79, :Nov 00. Así, el sustrato para una toxina botulínica no está restringido a células neuronales que liberan el neurotransmisor acetilcolina. Los sustratos de toxina botulínica están, por tanto, implicados ubicuamente en sucesos de fusión membrana-membrana y la evidencia apunta a un mecanismo universal para eventos de fusión de membranas (es decir, para el ensamblaje de vesículas secretoras con la pared celular) (Duggan 199; más arriba). Así, el sustrato intracelular para toxina botulínica tiene una distribución ubicua en células secretoras neuronales y no neuronales. Esto se ilustra claramente por el descubrimiento de la presencia de SNAP-2 (una proteína asociada a sinaptosoma de 2 kilodalton y sustrato para al menos toxina botulínica de tipo A) en al menos: (1) el páncreas (Sadoul K. y col., SNAP-2 is expressed in islets of Langerhans and is involved in insulin release, J. Cell Biology 128; 19-29:199; 4 (2) la hipófisis (Dayanithi G. y col. Release of vasopressin from isolated permeabilised neurosecretory nerve terminals is blocked by the light chain or botulinum A toxin, Neuroscience 1990; 39(3):711-); (3) la médula suprarrenal (Lawrence G. y col. Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the 2-kDa synaptosomal associated protein (SNAP-2) or synaptobrevin by botulinum toxin A or B, Eur J. Biochem 236; :1996); (4) células gástricas (Hohne-Zell B. y col., Functional importance of synaptobrevin and SNAP-2 during exocytosis of histamine by rat gastric enterochromaffin-like cells, Endocrinology 138; 18-26:1997; 0 6 () tumores de pulmón (Graff L. y col., Expression of vesicular monoamine transporters; synaptosomal-associated protein 2 and syntaxin 1: a signature of human small cell lung carcinoma, Cancer Research 61, , 1 de marzo de 01 (los carcinomas de pulmón de células pequeñas (CPCP) contienen SNAP-2); (6) tumores intestinales, Maksymowych A. y col., Binding and transcytosis of botulinum neurotoxin by polarized human colon carcinoma cells, J of Bio. Chem, 273(34); : 1998 (la toxina botulínica se internaliza en las células cancerosas de colon humanas); (7) tumores pancreáticos, Huang, X. y col., Truncated SNAP-2 (1-197), like botulinum neurotoxin A, can inhibit insulin secretion from HIT-T insulinoma cells, Mol. Endo. 12(7); -70:1998 (...se requieren proteínas SNAP- 2 funcionales para secreción de insulina..., ibid en página ). Ver también Boyd R. y col., The effect of botulinum neurotoxins on the release of insulin from the insulinoma cell lines HIT- y RINmF, J. Bio Chem. 270(31); :199, y Cukan M. y col., Expression of SNAP-23 and SNAP-2 in the pancreatic acinar tumor cell line AR42J, Molec Biol Cell (supl.); 398a, nº 2:1999 ( SNAP-2 es una proteína SNARE que media en los eventos exocitóticos en sistemas neuronales y endocrinos ); (8) tumores pituitarios, así como en células pituitarias normales, Majo G. y col., Immunocytochemical analysis of the synaptic proteins SNAP-2 and Rab3A in human pituitary adenomas. Overexpression of SNAP-2 in the mammososmatotroph lineages, J. Pathol Diciembre de 1997; 183(4):4-446; 9

10 (9) neuroblastomas, Goodall A. y col., Occurrence of two types of secretory vesicles in the human neuroblastoma SH-SYSY, J. of Neurochem 68; 42-2:1997. Ver también Oyler, G.A., Distribution and expression of SNAP- 2 immunoreactivity in rat brain, rat PC-12 cells and human SMS-KCNR neuroblastoma cells, Dev. Brain Res. 6 (1992); Obsérvese que Goodall (1992) sólo expone identificación in vitro de ciertas proteínas de ensamblaje en una sola línea celular de neuroblastoma; () células renales (Shukla A. y col., SNAP-2 associated Hrs-2 protein colocalizes with AQP2 in rat kidney collecting duct principal cells, Am J Physiol Renal Physiol Septiembre de 01; 281(3):F46-6 (SNAP-2 participa en exocitosis regulada de células renales), y; (11) células de pulmón normales (Zimmerman U.J. y col., Proteolysis of sinaptobrevin, sintaxin, and SNAP-2 in alveolar epithelial type II cells, IUBMB Life Octubre de 1999; 48(4): 43-8), y (12) todas las células ováricas (Grosse J. y col., Synaptosome associated protein of 2 kilodaltons in oocytes and steroid producing cells of rat and human ovary: molecular analysis and regulation by gonadotropins, Biol Reprod Agosto de 00; 63(2):643-0 (SNAP-2 encontrado en todos los oocitos, y en células esteroidogénicas, incluyendo células granulosas (CG) de grandes folículos antrales y células lúteas. Tejido colinérgico de glándulas mamarias Diversas células de glándulas mamarias hiperplásicas y neoplásicas están influidas por mecanismos colinérgicos. Así, se ha descubierto que existe un mecanismo colinérgico en la actividad de las células alveolares. Balakina G.B. y col., Localization of choline acetyltransferase in the alveolar portion of the mammary gland of the white mouse, Arkh Anat Gistol Embriol Abril de 1986; 90(4):73-7. Además, existe una influencia colinérgica sobre displasia mamaria (fibroquistes) y tejidos de carcinoma mamario (Dorosevich A.E. y col., Autonomic nerve endings and their cell microenvironment as one of the integral parts of the estromal component in breast dysplasia and cancer, Arkh Patol Noviembre-Diciembre de 1994; 6(6):49-3), así como una estimulación colinérgica directa de células de músculo liso en arterias mamarias (Pesic S. y col., Acetylcholine-induced contractions in the porcine internal mammary artery; possible role of muscarinic receptors, Zentralbl Veterinarmed A Octubre de 1999; 46(8): 09- ). Significativamente, un aumento de acetilcolina debido a inhibición de colinesterasa se ha implicado en el aumento de proliferación de células mamarias seguido del desarrollo de carcinomas mamarios. Cabello G. y col., A rat mammary tumor model induced by the organophosphorous pesticides parathion and malathion, possibly through acetylcholinesterase inhibition, Environ Health Perspect, mayo de 01; 9(): Así, una disminución en la proliferación de células cancerosas de mama parece estar mediada por un mecanismo colinérgico. Panagiotou S., Opioid agonists modify breast cancer cell proliferation by blocking cells to the G2/M phase of the cycle: involvement of cytoskeletal elements, J Cell Biochem, 1 de mayo de 1999; 73(2):4-11. Médula suprarrenal Las glándulas adrenales o suprarrenales son pequeñas estructuras de forma triangular situadas en la parte superior de los riñones. Cada glándula suprarrenal comprende una corteza suprarrenal o parte exterior y una médula suprarrenal o parte interior. La corteza rodea y contiene a la médula. La corteza suprarrenal secreta las hormonas cortisol y aldosterona. El cortisol se produce durante momentos de estrés, regula el uso de azúcar y es esencial para el mantenimiento de la presión arterial normal. La aldosterona es uno de los principales reguladores del equilibrio de sales, potasio y agua. Si se extraen las dos glándulas suprarrenales, es obligatoria una terapia de sustitución de cortisol y aldosterona. La médula suprarrenal secreta las catecolaminas adrenalina (sinónimo, epinefrina) y noradrenalina (sinónimo, norepinefrina). Estas hormonas son importantes para la regulación normal de una diversidad de funciones corporales, incluyendo reacción ante estrés, cuando causan un aumento en la presión arterial, la capacidad de bombeo del corazón y el nivel de azúcar en sangre. La extirpación de la médula suprarrenal tiene como resultado una deficiencia hormonal pequeña o inexistente, ya que otras glándulas del cuerpo pueden compensarlo. Al contrario, una producción excesiva de catecolamina puede poner en riesgo la vida. En el varón adulto normal, aproximadamente el 8% de la catecolamina total formada en la médula suprarrenal es adrenalina, siendo el % restante noradrenalina. Existen aproximadamente 1,6 mg de catecolamina presentes por gramo de tejido medular. La mayoría de la noradrenalina presente en sangre y orina no procede de la médula suprarrenal sino de las terminaciones nerviosas simpáticas posganglionares. Si se coloca glándula suprarrenal recién seccionada en fijadores que contienen dicromato de potasio, la médula se vuelve parda y esto se refiere como reacción cromafínica, así llamada para sugerir la afinidad del tejido de médula suprarrenal por las sales de cromo. Por ello, las de la médula suprarrenal se denominan a menudo células cromafínicas. Las células cromafínicas existen también fuera de la médula suprarrenal, pero habitualmente secretan sólo noradrenalina, no adrenalina. La médula suprarrenal puede verse como un ganglio simpático inervado por fibras nerviosas colinérgicas preganglionares. Estas fibras nerviosas liberan acetilcolina que causa secreción de catecolaminas (principalmente, adrenalina) por un procedimiento de exocitosis a partir de las células cromafínicas de la médula suprarrenal. La médula suprarre-

11 nal normal está inervada por el nervio esplácnico, una rama colinérgica preganglionar del sistema nervioso simpático. La actividad de la médula suprarrenal está casi totalmente bajo dicho control nervioso colinérgico. Tumores celulares cromafínicos Las células cromafínicas (incluyendo las células cromafínicas de la médula suprarrenal) y las células de ganglio simpático tienen mucho en común, ya que las dos proceden de un ancestro embrionario común, el simpatagonio de la cresta neural, según se muestra esquemáticamente a continuación. Los ejemplos de los tipos de neoplasias que pueden surgir de cada uno de estos tipos celulares se muestran entre paréntesis. Cada uno de los tipos celulares mostrados puede secretar potencialmente catecolaminas Mientras que la mayoría de las neoplasias de células cromafínicas tienen lugar en la médula suprarrenal, se conocen tumores de células cromafínicas de localización ectópica y múltiple, que se producen con la máxima frecuencia en niños. 1. Paragangliomas Un paraganglio (sinónimo, cuerpo cromafínico) puede encontrarse en el corazón, cerca de la aorta, en el riñón, el hígado, las gónadas y otros lugares y comprende células cromafínicas que aparentemente se originan en las células de la cresta neural y que han migrado a una asociación estrecha con células de ganglios del sistema nervioso autónomo. Un paraganglioma es una neoplasia constituida por células cromafínicas derivadas de un paraganglio. Un paraganglioma de cuerpo carotídeo se refiere como un paraganglioma carotídeo, mientras que un paraganglioma de médula suprarrenal se denomina feocromocitoma o cromafinoma. El cuerpo carotídeo se observa a menudo como una estructura redonda de color pardo-rojizo a bronceado encontrada en la adventicia de la arteria carótida común. Puede localizarse en la pared posteromedial del vaso en su bifurcación y está unido por un ligamento de Ayer a través del cual los vasos de irrigación discurren principalmente desde la carótida externa. Un cuerpo carotídeo normal mide de 3 a mm de diámetro. La inervación aferente parece proporcionarse a través del nervio glosofaríngeo (el noveno nervio craneal). El nervio glosofaríngeo suministra fibras motoras a las fibras secretomotoras parasimpáticas estilofaríngeas a las fibras sensoriales y de glándulas parótidas, entre otras, la cavidad timpánica, la superficie interior del paladar blando y las amígdalas. Histológicamente, el cuerpo carotídeo incluye células (principales) de Tipo I con citoplasma copioso y núcleo redondo u oval grande. El citoplasma contiene densos gránulos de núcleo que aparentemente almacenan y liberan catecolaminas. El cuerpo carotídeo normal es responsable de detectar cambios en la composición de la sangre arterial. Los paragangliomas carotídeos son tumores raros en general, pero son la forma más común de paraganglioma de cabeza y cuello. El tratamiento de elección para la mayoría de los paragangliomas de los cuerpos carotídeos es la escisión quirúrgica. Sin embargo, dada su posición muy próxima a vasos y nervios importantes existe un riesgo muy real de morbilidad (principalmente déficits de nervios craneales X-XII y lesiones vasculares) y mortalidad, que se estima en el 3 al 9%. El tamaño del tumor es importante porque los mayores de cm de diámetro tienen una incidencia marcadamente superior de complicaciones. Se suministran bloqueantes alfa y beta adrenérgicos perioperatorios (si el paraganglioma carotídeo está secretando catecolaminas) o menos preferentemente embolización angiográfica preoperatoriamente. La radioterapia, en solitario o en combinación con cirugía, es una segunda consideración y un 11

12 área de cierta controversia. Por desgracia, debido a la posición y/o el tamaño, los paragangliomas, incluyendo los paragangliomas carotídeos, pueden ser inoperables Feocromocitomas Los feocromocitomas se producen en la médula suprarrenal y causan síntomas clínicos relacionados con exceso de producción de catecolamina, incluyendo alta presión arterial repentina (hipertensión), dolor de cabeza, taquicardia, sudoración excesiva en reposo, el desarrollo de síntomas después de levantarse de repente desde una posición inclinada hacia delante y ataques de ansiedad. Las técnicas de imagen abdominal y la recogida de orina de 24 horas para catecolaminas son habitualmente suficientes para el diagnóstico. El bloqueo de catecolamina con fenoxibenzamina y metirosina mejora generalmente los síntomas y es necesario para impedir crisis de hipertensión durante la cirugía, la terapia de elección actual. El tratamiento convencional es adrenalectomía laparoscópica, aunque a menudo se usa adrenalectomía parcial para formas familiares de feocromocitoma. Los feocromocitomas malignos (cancerosos) son tumores raros. Se ha estimado que los feocromocitomas están presentes en aproximadamente el 0,3% de los pacientes en evaluación por causas secundarias de hipertensión. Los feocromocitomas pueden ser fatales si no se diagnostican o si se tratan de manera inadecuada. Las series de autopsia sugieren que muchos feocromocitomas no son clínicamente sospechosos y que el tumor sin diagnosticar se asocia claramente a consecuencias mórbidas. La progresión de cambios en la médula suprarrenal puede ir desde una médula suprarrenal normal a hiperplasia medular suprarrenal (un aumento generalizado en el número de células y el tamaño de la médula suprarrenal sin el desarrollo específico de un tumor) hasta un tumor de la médula suprarrenal (feocromocitoma). El tratamiento de un feocromocitoma es la extirpación quirúrgica de una o las dos glándulas suprarrenales. Si es necesario o no extirpar las dos glándulas suprarrenales dependerá de la extensión de la enfermedad. Los pacientes que tienen las dos glándulas suprarrenales extirpadas deben tomar diariamente sustitución de cortisol y aldosterona. El cortisol se sustituye por hidrocortisona, cortisona o prednisona y debe tomarse diariamente. La aldosterona se sustituye por fludrocortisona diaria oral (Florineftm). Se requieren cantidades aumentadas de hidrocortisona o prednisona de sustitución por dichos pacientes durante períodos de estrés, incluyendo fiebre, resfriado, gripe, procedimiento quirúrgico o anestesia. 3. Tumores glómicos Los tumores glómicos (un tipo de paraganglioma) son generalmente neoplasias benignas, que surgen también de tejidos neuroectodérmicos, encontradas en diversas partes del cuerpo. Los tumores glómicos son los tumores benignos más comunes que surgen en el hueso temporal y menos del % de ellos se convierten en malignos y metastatizan. Los tumores glómicos aparecen en los cuerpos glómicos distribuidos a lo largo de nervios parasimpáticos en la base del cráneo, el tórax y el cuello. Existen normalmente tres cuerpos glómicos en cada oído. Los cuerpos glómicos se encuentran habitualmente acompañando al nervio de Jacobsen (CN IX) o de Arnold (CN X) o en la adventicia del bulbo yugular. Sin embargo, la posición física es habitualmente la mucosa del promontorio (glomo timpánico) o del bulbo yugular (glomo yugular). La incidencia de tumores del glomo yugular es de aproximadamente 1: en la población y el asunto más impactante de la epidemiología es la incidencia predominante en las mujeres, siendo la proporción de incidencia mujeres:varones de al menos 4:1. Los tumores que secretan catecolamina (es decir, funcionales) se dan aproximadamente en el 1% al 3% de los casos. Los tumores glómicos tienen el potencial de secretar catecolaminas, similares a la médula suprarrenal que también surge del tejido de la cresta neural y puede secretar también catecolaminas. La contrapartida neoplásica de un tumor gnómico en la glándula suprarrenal es el feocromocitoma, y los tumores gnómicos se han referido como feocromocitoma extrasuprarrenal. Los tumores glómicos que secretan catecolamina pueden causar arritmia, sudor excesivo, dolor de cabeza, náuseas y palidez. Los tumores glómicos pueden surgir en regiones diferentes de la base del cráneo. Cuando se confinan al espacio del oído medio, se conocen como glomo timpánico. Cuando aparecen en la región del foramen yugular, con independencia de su extensión, se denominan glomo yugular. Cuando aparecen en la parte alta del cuello, extendiéndose hacia el foramen yugular, se denominan glomo vagal. Cuando aparecen en la zona de la bifurcación carotídea, se llaman tumores del cuerpo carotídeo. Otros sitios conocidos de tumores glómicos incluyen la laringe, la órbita, la nariz y el arco aórtico. Los tumores del glomo yugular son los tumores más comunes del oído medio. Estos tumores tienden a ser muy vasculares y son irrigados por ramas de la arteria carótida externa. Los síntomas de un tumor del glomo yugular incluyen pérdida de audición con campanilleo pulsátil en el oído, mareo y, a veces, dolor de oído. El paciente puede tener una pérdida de audición debida posiblemente a bloqueo del oído medio, pero también existe una pérdida de audición debida a lesión nerviosa por la masa tumoral. Las parálisis de los nervios craneales de los nervios que controlan la deglución, las arcadas, el encogerse de hombros y el movimiento de la lengua pueden formar todos parte de la presentación de tumores del glomo yugular. Cuando se examina la membrana timpánica, a menudo puede verse 12

13 2 una masa pulsátil roja/azul. Los síntomas son insidiosos al principio. Debido a la posición y a la naturaleza vascular de los tumores, una queja más común es el tinnitus pulsátil. Se cree que el tinnitus es secundario a la compresión mecánica de la prominencia en la mayoría de los casos. Otros síntomas comunes son el abombamiento aural y la pérdida de audición (conductiva). La terapia actual para un tumor glómico secretor de catecolamina es la irradiación y/o ablación quirúrgica, precedida de administración de alfa y beta bloqueantes. El tratamiento de tumores del glomo yugular incluye administración de alfa y beta bloqueantes. Puede usarse terapia de rayos X para mejorar los síntomas incluso si la masa persiste. Es posible también embolizar el tumor con materiales que bloquean su suministro de sangre, aunque a este procedimiento se han asociado problemas con provocación de inflamación del tumor que puede comprimir el tallo encefálico y el cerebelo, así como liberar las catecolaminas de las células que mueren cuando pierden su suministro sanguíneo. La cirugía puede realizarse con pequeños tumores situados apropiadamente. Las complicaciones de cirugía de un tumor del glomo yugular son fuga persistente de líquido cefalorraquídeo del oído y también parálisis de uno de los nervios craneales que controla la cara, el movimiento, la sensación o la audición. Incluso cuando la cirugía pueda tener éxito, los tumores del glomo yugular son un tanto problemáticos porque presentan una alta tasa de recurrencia y pueden requerir múltiples operaciones. La ablación quirúrgica comporta el riesgo de morbilidad debido principalmente a déficits de los nervios craneales iatrogénicos y fugas de LCR. La falta de conservación de nervios craneales es probablemente la objeción más importante a la intervención quirúrgica debido a la morbilidad asociada de déficits de los nervios craneales inferiores. La radioterapia tiene también complicaciones serias, que incluyen osteorradionecrosis del hueso temporal, necrosis encefálica, insuficiencia pituitario-hipotalámica y malignidad secundaria. Otras complicaciones postoperatorias incluyen fugas de LCR, síndromes de aspiración, meningitis, neumonía e infecciones en las heridas. Lo que se necesita, por tanto, es un procedimiento terapéutico eficaz que no sea radioterapia ni ablación quirúrgica para tratar las neoplasias de glándulas mamarias y los tejidos hiperplásicos precancerosos de glándula mamarias. Resumen La presente invención cumple esta necesidad y proporciona un procedimiento terapéutico eficaz que no sea radioterapia ni ablación quirúrgica para tratar diversos tejidos de glándulas mamarias precancerosos y cancerosos. Así, la presente invención comprende la fabricación de un medicamento para tratar tejidos atípicos, como tejidos hiperplásicos, quistes y neoplasias (incluyendo tumores y cánceres) y para prevenir el desarrollo de, o para causar la regresión o remisión de, tejidos atípicos, quistes y neoplasias. En particular, la presente invención comprende la fabricación de un medicamento para tratar trastornos de las glándulas mamarias, como quistes y neoplasias de glándulas mamarias, benignos y cancerosos, así como para tratar células de glándulas mamarias hiperplásicas y/o hipertónicas por administración local de neurotoxina botulínica en o en proximidad del tejido de glándula mamaria afectado. En la presente memoria descriptiva se describe un procedimiento para tratar un trastorno de glándula mamaria por administración local de entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg de una neurotoxina clostridial a una glándula mamaria. La neurotoxina clostridial es una toxina botulínica. Preferentemente, la toxina botulínica se administra en una cantidad de entre aproximadamente 2 U/kg y aproximadamente 0 U/kg. Más preferentemente, la toxina botulínica se administra en una cantidad de entre aproximadamente 1 U/kg y aproximadamente 3 U/kg. La toxina botulínica se selecciona entre el grupo que consiste en toxinas botulínicas de tipos A, B, C, D, E, F y G y la toxina botulínica preferida es toxina botulínica de tipo A. La administración local de la toxina botulínica puede realizarse por implantación de un implante de toxina botulínica en o sobre la glándula mamaria. El trastorno de glándula mamaria se selecciona entre el grupo constituido por tejido mamario precanceroso y cáncer de mama. Así, el trastorno de glándula mamaria puede ser enfermedad quística mamaria. La toxina botulínica puede administrarse localmente por inyección directa de la toxina botulínica en la glándula mamaria. En la presente memoria descriptiva se describe un procedimiento para tratar un trastorno de glándula mamaria por administración local de entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg de una toxina botulínica de tipo A a una glándula mamaria de una paciente humana, y así un trastorno de glándula mamaria. También se describe un procedimiento para tratar un trastorno de glándula mamaria por administración local de una toxina botulínica a una glándula mamaria o en la proximidad de un tejido mamario precanceroso, causando así una reducción en el tamaño y/o actividad de un tejido de glándula mamaria hiperplásico, hipertónico o neoplásico. Este procedimiento puede reducir el diámetro del tejido de glándula mamaria hiperplásico, hipertónico o neoplásico entre aproximadamente el % y aproximadamente el 0%, después de la administración local de la toxina botulínica. Así, un procedimiento para tratar un trastorno de glándula mamaria según se describe en la presente memoria descriptiva puede comprender el paso de administración local de una cantidad terapéutica de una toxina botulínica a un tejido de glándula mamaria hiperplásico, hipertónico o neoplásico, causando así una reducción en el diámetro del tejido de glándula mamaria hiperplásico, hipertónico o neoplásico de entre aproximadamente el % y aproximadamente el 0%. 13

14 Además, se describe un procedimiento para prevenir el desarrollo de una neoplasia de glándula mamaria, comprendiendo el procedimiento el paso de administración local de una toxina botulínica a un tejido de glándula mamaria hiperplásico o hipertónico, reduciendo así una secreción del tejido de glándula mamaria hiperplásico o hipertónico e impidiendo que el tejido de glándula mamaria hiperplásico o hipertónico se desarrolle hasta una neoplasia. En este procedimiento, la toxina botulínica se administra en una cantidad de entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg y la toxina botulínica se selecciona entre el grupo que consiste en toxina botulínica de tipos A, B, C, D, E, F y G. La toxina botulínica puede administrarse localmente por inyección directa de la toxina botulínica en el tejido de glándula mamaria hiperplásico o hipertónico. Para reiterar, un procedimiento para prevenir el desarrollo de una neoplasia de glándula mamaria puede comprender el paso de administración local de una cantidad terapéutica de una toxina botulínica de tipo A al tejido precanceroso de glándula mamaria hiperplásico o hipertónico de una paciente humana, previniendo así el desarrollo de una neoplasia de glándula mamaria. Alternativamente, un procedimiento para prevenir el desarrollo de una neoplasia puede comprender el paso de administración local de entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg de una toxina botulínica a un tejido hiperplásico, en el que la toxina botulínica reduce una secreción del tejido hiperplásico inhibiendo una exocitosis mediada por vesícula del tejido hiperplásico precanceroso, previniendo así el desarrollo del tejido hiperplásico hasta una neoplasia. El tejido hiperplásico puede comprender un sustrato para la toxina botulínica seleccionada del grupo de proteínas de ensamblaje de membrana de vesícula que consisten en una proteína asociada a sinaptosoma de 2 kilodalton (SNAP-2), sinaptobrevina y sintaxina. Además, la toxina botulínica se administra en una cantidad de entre aproximadamente 1 U y aproximadamente.000 U, por ejemplo, entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente 3 U/kg, entre aproximadamente 2 U/kg y aproximadamente 2 U/kg, entre aproximadamente 2 U/kg y aproximadamente U/kg o entre aproximadamente 1 U/kg y aproximadamente U/kg, y la administración local de la toxina botulínica se realiza por implantación de un implante de toxina botulínica en o sobre el cuerpo del tejido mamario. También se describe un procedimiento para prevenir el desarrollo de un carcinoma de glándula mamaria (es decir, previniendo el desarrollo de un tejido mamario precanceroso benigno [aunque hiperplásico, metaplásico o atípico] hasta una neoplasia maligna o carcinoma), comprendiendo el procedimiento el paso de administración local de entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg de una toxina botulínica de tipo A a un tejido mamario hiperplásico, metaplásico o atípico (como un quiste revestido con células apocrinas) de una paciente humana, en el que el tejido mamario comprende un sustrato para la toxina botulínica seleccionada del grupo de proteínas de ensamblaje de membrana de vesícula constituido por una proteína asociada con sinaptosoma de 2 kilodalton (SNAP- 2), sinaptobrevina y sintaxina, y en el que la toxina botulínica actúa sobre el sustrato para reducir una secreción del tejido mamario afectado. La presente invención proporciona un procedimiento para tratar una neoplasia por administración local de entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg de una toxina botulínica a la neoplasia, tratando así la neoplasia ya sea reduciendo el tamaño de la neoplasia y/o reduciendo una secreción de la neoplasia. Un procedimiento según se describe en la presente memoria descriptiva puede realizarse por inyección directa de una toxina botulínica en el cuerpo de una neoplasia o por implantación de un implante de toxina botulínica en o sobre el cuerpo de la neoplasia. Puede aplicarse un procedimiento según se describe en la presente memoria descriptiva para administrar localmente entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg de una toxina botulínica a una neoplasia. U/kg significa unidades de una toxina botulínica por kilogramo de peso total del paciente. La toxina botulínica puede ser uno de los tipos de toxina botulínica A, B, C 1, D, E, F y G, y es preferentemente una toxina botulínica de tipo A por la eficacia clínica conocida de toxina botulínica de tipo A para una serie de indicaciones y por su fácil disponibilidad. Preferentemente, la toxina botulínica se administra en una cantidad de entre aproximadamente 1 U y aproximadamente.000 U (unidades totales, no por kg de peso del paciente). En los intervalos de dosis más altas, la cantidad de toxina botulínica administrada (es decir,.000 unidades) puede administrarse en forma de un sistema de suministro de liberación controlada (es decir, un implante), en el que se liberan cantidades fraccionarias del depósito de toxina botulínica (es decir, aproximadamente unidades de una toxina botulínica de tipo A o aproximadamente 00 unidades de una toxina botulínica de tipo B) a partir del sistema de suministro de liberación controlada durante un período de tres a cuatro meses (sistema de suministro de liberación continua) o se libera a partir del sistema de suministro de liberación controlada de una manera multifásica en ciclos de repetición aproximados de tres a cuatro meses (sistema de suministro de liberación pulsátil). Se describen sistemas de suministro de liberación controlada adecuado para su uso en la presente invención para liberación intra o perineoplásica continua o pulsátil de cantidades terapéuticas de una toxina botulínica en solicitudes pendientes de tramitación de número de serie 09/87.20 titulada Neurotoxin Implant y número de serie 09/ titulada Botulinum Toxin Implant. Preferentemente, la cantidad de una toxina botulínica de tipo A administrada localmente al cuerpo de o a un sitio dentro del cuerpo de la neoplasia según la presente invención puede ser una cantidad entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg. No se espera que menos de aproximadamente 3 U/kg de una toxina botulínica de tipo A dé como resultado una eficacia terapéutica significativa, mientras que puede esperarse que más de aproximadamente U/kg de una toxina botulínica de tipo A dé como resultado una dosis tóxica o casi tóxica de la toxina. En lo 14

15 relativo a una toxina botulínica de tipo B administrada localmente a la neoplasia según la presente invención puede ser una cantidad entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg. No se espera que menos de aproximadamente 3 U/kg de una toxina botulínica de tipo B dé como resultado una eficacia terapéutica significativa, mientras que puede esperarse que más de aproximadamente U/kg de una toxina botulínica de tipo B dé como resultado una dosis tóxica o casi tóxica de la toxina de tipo B. Se ha informado de que aproximadamente unidades/kg, intramusculares, de una preparación de toxina botulínica de tipo B disponible comercialmente se acerque a una dosis letal para primates de toxina botulínica de tipo B. Meyer K.E. y col., A Comparative Systemic Toxicity Study of Neurobloc in Adult and Juvenile Cynomolgus Monkeys, Mov. Disord (Supl 2); 4; 00. En lo relativo a las toxinas botulínicas de tipos C, D, E, F y G, pueden determinarse cantidades para inyección en una neoplasia en un paciente sobre la base de pacientes y no se espera que superen el intervalo de dosis de toxina de tipo B. Preferentemente, la cantidad de una toxina botulínica de tipo A administrada según los procedimientos descritos está entre aproximadamente 2 U/kg y aproximadamente 2 U/kg. Preferentemente, la cantidad de una toxina botulínica de tipo B administrada por un sistema de liberación continua durante un período dado está entre aproximadamente 2 U/kg y aproximadamente U/kg, ya que se ha informado de que menos de aproximadamente U/kg de toxina botulínica de tipo B puede administrarse intramuscularmente a un primate sin efecto sistémico. Ibid. Más preferentemente, la toxina botulínica de tipo A se administra en una cantidad de entre aproximadamente 1 U/kg y aproximadamente U/kg. Con la máxima preferencia, se administra una toxina botulínica de tipo A en una cantidad de entre aproximadamente 1 U/kg y aproximadamente U/kg. En muchos casos, una administración intraneoplásica desde aproximadamente 1 unidad a menos de aproximadamente 0 unidades de una toxina botulínica de tipo A puede proporcionar un alivio terapéutico eficaz y duradero, según se expone en la presente memoria descriptiva. Más preferentemente, puede usarse desde aproximadamente unidades a aproximadamente 7 unidades de una toxina botulínica, como una toxina botulínica de tipo A, y con la máxima preferencia, puede administrarse localmente desde aproximadamente unidades a aproximadamente 0 unidades de una toxina botulínica de tipo A en un tejido de neoplasia objeto con resultados eficaces. Preferentemente, pueden administrarse localmente desde aproximadamente 1 unidades a aproximadamente 0 unidades de una toxina botulínica, como toxina botulínica de tipo A, a un tejido de neoplasia objeto con resultados terapéuticamente eficaces, según se describe en la presente memoria descriptiva. Puede realizarse un procedimiento detallado por administración local de entre aproximadamente 3 U/kg y aproximadamente U/kg de una toxina botulínica de tipo A a una neoplasia de una paciente humana, reduciendo así una secreción de la neoplasia. Administración local significa inyección directa de la neurotoxina en o a la zona local del tejido objeto. Las rutas de administración sistémicas, como rutas de administración oral e intravenosa, se excluyen del ámbito de la presente invención. La toxina botulínica puede ser una toxina botulínica modificada, es decir, la toxina botulínica puede tener al menos uno de sus aminoácidos suprimido, modificado o sustituido, en comparación con una toxina botulínica nativa. Así, la toxina botulínica puede ser una toxina botulínica producida recombinante o un derivado o un fragmento de la misma. Descripción La presente invención se basa en el descubrimiento de que los tejidos hiperplásicos, hipertónicos, quísticos y/o neoplásicos pueden tratarse con una toxina clostridial para reducir o eliminar así la dolencia hiperplásica, hipertónica, quística y/o neoplásica. El tejido tratado puede ser benigno o maligno y la hiperplasia incluye una dolencia hipertónica. La presente invención es, por tanto, aplicable al tratamiento de dolencias que incluyen cáncer de mama, enfermedad quística mamaria, cáncer de pulmón, adenocarcinomas, cáncer ovárico, cánceres oral y orofaríngeo, quistes pancreáticos y cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer del tracto GI, cáncer y quistes testiculares, cáncer de los nódulos linfáticos, cánceres endometriales, así como a tejidos precancerosos hiperplásicos, metaplásicos, atípicos y displásicos de dichos órganos y glándulas. Además, las células (hiperplásicas o hipertónicas) que secretan excesivamente en las que la actividad secretora está controlada o influida por uno o más de los sustratos de toxina botulínica pueden tratarse de manera que impidan el desarrollo del tejido secretor hiperplásico o hipertónico en una neoplasia. En el tejido objeto, se internaliza la cadena ligera proteolítica de la toxina botulínica. Preferentemente, se trata la enfermedad de mama, como tejidos mamarios precancerosos. Aunque la presente invención no está limitada a ningún mecanismo particular, puede conjeturarse que la administración local de una toxina botulínica a un tejido afectado, como un quiste mamario, tiene como resultado tratamiento del quiste (es decir, reducción del [o eliminación total del] tamaño del quiste, y/o de la hiperplasia de células apocrinas) debido a un efecto inhibidor de la toxina en las fibras colinérgicas estimuladoras que inervan las células apocrinas o un efecto directo de la toxina en el quiste tras la internalización de la toxina (o al menos de la cadena ligera de la toxina) por células quísticas. Así, un procedimiento preferido implica que trata un trastorno de glándula mamaria precancerosas, como quistes mamarios, adenosis esclerosante, papilomas, fibroadenomas (lóbulos de hiperplasia) y adenosis ductal roma. Por precanceroso se quiere decir que el tejido mamario afectado no es maligno (es decir, no es canceroso), aunque puede ser hiperplásico, hipertrófico o metaplásico, y que la presencia del tejido precanceroso aumenta el riesgo en el paciente de desarrollo de un cáncer de mama.

16 Así, los tejidos objeto inervados colinérgicamente pueden tratarse por administración local de una toxina botulínica. Por administración local se quiere decir que la neurotoxina se administra directamente o en la proximidad del tejido objeto (es decir, un tejido precanceroso mamario) o la zona de tejido local que se va a tratar. La administración local incluye inyección de la neurotoxina directamente en el tejido afectado. Los tejidos secretores hiperplásicos y/o hipertónicos no cancerosos (benignos), precancerosos, cancerosos (malignos) pueden tratarse. La hiperplasia nodular o difusa que precede al desarrollo tumoral puede tratarse mediante el presente procedimiento. Se ha descubierto que puede usarse una neurotoxina particular, toxina botulínica, con efecto mejorador espectacular para tratar una diversidad de tejidos mamarios precancerosos, con lo que se superan significativamente los procedimientos terapéuticos actuales de cirugía, quimioterapia y radioterapia. Significativamente, puede usarse una sola administración local de la toxina botulínica para tratar con éxito una enfermedad de mama. La ruta de administración y la cantidad de toxina botulínica administrada pueden variar ampliamente según el trastorno particular de las glándulas mamarias que se esté tratando y diversas variables del paciente que incluyen altura, peso, edad, gravedad de la enfermedad y respuesta a la terapia. El procedimiento para determinar la ruta de administración y la dosificación apropiadas se determinan generalmente en una base de caso por caso por parte del médico a cargo. Dichas determinaciones son rutinarias para el experto en la materia (ver, por ejemplo, Harrison s Principles of Internal Medicine (1997), editado por Anthony Fauci y col., 14ª edición, publicado por McGraw Hill). El tratamiento se realiza de manera que evita sustancialmente la entrada de la toxina en la circulación sistémica (es decir, mediante el uso de inyección subcutánea o intramuscular en oposición a administración intravenosa). La dosificación específica apropiada para la administración se determina fácilmente por el experto en la materia según los factores expuestos anteriormente. La dosificación puede depender también del tamaño del tumor que se va a tratar o desnervar y de la preparación comercial de la toxina. Además, las estimaciones para dosificaciones apropiadas en seres humanos pueden extrapolarse a partir de determinaciones de las cantidades de toxina botulínica requeridas para una desnervación eficaz de otros tejidos no neoplásicos. Así, la cantidad de toxina botulínica A que se inyectará es proporcional a la masa y el nivel de actividad del tejido mamario que se va a tratar. Generalmente, puede administrarse entre aproximadamente 0,01 y unidades por kg de peso del paciente de una toxina botulínica, como toxina botulínica de tipo A, para conseguir eficazmente una atrofia de tejido objeto inducida por toxina tras la administración de la neurotoxina sobre o en la proximidad del tejido mamario objeto. Menos de aproximadamente 0,01 U/kg de una toxina botulínica no tienen un efecto terapéutico significativo, mientras que aproximadamente U/kg o 3 U/kg de una toxina botulínica B o A, respectivamente, se aproximan a una dosis tóxica de la toxina botulínica especificada. La colocación cuidadosa de la aguja de inyección y un bajo volumen de neurotoxina usado impiden que cantidades significativas de toxina botulínica aparezcan sistémicamente. Un intervalo de dosis más preferido es de aproximadamente 0,01 U/kg a aproximadamente 2 U/kg de una toxina botulínica como la formulada como BOTOX. La cantidad real de U/kg de una toxina botulínica que se administrará depende de factores como la extensión (masa) y el nivel de actividad del tejido hiperplásico mamario que se va a tratar y la ruta de administración elegida. La toxina botulínica de tipo A es un serotipo preferido de toxina botulínica para su uso en los procedimientos. El sitio principal de acción de toxina botulínica es la unión neuromuscular en la que la toxina se une rápidamente y previene la liberación de acetilcolina. Así, aunque se sabe que las toxinas botulínicas tienen una afinidad de unión conocida para neuronas motoras periféricas presinápticas y colinérgicas, los autores de la invención han descubierto que las toxinas botulínicas pueden unirse también y translocarse en una diversidad de tejidos mamarios precancerosos, en los que la toxina actúa, de la manera conocida, como una endoproteasa en su proteína de ensamblaje de membrana de vesícula secretora respectiva. Dada la baja afinidad de las toxinas botulínicas por ciertos tejidos mamarios, la toxina puede inyectarse preferentemente en tejidos secretores o glandulares para proporcionar una alta concentración local de la toxina. Así, la presente invención es aplicable al tratamiento de tejidos mamarios precancerosos que pueden tener escasa o ninguna inervación colinérgica. La neurotoxina es una toxina botulínica, por ejemplo, una las toxinas botulínicas del serotipo A, B, C, D, E, F o G. Preferentemente, la toxina botulínica usada es toxina botulínica de tipo A, debido a su alta potencia en seres humanos, su fácil disponibilidad y su uso conocido para el tratamiento de trastornos de músculos lisos y esqueléticos cuando se administra localmente por inyección intramuscular. Una ruta para administración de una neurotoxina según la presente invención descrita para tratar un tejido mamario precanceroso puede seleccionarse basándose en criterios como las características de solubilidad de la neurotoxina elegida, así como la cantidad de la neurotoxina que se va a administrar. La cantidad de la neurotoxina administrada puede variar ampliamente según el trastorno particular sometido a tratamiento, su gravedad y otras variables diversas de pacientes que incluyen altura, peso, edad y respuesta a la terapia. Por ejemplo, se cree que la extensión del tejido mamario precanceroso afectada es proporcional al volumen de neurotoxina inyectado, mientras que se cree que la cantidad de la desnervación es, para la mayoría de los intervalos de dosis, proporcional a la concentración de neurotoxina inyectada. Los procedimientos para determinar la ruta de administración apropiada se determinan generalmente sobre una base de caso por caso por parte del médico al cargo. Dichas determinaciones son rutinarias para el experto en la materia (ver, por ejemplo, Harrison s Principles of Internal Medicine (1997), editado por Anthony Fauci y col., 14ª edición, publicado por McGraw Hill). La presente invención incluye dentro de su ámbito el uso de cualquier neurotoxina botulínica que tenga un efecto terapéutico de larga duración cuando se aplica localmente a un tejido mamario precanceroso de una paciente. Todos 16

17 los serotipos de toxina botulínica A, B, C, D, E F y G pueden usarse ventajosamente en la práctica de la presente invención, aunque el tipo A es el serotipo más preferido, según se explica anteriormente. La práctica de la presente invención puede proporcionar atrofia del tejido objeto y remisión durante 27 meses o más en seres humanos Se sabe que la liberación de catecolamina a partir de células de médula suprarrenal permeabilizadas puede inhibirse por una toxina botulínica. Además, se sabe que la liberación de insulina a partir de células secretoras de insulina (por ejemplo, por electroporación) permeabilizadas puede inhibirse por una toxina botulínica. In vitro, las membranas celulares de estas células no nerviosas pueden permeabilizarse para ayudar a la introducción de una toxina botulínica en el citosol de la célula debido a la falta de receptores de superficie celular para una toxina botulínica. Así, la toxina botulínica de tipo B inhibe aparentemente la secreción de insulina escindiendo la sinaptobrevina presente en la línea celular secretora de insulina HIT-. Boyd R.S. y col. The Effect of Botulinum Neurotoxin-B On Insulin Release From a Beta Cell, Mov Disord (3):376 (199). Los autores de la invención argumentan que una toxina botulínica puede bloquear la liberación de cualquier exocitosis mediada por vesícula a partir de cualquier tipo celular secretor (es decir, neuronal, glandular, secretor, cromafínico), siempre que la cadena ligera de la toxina botulínica esté translocada en el medio intracelular. Por ejemplo, la proteína intracelular SNAP-2 está ampliamente distribuida en células secretoras neuronales y no neuronales y la toxina botulínica de tipo A es una endopeptidasa para la que el sustrato específico es SNAP-2. Así, mientras las neuronas colinérgicas tienen un aceptor de alta afinidad por las toxinas botulínicas y tetánicas (y son, por tanto, más sensibles que otras neuronas y otras células a la inhibición de exocitosis mediada por vesícula de compuestos secretores), al elevar la concentración de toxina, las neuronas simpáticas no colinérgicas, las células cromafínicas y otros tipos celulares pueden incorporar una toxina botulínica y mostrar exocitosis reducida. Por ello, mediante la práctica de la presente invención descrita, las fibras nerviosas no colinérgicas, así como las neoplasias secretoras no inervadas o débilmente inervadas, pueden tratarse mediante el uso de una concentración más alta apropiada de una toxina botulínica para producir atrofia terapéutica de neoplasias secretoras (es decir, tratamiento de paragangliomas funcionales [que secretan catecolamina]) y células cromafínicas hiperplásicas. En la médula suprarrenal normal, la tasa de secreción de catecolamina se controla mediante la actividad de los nervios que estimulan las células cromafínicas. Al contrario de la creencia general de que los feocromocitomas no están inervados y de que la liberación de catecolaminas a partir de dichos tumores no está bajo el control nervioso, existe evidencia de inervación colinérgica de dichos tumores. Por ejemplo, la microscopía electrónica ha demostrado un nervio con pequeñas vesículas sinápticas en contacto con células que contienen vesículas de catecolamina. Además, la secreción repentina de catecolaminas a partir de feocromocitomas en la circulación precipitada por una convulsión emocional, hipotensión o hiperventilación apunta a una influencia del sistema nervioso en la secreción. Además, se ha demostrado que la inclinación de un paciente con un feocromocitoma desde la horizontal a una posición recta causa un aumento exagerado en la norepinefrina urinaria no observado en sujetos con dicho tumor y esto puede ser un efecto resultante de (a) un efecto mecánico (es decir, compresión del tumor rico en catecolamina), (b) activación refleja del sistema simpático en que las cantidades aumentadas en el sistema adrenérgico de catecolaminas pueden acumularse en las terminaciones nerviosas de un paciente con un feocromocitoma y/o (b) activación de inervación de feocromocitoma existente. Además, un procedimiento según se describe en la presente memoria descriptiva puede proporcionar función mejorada en el paciente. Función mejorada en el paciente puede definirse como una mejora medida por factores como un dolor reducido, reducción del tiempo pasado en la cama, ambulación aumentada, actitud más saludable, estilo de vida más variado y/o curación permitida por tono muscular normal. La función mejorada en el paciente es sinónimo de una calidad de vida (CDV) mejorada. La CDV puede evaluarse usando, por ejemplo, los procedimientos de valoración de encuesta de salud SF-12 o SF-36. SF-36 evalúa la salud física y mental de un paciente en los ocho dominios de funcionamiento físico, limitación de roles debida a problemas físicos, funcionamiento social, dolor corporal, salud mental general, limitaciones de roles debidas a problemas emocionales, vitalidad y percepciones generales de salud. Las valoraciones obtenidas pueden compararse con los valores publicados disponibles para varias poblaciones generales y de pacientes. Según se ha expuesto anteriormente, los autores de la invención han descubierto que un efecto terapéutico sorprendentemente eficaz y de larga duración puede conseguirse por administración local de una neurotoxina a un tejido mamario precanceroso de un paciente humano. En su forma de realización más preferida, la presente invención se realiza por inyección directa en el tejido objeto o en la zona local del tejido objeto de toxina botulínica de tipo A. Se ha informado de que en la unión neuroglandular, el efecto de desnervación química de una toxina botulínica, como toxina botulínica de tipo A, tiene una duración de acción considerablemente más larga, es decir, de 27 meses frente a 3 meses. La presente invención incluye dentro de su ámbito: (a) complejo de neurotoxina así como neurotoxina pura obtenida o procesada por cultivo bacteriano, extracción de toxina, concentración, conservación, secado por congelación y/o reconstitución; y (b) neurotoxina modificada o recombinante, que es una neurotoxina que ha tenido uno o más aminoácidos o secuencias de aminoácidos deliberadamente eliminados, modificados o sustituidos por procedimientos de modificación de aminoácidos químicos/bioquímicos conocidos o por el uso de tecnologías recombinantes conocidas de vectores recombinantes/células hospedadoras, así como derivados o fragmentos de neurotoxinas así preparados, e incluye neurotoxinas con uno o más restos diana unidos para tipos de células cromafínicas y neoplásicas. 17

18 Las toxinas botulínicas para su uso según la presente invención pueden almacenarse en forma liofilizada o secada al vacío en recipientes a presión de vacío. Antes de la liofilización, la toxina botulínica puede combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, estabilizadores y/o vehículos, como albúmina. El material liofilizado o desecado al vacío puede reconstituirse con solución salina o agua. En cada de los ejemplos siguientes, la cantidad específica de una toxina botulínica administrada depende de una diversidad de factores que han de sopesarse y considerarse dentro de la discreción del médico al cargo y en cada una de las cantidades insignificantes de los ejemplos de toxina botulínica parecen entrar sistémicamente sin efectos secundarios significativos. Las unidades de toxina botulínica inyectadas por kilogramo (U/kg) mostradas a continuación están por kg de peso total del paciente. Por ejemplo, 3 U/kg para un paciente de 70 kg corresponden a una inyección de 2 unidades de la toxina botulínica. Ejemplos 2 Los siguientes ejemplos proporcionan a los expertos en la materia procedimientos preferidos específicos dentro del ámbito de la presente invención para realizar la presente invención y no pretenden limitar el ámbito de lo que los autores contemplan como su invención. En cada uno de los ejemplos siguientes, la cantidad específica de una toxina botulínica (como BOTOX ) administrada depende de una diversidad de factores que han de sopesarse y considerarse dentro de la discreción del médico al cargo y en cada una de las cantidades insignificantes de los ejemplos de toxina botulínica aparecen sistemáticamente como no significativas. Ejemplo Uno Uso de una toxina botulínica para tratar trastornos precancerosos de las glándulas mamarias 1. Tratamiento de quistes Una mujer de 46 años de edad presenta enfermedad quística crónica en mamas por lo demás normales. Aparece un cambio fibroquístico como una mezcla de una serie de entidades benignas con una masa total de 1,2 cm de diámetro y que contiene zonas de tejido fibro-graso firme y múltiples quistes de diverso tamaño. La ecografía y la investigación de imagen revelan formación de quistes y microcalcificación. El examen histológico revela la presencia de atipia apocrina (hiperplasia y metaplasia) y se determina, por tanto, que el paciente está en riesgo de desarrollar carcinoma apocrino o carcinoma medular. La aspiración por aguja fina (AAF) de mama se ha usado desde 19 para examinar la citopatología de células mamarias en el diagnóstico de cáncer. La aspiración estereotáctica por aguja fina, así como ecografía y aspiración por aguja fina guiada mamográficamente se han usado también para lesiones no palpables. La estereorradiografía puede realizarse usando equipos de mamografía convencionales y placas de compresión para permitir un posicionamiento preciso de la aguja fina a lo largo de las coordenadas x e y dentro de 1 mm de la lesión. La guía ecográfica es muy útil para determinar si la lesión es puramente quística, mixta o sólida. Normalmente se usa una aguja de calibre 22. La misma metodología usada para AAF se usa para inyectar una toxina botulínica en un tejido diana. Así, para inyección la aguja puede unirse a una jeringuilla con o sin un mango especial que permite agarrarla con una sola mano. Se lava la piel con un antiséptico. Se sujeta la masa mamaria y se tira de la piel suprayacente para ponerla tersa en una posición favorable para que el operador inserte la aguja con la otra mano. La aguja se inserta en la masa y el émbolo de la jeringuilla que contiene una solución de una toxina botulínica se empuja hacia delante mientras la aguja avanza en una línea recta a través de la lesión. Alternativamente, para un efecto terapéutico extendido, puede insertarse subcutáneamente un implante de liberación controlada y/o puede inyectarse una suspensión de botulinum que contiene microesferas, según se expone en las patentes de EE.UU. nº y Se realiza la administración local (inyección) de unidades a 0 unidades de una toxina botulínica de tipo A, como BOTOX en la masa quística. En los 28 días posteriores, el quiste ha retrocedido sustancialmente (diámetro de quiste reducido en al menos el 80%) y permanece así durante los 2 a 24 meses siguientes. Alternativamente, puede administrarse una toxina botulínica de tipo B, C, D, E, F o G, con la cantidad de dosificación ajustada para reflejar la diferente potencia en comparación con la toxina de tipo A. Así, por ejemplo, como se sabe que la toxina botulínica de tipo B es aproximadamente 0 veces menos potente que la toxina botulínica de tipo A, se administra localmente de 00 a.000 unidades de toxina de tipo B. 2. Tratamiento de adenosis esclerosante Se examina a una mujer post-menopáusica de 9 años de edad que se queja de dolor de mama. La mamografía revela una lesión proliferativa que parte de la unidad lobular del conducto terminal y que comprende una masa palpable clínicamente de 1,3 cm de diámetro sin coloración específica. La masa está mal definida y existe algo de dolor y sensibilidad. Histológicamente, la configuración normal de un grupo de lóbulos está distorsionada por una proliferación desordenada de ácinos y células estrómicas intralobulares. Se realiza la administración local (inyección) de unidades a 0 unidades de una toxina botulínica de tipo A, como BOTOX, en la masa. En los 28 días posteriores, la masa ha retrocedido sustancialmente (diámetro reducido en al menos el 80%) y permanece así durante los 2 a 24 18

19 meses siguientes. Alternativamente, puede administrarse toxina botulínica de tipo B, C, D, E, F o G, con la cantidad de dosificación ajustada para reflejar la diferente potencia en comparación con la toxina de tipo A. Así, por ejemplo, como se sabe que la toxina botulínica de tipo B es aproximadamente 0 veces menos potente que la toxina botulínica de tipo A, pueden administrarse localmente de 00 a.000 unidades de toxina de tipo B. 3. Tratamiento de papilomas ductales Se examina a una mujer de 0 años de edad con una historia de descarga sanguinolenta de un pezón. Aunque no existe masa palpable, se descubre una neoplasia benigna del epitelio ductal de la mama. Se realiza la administración local de desde unidades a 0 unidades de una toxina botulínica de tipo A, como BOTOX. En los 28 días siguientes, la descarga se ha resuelto y el paciente permanece asintomática durante los siguientes 2 a 24 meses. Alternativamente, puede administrarse una toxina botulínica de tipo B, C, D, E, F o G, con la cantidad de dosificación ajustada para reflejar la diferente potencia en comparación con la toxina de tipo A. Así, por ejemplo, como se sabe que la toxina botulínica de tipo B es aproximadamente 0 veces menos potente que la toxina botulínica de tipo A, pueden administrarse localmente de 00 a.000 unidades de toxina de tipo B. 4. Tratamiento de fibroadenomas Una mujer de 36 años de edad presenta un bulto en la mama. El examen clínico, por imagen (mamografía) y la citología de aspiración por aguja fina revelan una masa firme, móvil, bien definida, indolora, gomosa, de 1, cm de diámetro. Como la lesión es benigna, se ofrece a el paciente toxina botulínica de inyección local como alternativa a la escisión y se obtiene el consentimiento informado para la misma. Se realiza la administración local en el bulto de unidades a 0 unidades de una toxina botulínica de tipo A, como BOTOX. En los 28 días posteriores, la masa ha retrocedido sustancialmente (diámetro reducido en al menos el 80%) y permanece así durante los 2 a 24 meses siguientes. Alternativamente, puede administrarse una toxina botulínica de tipo B, C, D, E, F o G, con la cantidad de dosificación ajustada para reflejar la diferente potencia en comparación con la toxina de tipo A. Así, por ejemplo, como se sabe que la toxina botulínica de tipo B es aproximadamente 0 veces menos potente que la toxina botulínica de tipo A, puede administrase localmente desde 00 a.000 unidades de toxina de tipo B.. Tratamiento de adenosis ductal roma Una mujer de 4 años de edad con una historia de ingestión de cafeína (4 a 6 tazas de café al día durante aproximadamente los últimos años) tiene alteración columnar de lóbulos determinada como zonas mal definidas de formación de microquistes con unidades lobulares ductales terminales individuales que muestran alteración o sustitución de la capa epitelial luminal normal mediante una sola capa de células epiteliales columnares altas con núcleos situados basalmente y protuberancias apicales citoplásmicas. Se realizó administración local en el bulto de unidades a 0 unidades de toxina botulínica de tipo A, como BOTOX. En los 28 días posteriores, la adenosis se ha resuelto y permanece así durante los 2 a 24 meses posteriores. Alternativamente, puede administrarse una toxina botulínica de tipo B, C, D, E, F o G, con la cantidad de dosificación ajustada para reflejar la diferente potencia en comparación con la toxina de tipo A. Así, por ejemplo, como se sabe que la toxina botulínica de tipo B es aproximadamente 0 veces menos potente que la toxina botulínica de tipo A, pueden administrarse localmente desde 00 a.000 unidades de toxina de tipo B. 6. Tratamiento de enfermedad mamaria proliferativa La histología en una muestra de biopsia para una mujer de 64 años de edad revela hiperplasia epitelial (proliferativa con atipia) según se muestra por un aumento en el número de células por encima de la bicapa normal de células epiteliales luminales normales y células mioepiteliales. Se realiza la administración local en el bulto de desde unidades a 0 unidades de una toxina botulínica de tipo A, como BOTOX. En los 28 días posteriores, la biopsia seguida por examen histológico determina que el paciente está libre de atipia y permanece así durante al menos los 2 a 24 meses siguientes. Alternativamente, puede administrarse una toxina botulínica de tipo B, C, D, E, F o G, con la cantidad de dosificación ajustada para reflejar la diferente potencia en comparación con la toxina de tipo A. Así, por ejemplo, como se sabe que la toxina botulínica de tipo B es aproximadamente 0 veces menos potente que la toxina botulínica de tipo A, pueden administrarse localmente desde 00 a.000 unidades de toxina de tipo B. Ejemplo 2 Tratamiento de tejidos hipertónicos o hiperplásicos con una toxina botulínica 6 La administración local de una toxina botulínica directamente a o en proximidad de un tejido diana hipertónico o hiperplásico puede realizarse por varios procedimientos. Según se expone anteriormente, un tejido dérmico diana o subdérmico, como tejido mamario, puede tratarse por inyección directa o por colocación de un implante de toxina. A los sitios viscerales, como un neuroblastoma visceral, puede accederse también fácilmente. Por ejemplo, la endoscopia con fines diagnósticos o terapéuticos es bien conocida. (1) Las técnicas endoscópicas pancreáticas terapéuticas incluyen esfinterotomía pancreática, estenosis de dilatación, stenting, drenaje de pseudoquistes y colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) que permite visualización y tratamiento del sistema ductal pancreático-biliar. Un endoscopio usado para terapia pancreática puede modi- 19

20 ficarse para permitir su uso para inyección directa de una neurotoxina, como una toxina botulínica directamente en tejido pancreático. Ver por ejemplo, la patente de EE.UU. nº Para los fines de la presente invención, el endoscopio se mueve desde la orofaringe a través del estómago, el duodeno y finalmente el conducto pancreático, se ha realizado previamente descompresión del conducto (por ejemplo, por dilatación o stenting), si se requiere, para permitir alojamiento del endoscopio en el conducto. Una vez así localizado, puede extenderse el extremo de una aguja hueca desde el endoscopio al tejido pancreático y a través de esa aguja puede inyectarse la neurotoxina en el tejido pancreático. Si el conducto pancreático no es accesible o no se descomprime, puede usarse también una aguja percutánea, guiada por imagen (es decir, por ecografía o tomografía computarizada), para inyección transabdominal de una neurotoxina directamente en tejido pancreático. Así, la aspiración por aguja percutánea para biopsia pancreática es una técnica conocida y la aspiración puede invertirse para conseguir la inyección de toxina deseada. Así, puede tratarse un insulinoma o tejido pancreático hipertónico o hiperplásico por administración local de desde 1 a 00 unidades de una toxina botulínica al tejido objeto pancreático. Análogamente puede tratarse tejido objeto de pulmón neoplásico o hiperplásico, intestinal y ovárico. (2) Pituitaria Los procedimientos estereotácticos pueden usarse para administración intracraneal precisa de neurotoxina en forma acuosa o como un implante para tratar un tejido objeto hiperplásico o de hipotálamo o de pituitaria. Un neuroblastoma craneal se trata también de esta manera. Así, la administración intracraneal de una toxina botulínica puede realizarse del modo siguiente. Puede realizarse una exploración de RM preliminar para obtener la longitud de la línea de comisura anteriorcomisura posterior y su orientación con las marcas óseas externas. A continuación puede alinearse la base del marco con el plano de la línea de comisura anterior-comisura posterior. Se usa la guía por TC y puede complementarse con ventriculografía. La comisura posterior puede visualizarse en cortes de TC de 2 mm y usarse como punto de referencia. La corroboración fisiológica de localización de tejido objeto puede ser por uso de estimulación de alta y baja frecuencia a través de un electrodo que acompaña o que se incorpora en la jeringuilla de aguja larga usada. Puede usarse un electrodo de termistor de 1,6 mm de diámetro con una punta expuesta de 2 mm (Radionics, Burlington, Massachusetts). Con estimulación de alta frecuencia con electrodo (7 Hz) pueden evitarse respuestas parestésicas en el antebrazo y la mano a 0,-1,0 V usando un generador de lesión Radionics (Radionics Radiofrequence Lesion Generator Model RFG3AV). A baja frecuencia ( Hz), la activación o interrupción del temblor en la extremidad afectada ocurrió a entre 2 y 3 V. Con los procedimientos de la presente invención, no se usa el electrodo para crear una lesión. Después de la confirmación de localización del tejido diana, puede inyectarse una neurotoxina, causando así una hipotalamectomía química reversible. Una inyección típica es el número deseado de unidades (es decir, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente unidades) de un complejo de toxina botulínica de tipo A en de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 0,1 ml de agua o solución salina. Puede usarse un volumen de inyección bajo para reducir al mínimo la difusión de toxina lejos de la diana. Normalmente, puede esperarse que el factor de liberación hipotalámica o el efecto de inhibición de liberación de hormona pituitaria se desgaste en aproximadamente 2 a 4 meses. Así, puede usarse un formato alternativo de neurotoxina, neurotoxina incorporada en un implante polimérico, para proporcionar liberación continua controlada de una cantidad terapéutica de la toxina en la posición deseada durante un período prolongado (es decir, de aproximadamente 1 año a aproximadamente 6 años), obviando así la necesidad de inyecciones repetidas de toxina. Pueden usarse varios procedimientos para inyección guiada estereotácticamente de una neurotoxina a varios objetos intracraneales, como el núcleo arqueado (NA) para tratamiento de acromegalia. Así, puede usarse un procedimiento de resonancia magnética (RM) estereotáctica que se basa en imágenes ponderadas en T1 tridimensionales (3D) para planificación quirúrgica e imágenes ponderadas en T2 multiplanares para visualización directa del NA, acopladas con registro electrofisiológico y guía de inyección para inyección de NA. Ver, por ejemplo, Bejjani B.P. y col., Bilateral Subthalamic Stimulation for Parkinson s Disease by Using Three-Dimensional Stereotactic Magnetic Resonance Imaging and Electrophysiological Guidance, J Neurosurg 82(4); 6-2:00. Las coordenadas del centro del NA pueden determinarse con referencia a la línea de comisura anterior-comisura posterior del paciente y a un atlas encefálico. Puede realizarse simultáneamente una monitorización electrofisiológica para definir con precisión la diana funcional. La pista central, que se dirige al objeto predeterminado usando imagen de RMI, puede seleccionarse para inyección de neurotoxina. No se esperan complicaciones quirúrgicas. Puede usarse metodología de neurocirugía funcional basada en atlas asistida por ordenador para inyectar de forma exacta y precisa la neurotoxina o implante deseado con un implante de liberación controlada de neurotoxina. Dichas metodologías permiten visualización tridimensional y manipulación en tiempo real de estructuras hipotalámicas. La planificación neuroquirúrgica con atlas encefálicos múltiples prerregistrados mutuamente en las tres orientaciones ortogonales es, por tanto, posible y permite una precisión aumentada de la definición objeto para inyección o implantación de neurotoxina, tiempo reducido del procedimiento quirúrgico para reducir el número de tractos, y facilita la planificación trayectorias más sofisticadas. Ver, por ejemplo, Nowinski W.L. y col., Computer-Aided Stereotactic Functional Neurosurgery Enhanced by the Use of the Multiple Brain Atlas Database, IEEE Trans Med Imaging 19(l); 62-69:00. Así, un tumor pituitario o tejido pituitario hipertónico o hiperplásico puede tratarse por administración local de 1 a 00 unidades de una toxina botulínica en el tejido pituitario diana.