Antonio Flores Maestría en Bioquímica y Biología Molecular UPCH PERU. Ministerio de Salud. Dirección General de Salud de las Personas
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1 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Knock-out del gen MSMEG5046 en Mycobacterium smegmatis, un homólogo de la bomba de eflujo putativa Rv1250 de Mycobacterium tuberculosis y su efecto en la susceptibilidad a drogas antituberculosas. Antonio Flores Maestría en Bioquímica y Biología Molecular UPCH
2 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Introducción Estructura de la pared celular del Mycobacterium y las familias de bombas de eflujo Distribución de las bombas de eflujo. Mesaros, N., et al., L efflux actif des antibiotiques et la résistance bactérienne état de la question et implications microbiologiques et cliniques. Louvain Médical, (8): p
3 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Introducción Tipos de familias de bombas de eflujo Familia de bombas de eflujo M. tuberculosis M. smegmatis ABC s (Superfamilia de cassette de unión a ATP) MFS (Superfamilia principal facilitador) RND (Superfamilia de división de resistencia-nodulación de células) MATE (Familia de proteís de eflujo de tóxicos y multidrogas) 1 1 SMR (Familia pequeña de resistencia a múltiples drogas) 1 5
4 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Objetivos General Caracterizar por medio de ensayo a drogas el tipo de participación de la bomba de eflujo putativa del gen MSMEG5046. Específicos Desarrollar u metodología de deleción de genes por medio de la recombición homóloga en M. smegmatis. Hallar la mínima concentración inhibitoria de diferentes drogas antituberculosas en u cepa wild type y u cepa carente del gen MSMEG5046.
5 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Métodos Fase 1 Fase 2 Fase 3 Identificación en M. smegmatis del gen MSMEG5046 homólogo a Rv1250 de M. tuberculosis que codifica a u bomba de eflujo de la familia MFS. Por medio de trabajos publicados de sobreexpresión se logró seleccior al gen MSMEG5046. Construcción de un vector suicida para ser usado en la recombición homóloga y delecior el gen MSMEG5046 en M. smegmatis Usando u combición de dos plásmidos P2nil y Pgoal se diseñó la construcción del vector suicida para delecior MSMEG5046. Electroporación del vector suicida construido y recombición homóloga en M. Smegmatis Usando un electroporador se introdujo el plásmido suicida con la información construida usando la recombición homóloga. Fase 4 Caracterización del transporte de drogas de la cepa knockeada de M. smegmatis deficiente de la bomba de eflujo MSMEG5046 Usando la técnica del TEMA se logró caracterizar la cepa knockeada usando diferentes drogas.
6 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Métodos A. Metodología usada para producir el plásmido suicida. B. Estrategia para el Knock Out del gen MSMEG5046.
7 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Métodos Esquema y demostración de un ensayo de MIC por medio de la técnica TEMA (Ensayo de microplacas con tetrazolium) A B WT C KO-1 D WT E KO-2 F WT G KO-3 6 H 6
8 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Métodos Esquema y demostración de un ensayo de MIC por medio de la técnica TEMA (Ensayo de microplacas con tetrazolium) A B WT C D MSMEG 5046 WT E F MSMEG 5046 WT G H MSMEG
9 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Resultados Demostración de la construcción secuencial del plásmido suicida para el gen MSMEG Producto de PCR Upstream de MSMEG5046 (1163pp) 2. 1Kb (NEB) bp (NEB) 4. Producto de PCR Downstream de MSMEG5046 (1429pb) 5. negativo de PCR Upstream 6. negativo de PCR Downstream 7. Producto de PCR Upstream+Downstream de MSMEG5046 (2592pb) 8. PCR Upstream+Downstream de Rv1250 en ADN genómico de M. smegmatis mc 2 155(4430 pb) 9. Plásmido P2nil (4.75kb)linealizado con PacI 10. Clomiento de Upstream+Downstream de MSMEG5046 en P2nil 11. Cassette del plásmido Pgoal 19 (7.9kb) 12. Plásmido suicida construido (cassette Pgoal 19 ligado a P2nil+Upstream+Downstream MSMEG5046, digerido con PacI 13. 1Kb (NEB)
10 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Resultados Caracterización del transporte de drogas de la cepa knockeada de M. smegmatis deficiente de la bomba de eflujo MSMEG5046 Drogas evaluadas MICs sin antibombas (Sin EPI) MICs con Verapamil (EPI) MICs con Thioridazine (EPI) mc MSMEG5046 p-value* mc MSMEG5046 p-value* mc MSMEG5046 p-value* Ciprofloxaci µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 1 Isoniacida * * * Amikaci µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml 1 Etambutol Rifampici Bromuro etidio Caracterización de las cepas Mycobacterium smegmatis wild type y MSMEG5046 por TEMA usando drogas antibombas en adición con bromuro de etidio y drogas antituberculosas. *resultado de p-value usando el test de U-Mann-Withney.
11 MIC (µg/ml) PERU de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Resultados Caracterización de las cepas Mycobacterium smegmatis wild type y MSMEG5046 por TEMA usando drogas antibombas en adición con bromuro de etidio y drogas antituberculosas Cepas de M.smegmatis Wild type y MSMEG5046 Isoniacida Etambutol Rifampici Bromuro etidio
12 de las Persos Estrategia Sanitaria Naciol de Prevención y de la Tuberculosis Conclusiones Se ha identificado que el gen MSMEG5046 participa en la resistencia a en M. smegmatis y podría extrapolarse a M. tuberculosis. La resistencia intrínseca en M. smegmatis es afectada por los inhibidores de bombas de eflujo, un efecto que podría ser importante en la investigación y desarrollo de nuevas y más terapias efectivas antimicobacterias. Es importante considerar que en general, la resistencia a drogas en Mycobacterium no puede ser explicada con un único gen o mecanismo. Las bombas de eflujo en las bacterias son sustrato-promiscuos. Debido a que se realizó un solo KO, otras bombas podrían reemplazarla en su función. Por primera vez en el Perú se tiene u herramienta para poder disrumpir genes de importancia terapéutica en Mycobacterium.
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