CLART CMA KRAS BRAF PI3K

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1 CLART CMA KRAS BRAF PI3K DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE MUTACIONES PUNTUALES EN TRES DE LOS GENES PERTENECIENTES A LA RUTA DEL EGFR ASOCIADOS A CÁNCER COLORRECTAL KRAS, BRAF y PI3K- PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO 1

2 CLART CMA KRAS BRAF PI3K CLART CMA KRAS BRAF PI3K está bajo la protección de 2 familias de patentes correspondientes a las solicitudes de Patente Internacional PCT WO y WO Dichas familias comprenden miembros que han entrado en fase nacional y regional en distintos territorios: Europa, USA, Canadá, Brasil, México y China. CLART, CLART-Strip, CAR, SAICLART y AUTOCLART son Marcas Registradas por GENOMICA. Para ampliar la información descrita en este manual puede consultar la web: GENOMICA, S.A.U. Parque Empresarial Alvento, Edificio B Calle Vía de los Poblados, 1 1ª planta Madrid, España Versión 8 Julio

3 ÍNDICE: 1. GLOSARIO DE TÉRMINOS 2. DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO 3. COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT 3.1. Reactivos de amplificación 3.2. Reactivos de visualización 3.3. Otros componentes 4. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO 4.1. Reactivos y material 4.2. Equipos 5. RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN 5.1. Recomendaciones generales 5.2. Precauciones para la extracción 5.3. Precauciones para la visualización 6. MUESTRAS 7. PROTOCOLO DE TRABAJO 7.1. Pre-tratamiento de la muestra 7.2. Material extraído 7.3. Reacción de amplificación 7.4. Visualización del producto amplificado Visualización manual Visualización en autoclart 8. LECTURA DE RESULTADOS 9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO 11. BIBLIOGRAFÍA 3

4 1.-GLOSARIO DE TÉRMINOS Atención, ver instrucciones de uso Fecha de caducidad Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro Lote 25ºC Conservar a temperatura ambiente 20ºC 4ºC 8ºC Conservar entre 4 ºC y 8 ºC - 30ºC -18ºC Conservar entre 30 ºC y 18 ºC 4

5 2.-DESCRIPCIÓN DEL PROTOCOLO CLART CMA KRAS BRAF PI3K detecta la presencia de las mutaciones puntuales más prevalentes en la ruta del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, EGFR, del inglés, (Epidermal Growth Factor Receptor), asociadas a cáncer colorrectal. Las mutaciones puntuales que el kit detecta, son las siguientes: KRAS: G12A G12C G12D G12R G12S G12V G13D Q61H Q61L BRAF: V600E V600K PI3K: E542K E545D E545K H1047R MUESTRAS: Biopsias colorrectales FFPE (tejido embebido en parafina fijado con formaldehido) La detección se lleva a cabo mediante la amplificación específica de la mutación existente en la muestra, originando un fragmento variable para cada mutación de entre unos pares de bases. La amplificación se llevará a cabo en un número variable de tubos de PCR, dependiendo del gen a analizar: -Para la detección de mutaciones puntuales para KRAS, se necesitan 3 tubos de amplificación diferenciados por su color: blanco, verde y rojo. -Para la detección de mutaciones puntuales para BRAF, se necesita 1 tubo de amplificación de color amarillo. -Para la detección de mutaciones puntuales para PI3K, se necesitan 2 tubos de amplificación, de color azul y blanco. La detección del producto amplificado por PCR se lleva a cabo mediante una plataforma tecnológica basada en microarrays de baja densidad: CLART (Clinical Arrays Technology). La plataforma se fundamenta en un principio muy sencillo, pero a la vez muy cómodo y eficaz que consiste en imprimir un microarray en el fondo de un pocillo de placa microtiter, lo que simplifica todo el proceso de hibridación y visualización frente a los sistemas de microarrays clásicos. La 5

6 Figura 1 muestra un CLART-Strip o CS de 8 pocillos. Figura 1. Plataforma CLART-Strip en forma de tira de 8 pocillos. El sistema de detección con CLART CMA KRAS BRAF PI3K se basa en la precipitación de un producto insoluble en aquellas zonas del microarray en las que se produce la hibridación de los productos amplificados con las sondas específicas del array. Durante la PCR, los productos amplificados se marcan con biotina. Después de la amplificación, estos productos se hibridan con sus respectivas sondas específicas que están inmovilizadas en zonas concretas y conocidas del microarray, tras lo que se incuba con un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El conjugado se une a través de la estreptavidina con la biotina presente en los productos amplificados (que a su vez se encuentran unidos a sus sondas específicas) y la actividad peroxidasa provoca la aparición de un producto insoluble en presencia del sustrato o-dianisidina, que precipita sobre las zonas del microarray en las que ocurre la hibridación (Figura 2). 6

7 Figura 2: Esquema del método de visualización. Las sondas, inmovilizadas sobre la superficie, capturan sus productos amplificados complementarios marcados con biotina. A través de la biotina, se une el conjugado, en este caso estreptavidina-hrp (peroxidasa de rábano, HorseRadish Peroxidase). El sustrato o-dianisidina por la acción de la HRP, produce un precipitado sobre la zona en la que se produce la hibridación. 7

8 3.-COMPONENTES Y CONSERVACIÓN DEL KIT El kit CLART CMA KRAS BRAF PI3K contiene suficientes reactivos para el análisis de 8 ó 24 muestras clínicas. Los reactivos incluidos en el kit se han agrupado en varias cajas, dependiendo de la temperatura a la que se han de conservar. Todos los reactivos son estables en las condiciones indicadas de conservación hasta la fecha de caducidad del kit Reactivos de amplificación Se envían y se conservan a -20 ºC. Tubos de Amplificación listos para su uso. Contienen 45 µl de mezcla de reacción. Sólo se debe descongelar sobre hielo el número preciso de tubos de amplificación que se vayan a procesar en ese momento, conservando el resto de los tubos a -20ºC. Para el análisis del GEN KRAS, se envían 3 tubos de amplificación: Mix 1: Tubo blanco; Mix 2: Tubo verde; Mix 3: Tubo rojo. Con estos tres tubos se determinan las mutaciones G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D, Q61H y Q61L. Para el análisis del GEN BRAF se envía 1 tubo de amplificación: Mix 1: Tubo amarillo. Se determinan las mutaciones puntuales V600E y V600K. Para el análisis del GEN PI3K, se envían 2 tubos de amplificación: Mix 1: Tubo blanco; Mix 2: Tubo azul. Con estos dos tubos se determinarán las mutaciones puntuales E542K, E545D, E545K y H1047R. Nota: En la caja del kit se incluye un indicador adhesivo e irreversible de temperatura; la aparición de un color rojizo en la ventana de visualización indica que en algún momento los productos han sobrepasado la temperatura de conservación de 20 o C y no deben utilizarse Reactivos de visualización El kit de visualización se envía y se conserva a 4 ºC a excepción de las tiras y la solución de hibridación. ADVERTENCIA!: Una vez recibido el kit, las tiras CLART-Strip (CS) y la solución de hibridación (SH) deben conservarse a temperatura ambiente. Tiras CS (incluyendo todas las sondas específicas). Se suministran en un sobre termosellado. Conservar siempre cerrado, a temperatura ambiente (máx. 25ºC) y protegido de la luz. SH (Solución de Hibridación). Conservar a temperatura ambiente DC (Diluyente de Conjugado). Conservar a 4 ºC. CJ (Conjugado). Conservar a 4 ºC. Dar un pulso en la centrífuga antes de usar. RE (Solución de Revelado). Conservar a 4 ºC y protegido de la luz. 8

9 TL (Tampón de Lavado). Conservar a 4 ºC. Soporte y tapa para tiras de 8 pocillos. 3.3 Otros componentes Para la captura y posterior procesamiento de la imagen se necesita el siguiente equipo: Lector CAR (CLINICAL ARRAY READER): permite la lectura e interpretación automática de hasta 12 tiras de CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras. Está fabricado y distribuido por GENOMICA para su uso exclusivo con los kits de diagnóstico. SAICLART : software desarrollado por GENOMICA para el procesamiento de imágenes. Software específico del kit CLART CMA KRAS diseñado y validado por GENOMICA. Figura 3. CAR (CLINICAL ARRAY READER) 4. MATERIAL REQUERIDO Y NO SUMINISTRADO A continuación enumeramos todo el material requerido que no es suministrado con el kit Reactivos y material - Agua destilada. - Guantes desechables. - Puntas de pipeta con filtro o desplazamiento positivo. - Recipiente con hielo picado. - Tubos Eppendorf de 1,5 ml autoclavados. 9

10 4.2. Equipos - Gradillas para tubos de 1,5 ml. - Soporte para tubos de 0,5 ml/0,2 ml. autoclart (figura 3) permite el procesado automático de la fase de visualización de hasta 12 tiras de arrays CS, es decir, de hasta un máximo de 96 muestras. Figura 4. autoclart Microcentrífuga. Espectrofotómetro de UV-visible. Termociclador convencional con velocidades de enfriamiento/calentamiento como máximo de 3ºC por segundo. Cabina de flujo laminar para el laboratorio de extracción. Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, µl y µl para el laboratorio de extracción. Una micropipeta ajustable entre 1-20 µl, para añadir el material genético a los tubos de amplificación. Tres micropipetas ajustables entre 1-20 µl, µl y µl para el laboratorio de visualización. Termobloque (Thermomixer) con adaptador de placa, tapa y con agitación ajustable a 20 C, 25 C y 50ºC.Compatible con placas de 96 pocillos. Vórtex. Sistema de vacío. 10

11 5.- RECOMENDACIONES Y PROCEDIMIENTOS DE MANIPULACIÓN Muy importante para evitar contaminaciones!. Leer detenidamente antes de comenzar la técnica Recomendaciones generales 1. La técnica se debe realizar en dos áreas separadas físicamente, para evitar la contaminación de las muestras con el producto amplificado anteriormente. Cada una de las áreas debe tener su propio material de trabajo identificado (pipetas, puntas, tubos, gradillas, guantes, etc.) y nunca debe salir de cada una de ellas. 1. Área pre-pcr: En este área se hace la extracción del ADN y preparación de las muestras. Dicha preparación de las muestras para su extracción debe realizarse dentro de una cabina adecuada y con las medidas de esterilización más amplias posibles para evitar contaminaciones. 2. Área post-pcr: En este área se lleva a cabo la amplificación y la visualización del producto amplificado. El material de esta área nunca ha de entrar en contacto con el del área de extracción. Evitar ir al área de pre-pcr después de haber estado trabajando en el área de post-pcr. 2. Utilizar guantes en todo momento. Es recomendable cambiarse de guantes con cierta frecuencia y obligatoriamente cada vez que se empieza a trabajar en las áreas antes descritas. Siempre hay que utilizar guantes nuevos cuando se añada el ADN a los tubos de amplificación. 3. Limpiar las zonas de trabajo (poyatas, campanas, gradillas, pipetas) en profundidad con lejía diluida al 10% cada vez que se procese una tanda de muestras, y obligatoriamente después de una contaminación. En el caso de termocicladores y termomixers, se recomienda limpiarlos antes y después de su uso, en estas mismas condiciones. 4. Emplear siempre puntas con filtro y pipetas de desplazamiento positivo para evitar contaminaciones debidas a la micropipeta. Se debe trabajar con un juego de pipetas diferente para cada área. 5. Emplear material de laboratorio desechable y autoclavado. 6. Nunca mezclar reactivos de dos viales diferentes, aunque sean del mismo lote. 7. Cerrar los tubos de reactivos inmediatamente después de su uso para evitar contaminaciones. 8. Desechar la punta de la micropipeta tras cada pipeteo. 9. GENÓMICA no se hace responsable de los resultados obtenidos con el kit si se emplean otras muestras distintas a las indicadas. 11

12 5.2. Precauciones para la extracción y la adición del material extraído al tubo de amplificación. 1. Utilizar guantes en todo momento. 2. Limpiar las superficies de trabajo de la cabina con lejía diluida al 10%. 3. Encender el flujo laminar y la luz UV al menos 20 minutos antes de comenzar la extracción. Apagar la luz UV cuando se esté trabajando dentro de la cabina. 4. La preparación de las muestras antes de su extracción, debe hacerse dentro de la cabina. 5.3 Precauciones para la visualización 1. Antes de comenzar el ensayo se recomienda verificar el THERMOMIXER a las temperaturas a las cuales va a ser utilizado: 20 C, 25 C y 50ºC. Para ello utilizar una sonda termopar en contacto directo con la placa del THERMOMIXER. 2. El producto de PCR solo debe ser desnaturalizado una vez para su hibridación. No usar producto de PCR para visualizar que haya sido desnaturalizado más de una vez. Si se tiene esta necesidad, hacer alícuotas previamente al paso de desnaturalización. 3. Evite que la punta de la pipeta o del sistema de vacío toque el fondo del pocillo, ya que podría dañar las sondas fijadas en el fondo del pocillo. 4. Se recomienda añadir cada solución sobre la pared del pocillo CS, nunca directamente sobre el fondo. 5. La solución de hibridación a temperatura ambiente cristaliza, por lo que antes de uso debe calentarse a 50ºC hasta que la solución sea homogénea. Es conveniente no añadir la solución SH (Solución de hibridación) hasta que se vayan a añadir los productos desnaturalizados de PCR; por tanto mantener dicha solución de hibridación a 50ºC hasta que sea añadida. 6. El array no debe quedarse totalmente seco. 7. Tras la incubación con la solución CJ, es muy importante lavar bien el microarray para evitar que queden restos de éste y que reaccionen con la solución RE, produciendo un precipitado inespecífico que pueda dar lugar a interpretaciones erróneas del resultado. 8. Evite burbujas sobre la superficie del microarray al añadir cualquiera de las distintas soluciones. 9. Al visualizar la imagen en el lector, comprobar que aparezcan los marcadores de posición y que no haya burbujas o manchas que interfieran en la lectura. En caso contrario, limpiar el fondo exterior del pocillo con un papel de celulosa. 12

13 6. MUESTRAS El kit CLART CMA KRAS BRAF PI3K ha sido diseñado y validado para su uso a partir de metarial genético de biopsias de cáncer colorrectal. GENOMICA no se responsabiliza de los resultados obtenidos con otro tipo de muestras. 7. PROTOCOLO DE TRABAJO CLART CMA KRAS BRAF PI3K ha sido validado utilizando dos protocolos distintos de pretratamiento de la muestra Pre-tratamiento de la muestra: Procesado previo Los cortes de FFPE (tejido embebido en parafina fijado con formaldehido) deben colocarse en un portaobjetos de vidrio para la exploración por el patólogo. Cada muestra debe procesarse mediante un bisturí estéril nuevo. El patólogo hará un estudio de cada corte que con la ayuda de la tinción con Hematoxilina y eosina (H&E), podrá delimitar y verificar el área tumoral mediante un porcentaje (%) de células tumorales. A continuación, se seguirán las siguientes instrucciones: Si existe un porcentaje <50% de células tumorales y un área pequeña: tomar 6 secciones de 10 µm. Si existe un porcentaje >50% de células tumorales y un área grande: tomar 2-4 secciones de 10 µm. Si existe una gran cantidad de tejido, indistintamente del porcentaje tumoral: cortar 1 sección de 10 µm. En caso de biopsias endoscópicas (muy pequeñas) cortar 10 secciones de 10µm. Incluir los cortes en un tubo de 1.5ml. Elegir el protocolo que más se adecúe: PROTOCOLO Añadir 1 ml de Xileno al tubo con la muestra, dar un vórtex durante 5 segundos. 2. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. 3. Centrifugar el tubo a rpm, 5 minutos. 4. Eliminar el sobrenadante. 5. Añadir 1ml de Etanol al 96-99% dar un vórtex durante 5 segundos. 6. Centrifugar el tubo con la muestra a rpm durante 2 minutos. 13

14 7. Eliminar el sobrenadante. 8. Incubar a 56ºC para evaporar los restos de sobrenadante (pellet seco), aproximadamente durante 15 minutos. 9. Seguir en este paso el protocolo indicado en el manual del kit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit de Qiagen. Eluir en un volumen final de 50µl. PROTOCOLO 2. Día Centrifugar el tubo con la muestra durante 1 minuto a rpm, para que se concentren los cortes de la muestra en el fondo del tubo. 11. Calentar la muestra, sin agitación, a 5 minutos 75º en el termomixer. 12. Añadir a cada muestra 190µl de buffer G2 (de lisis) del kit EZ1 DNA Tissue Kit de Qiagen. 13. Incubar 5 minutos a 75ºC en agitación a 1400 rpm. 14. Bajar la temperatura del termomixer a 56ºC. 15. Añadir 25 µl de proteinasa K preparada según el kit antes mencionado (20 mg/ml). 16. Incubar toda la noche a 56ºC en agitación a rpm. Día Añadir 10µl de proteinasa K, y dar un vórtex. 2. Incubar toda la noche a 56ºC en agitación a1.400 rpm. Día Centrifugar el tubo con la muestra 1 minuto a rpm. 2. Añadir 2 µl de glicógeno a 20 mg/ml (opcional, adecuado en muestras con poco material de extracción previo). 3. Recoger el sobrenadante. 4. Homogeneizar la muestra con pipeta en el caso de que queden restos de tejido. 5. Pipetear el sobrenadante en un tubo de extracción específico dispuesto por el Kit de Extracción de la casa Qiagen para muestras embebidas en parafina. 6. Poner en BIO-ROBOT EZ1, para proceder a la extracción de DNA. La tarjeta ha de ser DNA parafina, y el volumen de elución ha de ser de 50 µl. 14

15 7.2. Material extraído El método de extracción elegido puede ser cualquiera que garantice los siguientes parámetros de concentración y pureza: 1. La concentración del material genético añadido al tubo de PCR debe ser 150ng totales. Un exceso o defecto de ADN puede dar lugar a un diagnóstico erróneo. No sobrepasar nunca los 150 ng totales ni 10 μl de volumen añadido a cada tubo de PCR (se debe añadir de 5 a 10 microlitros de DNA extraído a cada tubo de amplificación según la concentración). A continuación se muestra una tabla resumen con todas las posibilidades que pueden encontrarse: DNA extraído (ng/μl) Volumen (μl) a anadir a cada tubo de PCR Cantidad total (ng) de DNA añadido a cada tubo de PCR Si la concentración es inferior a 15 ng/µl se debe volver a extraer la muestra. 2. El ADN extraído debe tener la siguiente pureza suficiente para evitar un diagnóstico erróneo. La medida del ratio entre la aborbancia a 260nm y la absorbancia a 280nm debe ser cercana a 2. Si la pureza no es la adecuada se debe volver a extraer. 3. El material extraído debe conservarse a 4ºC si se va a procesar inmediatamente o a -20ºC en caso contrario. Es importante incluir un control negativo de extracción para comprobar que las muestras no hayan sufrido contaminaciones durante los procesos de extracción, amplificación y visualización; lo que daría lugar a un falso positivo Reacción de amplificación Recomendaciones específicas para la amplificación: Trabajar en el área pre-pcr, siempre en campana y siguiendo las recomendaciones del punto 5.1. Durante el proceso mantener los tubos separados y refrigerados. 15

16 Uso exclusivo en termocicladores convencionales que tengan velocidad de rampa de enfriamiento / calentamiento como máximo 3ºC por segundo. No usar termocicladores de rampas rápidas. En algunos modelos de termocicladores de rampas rápidas se puede bajar la velocidad de las rampas a 3ºC. 1. Descongelar el número de tubos de amplificación necesario según los genes que se vayan a analizar (de 1 a 6 tubos). Descongelar los tubos a 4ºC. 2. Centrifugar pocos segundos los tubos de amplificación en la microcentrífuga para que quede todo el líquido en el fondo del tubo (si no se dispone de adaptadores de microcentrífuga para los tubos, se pueden utilizar en su lugar tubos de un tamaño mayor a los que se les haya cortado la tapa). 3. Añadir 5-10 μl (ver punto 7.2) del ADN extraído previamente comprobada la concentración y pureza del mismo a cada tubo de amplificación y resuspender varias veces con la micropipeta. Mantener los tubos refrigerados en todo momento. 4. Programar en el termociclador los siguientes ciclos de temperaturas: 1 ciclo 95ºC 15 min 40 ciclos 94ºC 15 seg 62ºC 60 seg 1 ciclo 72ºC 10 min 4ºC continuo hasta la recogida de tubos 5. Iniciar el programa y colocar los tubos en el termociclador cuando el bloque haya sobrepasado los 90 ºC. De este modo se minimizan las posibles amplificaciones inespecíficas debidas a la incubación por debajo de la temperatura de hibridación. La duración de la amplificación oscila entre los minutos dependiendo del termociclador. El producto amplificado debe visualizarse en el plazo máximo de cinco días, para evitar la degradación del mismo, se conservará a 4ºC hasta su uso Visualización del producto amplificado en CLART-Strip (CS) Recomendaciones específicas antes de comenzar la visualización: EL PROTOCOLO DESCRITO A CONTINUACIÓN SE DEBE REALIZAR SIEMPRE EN EL ÁREA POST-PCR. NUNCA LLEVAR EL PRODUCTO AMPLIFICADO AL ÁREA DE PRE-PCR. 1. Encender el CAR (CLINICAL ARRAY READER) al comienzo del proceso. La autocalibración del equipo tarda unos minutos y es necesario además introducir el nombre de las muestras de cada pocillo en el programa antes de la lectura. El aparato debe estar listo en el momento de la lectura para evitar esperas innecesarias que produzcan un exceso de revelado. 16

17 2. Asegurarse de que antes de comenzar la hibridación, el termomixer de placas ha estado a 50ºC al menos 60 minutos. 3. La solución de hibridación a temperatura ambiente cristaliza, por lo que antes de uso debe calentarse a 50ºC hasta que la solución sea homogénea. 4. PREPARAR LA SOLUCIÓN DE LAVADO ANTES DE CADA ENSAYO, NO REUTILIZAR SOLUCIONES O RESTOS PREPARADAS CON ANTERIORIDAD. 5. Limpiar el termociclador con solución de lejía diluida al 10% antes de poner en marcha el programa de desnaturalización. Colocar los tubos de amplificación separados en el termociclador durante el proceso y nunca sobrepasar los 10 min. de desnaturalización. 6. Durante la visualización no hace falta utilizar puntas con filtro pero sí es necesario usar una punta diferente para cada pocillo y cambiarla cada vez que se añada un reactivo, aunque se trate de TL. Sí es necesario utilizar puntas con filtro durante la adición de amplificados al tubo CS. 7. En el caso de utilizar bombas de vacío equipadas con peines de 8 puntas para aspirar las soluciones, desechar los peines después de cada uso o descontaminarlos con una solución de lejía diluida al 10% tras cada ensayo. Asegurarse de que la bomba aspira adecuadamente y no deja restos en el fondo del pocillo. 8. Aspirar completamente las diferentes soluciones dentro de los pocillos sin tocar el array Visualización manual. 1. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso, colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar a 95ºC durante 8 minutos. Sacar los tubos de la incubación a 95ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo o a 4ºC Preparación de la Solución TL diluida: Por cada tira CS (8 pocillos en total), preparar 10 ml de solución de lavado diluida, añadiendo 1 ml de Solución TL a 9 ml de agua destilada. 3. Prelavado de los CS: antes de empezar el ensayo es necesario lavar los CS añadiendo 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo. Resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal, teniendo en cuenta que no se debe tocar la superficie del array. Se recomienda realizar este lavado mientras se están desnaturalizando los amplificados y mantener la solución de lavado en la tira hasta que se vaya a proceder a la adición de los mismos. Retirar la solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío. El array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer seco. Añadir la siguiente solución inmediatamente. 17

18 4. Hibridación: Antes de usar la Solución SH calentarla a 50ºC hasta la total dilución de las sales. Añadir 100 µl de solución SH (evitar que se forme espuma) a cada pocillo de los CS. A continuación, añadir de producto de PCR desnaturalizado de cada mix y gen amplificado al mismo pocillo del array los siguientes volúmenes: Mix 1 KRAS: 5 µl Mix 2 KRAS: 5 µl Mix 3 KRAS: 10 µl ( Tubo rojo) Mix 1 BRAF: 5 µl Mix 1 PI3K: 5 µl Mix 2 PI3K: 5 µl Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación SH, con cuidado de no tocar el fondo del pocillo. Se recomienda cargar cada tira de manera independiente y separada del resto para evitar contaminaciones. Cubrir con la tapa de plástico e incubar en en el termomixer de placa, tapado, durante 1 hora a 50 0 C, agitando a 550 rpm (asegúrese que el termomixer ha alcanzado 50 0 C y que lleva al menos 60 min a esa temperatura, ver punto 5.3). Es condición indispensable para la correcta interpretación de los resultados visualizar todos los tubos de la misma muestra en el mismo pocillo aunque sean genes distintos. Tras esta incubación, sacar la placa del termomixer y retirar la solución SH de los pocillos con pipeta o bomba de vacío: el array debe quedar sin restos de solución, aunque nunca debe permanecer seco. Añadir la siguiente solución inmediatamente. (Dejamos programado el termomixer de placa a 20 0 C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 6. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 5. Doble Lavado: añadir 200 µl de Solución TL diluida a cada pocillo, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal. Retirar la solución TL diluida con pipeta o preferiblemente con bomba de vacío multicanal sin dejar remanente. Repetir la operación. Usar puntas nuevas para cada lavado. Si llegado a este paso, el termomixer no hubiera llegado a los 20 0 C, se dejan los pocillos con esta solución hasta que el termomixer reduzca la temperatura. 6. Bloqueo y conjugado: se recomienda centrifugar la solución CJ de alta afinidad durante 10 segundos antes de usarla. A continuación, preparar la solución CJ diluida.para ello se debe,añadir 15 µl de Solución CJ de alta afinidad a 1 ml de solución DC por cada tira a procesar. Esta solución se debe de preparar 5 minutos antes de finalizar el tiempo de la hibridación. Retirar al máximo la solución TL diluida y añadir a cada pocillo del CS 100 µl de Solución CJ diluida. Incubar durante 30 minutos exactos en el termomixer a 20 0 C, agitando a 550 rpm. Tras esta incubación, sacar la placa y desechar la solución rápidamente, con pipeta o bomba de vacío. (Dejar programado el termomixer de placa a 25 0 C y en movimiento para su utilización posterior en el paso 8. Podemos quitar la tapa para que baje antes la temperatura). 18

19 7. Triple Lavado: añadir inmediatamente 200 µl de solución TL diluida a cada pocillo del CS, resuspender de 10 a 15 veces con la pipeta multicanal y retirar completamente la solución con la pipeta o vacío. Repetir la operación dos veces más. Es muy importante que no queden restos de Solución CJ ya que ésta reaccionaría con la Solución RE dando lugar a una señal inespecífica. 8. Revelado con Solución RE: retirar el máximo de solución TL diluida y añadir 100 µl de solución RE a cada pocillo. Incubar 10 minutos a 25 º C en el termomixer sin agitación. (Asegúrese que el termomixer ha alcanzado 25 0 C). Advertencia! Es muy importante utilizar el termomixer sin agitación. 9. Retirar la solución RE completamente del pocillo. El array debe quedar seco. 10. CAR (CLINICAL ARRAY READER): Realizar los pasos descritos en el punto Coloque la placa dentro del CAR, éste analizará las muestras automáticamente Visualización en autoclart 1. Encender el equipo autoclart y seguir las instrucciones que aparecen en la pantalla: 2. Cerrar la puerta y pulsar el mando. 3. Seleccionar Run en el menú de inicio. 4. Seleccionar el tipo de ensayo a realizar: CMA 5. Seleccionar el pocillo de la tira en el que se desea comenzar: A1 o E1, en el caso de que se reutilice un CS donde se han procesado previamente los 4 primeros arrays. 6. Seleccionar el número de muestras. Con autoclart se pueden procesar desde 4 a 96 muestras. El número de muestras debe ser un múltiplo de Confirmar que el número de muestras y el pocillo de inicio (A1 o E1) es correcto. 8. Colocar el rack completo de puntas en su posición correspondiente. 9. Chequear que el contenedor de puntas y el contenedor de desecho de reactivos están vacíos. 10. Llenar la botella de agua destilada con 250 ml de agua destilada. 11. Añadir los volúmenes de reactivos que autoclart solicita en función del número de muestras que se quieran procesar: TL (Tampón de lavado). El volumen que aparece en la pantalla, indica la cantidad de TL diluido necesaria. Para preparar el TL diluido realizar una dilución 1:10 del TL en agua destilada. 19

20 CJ (Conjugado). Se recomienda centrifugar el CJ durante 10 segundos antes de usarse. Cada 1 ml de solución CJ diluida que indique la pantalla se prepara añadiendo 1 ml de DC (Diluyente de conjugado) y 15 µl de Solución CJ. Se debe dar un vórtex a la solución una vez diluida para homogenizar. RE (Revelado). Añadir el volumen de revelado indicado en la pantalla. 12. Desnaturalización: utilizar el termociclador para desnaturalizar los productos de PCR. Para este paso colocar los tubos amplificados en el termociclador e incubar a 95ºC durante 8 minutos. Sacar los tubos de la incubación a 95ºC y colocarlos inmediatamente en un recipiente con hielo. Importante: desnaturalizar los productos de PCR antes de preparar los reactivos de visualización en el autoclart! 13. SH (Solución de Hibridación). Añadir el volumen de solución de hibridación atemperada a 50ºC que aparece en la pantalla. ADVERTENCIA: Es imprescindible añadir la SH en este punto, si se añade antes puede suceder que disminuya demasiado la temperatura de la solución de hibridación con la consecuente bajada de intensidad de las sondas pudiendo dar lugar a la aparición de falsos negativos. 14. Cerrar la puerta y pulsar el mando para comenzar. El equipo realizará el pre-lavado de los CS y la adición de la solución de hibridación. A continuación emitirá un pitido para indicar que es el momento de la adición de las muestras, el pitido cesará cuándo el usuario abra la puerta del equipo. 15. Para añadir las muestras sacar los CS del autoclart. y añadir el producto de PCR desnaturalizado de cada mix y gen amplificado al mismo pocillo del array los siguientes volúmenes: Mix 1 KRAS: 5 µl Mix 2 KRAS: 5 µl Mix 3 KRAS: 10 µl ( Tubo rojo) Mix 1 BRAF: 5 µl Mix 1 PI3K: 5 µl Mix 2 PI3K: 5 µl Resuspender varias veces para que se mezcle con la solución de hibridación con cuidado de no tocar el fondo del pocillo. A continuación introducir de nuevo la placa en el autoclart y pulsar el mando para que continúe el proceso de visualización. 16. Cuando ha terminado el proceso de visualización, el autoclart emite un pitido hasta que el usuario abre la puerta del equipo para sacar los CS y proceder a la lectura en el CAR. 20

21 17. ADVERTENCIA: Una vez finalizada la visualización en autoclart debe procederse de forma inmediata a la lectura de los resultados en el CAR, en caso contrario, podrían aparecer falsos negativos por pérdida de la intensidad de las sondas. 18. CAR (CLINICAL ARRAY READER): Coloque la placa dentro del CAR, éste analizará las muestras automáticamente. 8. LECTURA DE RESULTADOS El procesamiento de los datos obtenidos a partir de cada uno de los análisis, se realiza de forma automática. El equipo de lectura y análisis presentará un informe en el que se indican los resultados. 9. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Cada gen lleva su propio control de extracción para asegurar que hay suficiente material genómico para realizar la prueba. Para la interpretación correcta de los resultados, la muestra debe ser procesada con todos los tubos de amplificación necesarios para cada gen a analizar, y visualizados en el mismo array. Tal y como se describe en el punto 7.1, se debe incluir un control negativo de extracción para comprobar que las muestras no hayan sufrido contaminaciones durante los procesos de extracción, amplificación y visualización; lo que daría lugar a un falso positivo. Cada uno de los genes incluidos en el kit, con independencia del número de tubos de amplificación, contiene un control de amplificación y un control de extracción. Ambos controles son necesarios para la validación de los resultados. El control de extracción de ADN genómico es necesario para la confirmación de un verdadero resultado negativo, ya que nos informa de la presencia de ADN del paciente en la muestra, aunque no haya habido amplificación de ninguna mutación. El control interno de amplificación nos permitirá distinguir entre los casos de inhibición de la reacción de PCR y aquéllos en los que no se encontró ADN en la muestra. Existen tres causas por las que obtengamos un resultado de NO ANALIZADO : Extracción no válida: La presencia de inhibidores o un fallo mecánico en la extracción de la muestra, no permite la amplificación de las mutaciones y/o de los controles de amplificación y de extracción, para resolverlo es necesario repetir todo el proceso. Amplificación no válida: La ausencia de amplificación en uno de los tubos y presencia de amplificación en otros tubos, indicará que se ha realizado una correcta extracción 21

22 pero que ha habido un fallo en la amplificación de alguno de los tubos, para resolverlo se deben amplificar de nuevo los tubos correspondientes y continuar el proceso. No inclusión del gen en el análisis: Cuando no incluímos alguno de los tres genes en el análisis, aparecerá en el informe como no analizado El software podría ofrecer un resultado NO CONCLUYENTE : En aquellos casos en que las lecturas de absorbancia de las réplicas de una sonda del array sean muy distintas entre sí. 10. ESPECIFICACIONES TÉCNICAS Y DE FUNCIONAMIENTO 10.1 Control de interferencias conocidas: Uno de los inconvenientes de la detección por amplificación genómica son los falsos negativos debidos, bien a una calidad inadecuada del ADN extraído de la muestra (por toma de cantidad insuficiente de muestra, por degradación del ADN debida a una incorrecta conservación, o por pérdida del ADN de la muestra durante su extracción), o bien a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa en las muestras que se quieren analizar (alcohol, sales, etc). Con el kit CLART CMA KRAS BRAF PI3K se han eliminado estos falsos negativos añadiendo a los tubos distintos controles internos de amplificación, que son indicativos de la eficiencia de la reacción de amplificación. No obstante para evitar estos inconvenientes se deben seguir las indicaciones que aparecen en los apartados 5, 6 y 7 de este manual Especificaciones técnicas: Parámetros Analíticos: Sensibilidad analítica: La sensibilidad analítica se ha determinado mediante la amplificación de diluciones seriadas de ADN de plásmidos recombinantes para cada una de las mutaciones que detecta el kit. Cada uno de ellos lleva inserto el producto amplificado (incluyendo la parte complementaria a las sondas específicas de detección). Dicha sensibilidad también se ha determinado mediante la amplificación de diluciones seriadas de líneas celulares comerciales que contienen la mutación a determinar. La visualización se realizó en CS dando lugar a los siguientes resultados (Tabla 1): Mutación puntual Nº copias de plásmido recombinante por Cantidad de DNA de líneas celulares 22

23 Especificidad analítica: reacción de PCR G12A G12C G12D G12R G12S G12V G13D Q61H V600E V600K E542K E545D E545K H1047R ng Tabla 1. Relación del número de copias de plásmido recombinante/nanogramos de línea celular necesarias para obtener una sensibilidad del 100% en la detección de cada una de las mutaciones. Se llevaron a cabo experimentos de especificidad con 13 plásmidos recombinantes y líneas celulares, observándose que no se produce detección inespecífica de otras mutaciones diferentes a la que se quiere determinar. Por tanto, se considera que la técnica alcanza una especificidad analítica del 100%. Parámetros de utilidad diagnóstica: Para determinar los parámetros diagnósticos del kit, se realizó una evaluación comparativa del kit CLART CMA KRAS BRAF PI3K con la técnica de referencia (TheraScreen ). Para esta evaluación se ha colaborado con los siguientes centros: Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Vall d Hebron, Barcelona, España. Departamento de Patologia, Centro de Investigación Clínica, Hospital Universitario Copenhague, Hvidovre, Dinamarca. Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario 12 de Octubre de Madrid, España. A partir de 408 extraídos de biopsias se analizó la presencia de cada una de las mutaciones que se detectan con el kit. Para cada muestra se asume como verdadero el resultado concordante entre la técnica de referencia y CLART CMA KRAS BRAF PI3K. En el caso de existir discordancias entre ambas técnicas, se considera como verdadero el resultado de la secuenciación. 23

24 Mutación N=408 Sensibilidad Especificidad VPP VPN G12A 25 96,00 99,48 92,31 99,74 G12C 23 86,96 100,00 100,00 99,23 G12D 68 98,53 99,71 98,53 99,71 G12V 52 92,31 100,00 100,00 98,89 G12R 7 100,00 99,75 87,50 100,00 G12S 25 96,00 100,00 100,00 99,74 G13D 39 92,31 100,00 100,00 99,19 Q61H 3 100,00 100,00 100,00 100,00 Q61L 2 100,00 100,00 100,00 100,00 V600E ,00 99,47 93,75 100,00 V600K 2 100,00 100,00 100,00 100,00 Native 132 NA 98,51 NA 97,06 Tabla 2. Sensibilidad y Especificidad diagnósticas de la técnica CLART CMA- KRAS-BRAF.PI3K para cada mutación.vpp: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo. NOTA: Debido a la baja prevalencia no se ha contado con muestras positivas para los siguientes mutaciones : E542K,E545D, E545K y H1047R. Por lo tanto, para dichas cuatro mutaciones no se ha podido identificar la sensibilidad diagnóstica. Por lo que para todos los casos se ha evaluado la sensibilidad analítica mediante plásmidos recombinantes. Especificidad diagnóstica. La técnica se ha validado con un número de 132 muestras negativas dando lugar a una especificidad cercana al 100% para todas las mutaciones puntuales. Reproducibilidad y repetibilidad diagnóstica. Los datos obtenidos son los siguientes, Reproducibilidad: 94.4% (n=67 muestras) y Repetibilidad: 94.4% (n=51 muestras). Las tandas de reproducibilidad y repetibilidad se han procesado desde la extracción de la biopsia hasta la visualización en el array del material amplificado. 24

25 11. BIBLIOGRAFÍA Molecular Mechanisms of resistance to Cetuximab and Panitumumab in Colorectal Cancer. A Bardelli & S Siena. 2010, J Clin Oncol, 28: Biomarkers Predicting Clinical Outcome of Epidermal Growth Factor Receptor-Targeted Therapy in Metastatic Colorectal Cancer. S Siena, A Sartore-Bianchi, F Di Nicolantonio, J Balfour, A Bardelli. 2009, J Natl Cancer Inst, 101: Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PI3KCA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. W De Roock, B Claes, D Bernasconi, J De Schutter, B Biesmans, G Fountzilas et al. 2010, Lancet Oncol, 11: KRAS, BRAF, PI3KCA, and PTEN mutations: implications for targeted therapies in metastatic colorectal cancer. W De Roock, V De Vriendt, N Normanno, F Ciardiello, S Tejpar. 2011, Lancet Oncol, 12:

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