ENZIMAS I TEMA Introducción

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1 TEMA 7 ENZIMAS I 1. Introducción 2. Las enzimas como catalizadores 3. Nomenclatura y clasificación de enzimas 4. Cofactores enzimáticos 5. Modelos de actuación de las enzimas 1. Introducción La vida depende de la existencia de unos catalizadores muy potentes y altamente específicos denominados enzimas. De hecho, todos los pasos de todos los procesos metabólicos están catalizados por enzimas y la capacidad catalítica se considera, junto con la capacidad de autorreplicación, una de las características fundamentales de la vida. Con la excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico (los ribozimas), todas las enzimas conocidas son proteínas. El nombre de enzima ("en la levadura") no se empleó hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biológicos intervenían en muchos procesos. Así en 1850, Louis Pasteur concluyó que la fermentación de azúcar en alcohol por levaduras estaba catalizada por lo que llamó fermentos, que él consideraba inseparable de las células de levadura vivas. En 1897, Büchner, consiguió extraer las enzimas que catalizaban la fermentación alcohólica de las células de levadura, terminando así con la teoría vitalista. No obstante hubo que esperar hasta 1926, cuando Sumner consiguió purificar y cristalizar por primera vez una enzima, la ureasa, para demostrar su naturaleza proteica. En la actualidad se conocen más de 2000 enzimas diferentes, muchas de las cuales se han aislado en forma pura. Se utilizan potentes técnicas de purificación y secuenciación, técnicas de difracción de rayos X, RMN, etc., para conocer su estructura, y técnicas de mutagénesis dirigida para conocer más sobre su funcionalidad y sus mecanismos de actuación. 2. Las enzimas como catalizadores 72

2 La función principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las reacciones de los seres vivos; Las reacciones necesarias para la célula (digestión de alimentos, envío de señales, contracciones musculares) sencillamente no se darían en ausencia de catalizadores. La enzima a través de su sitio activo propociona el ambiente especifico para hacer energéticamente más favorables reacciones que en ausencia de catalizadora serían inviables. Aunque tiene ciertas peculariedades (alta eficiencia, especificad, capacidad de regulación,..) siguen los principios generales de la catálisis química. Todas las reacciones químicas tienen lugar porque cierta fracción de la población de moléculas reactantes poseen la suficiente energía como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transición, en el que es muy elevada la probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los productos. Este estado de transición reside en la cima de la barrera energética que separa los reactantes de los productos, como muestra la Figura 1. En ella se observa el diagrama de energía para una reacción química, no catalizada y catalizada, donde la energía libre de activación es la cantidad de energía necesaria para llevar todas las moléculas de un mol de sustancia, a una temperatura determinada, al estado de transición. Figura 1. Evolución energética de una reacción química. Se observa la diferencia energética entre los estados de transición de las reacciones catalizada y no catalizada. Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reacción química. Uno de ellos es la elevación de la temperatura (ya que provoca un incremento en la velocidad de las moléculas); el otro consiste en utilizar un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activándolos, produciendo un estado de transición de menor energía que en la reacción no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. 73

3 La Tabla 1 muestra una comparación de las energías de activación para la descomposición del peróxido de hidrógeno, en ausencia o presencia de un catalizador. En ella se puede apreciar cómo el catalizador enzimático baja aún más la barrera energética que ha de superarse desde el nivel de reactivos para alcanzar el estado de transición. Esta es una característica común de las enzimas. Su alto poder catalítico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cuál puede ser absoluta para un único sustrato o relativa, cuando permite la reacción de compuestos diferentes pero con una estructura similar. Tabla 1 Descomposición enzimática del agua oxigenada. comparación de las energías de activación para la descomposición del peróxido de hidrógeno, en ausencia o presencia de un catalizador Reacción Catalizador Temperatura (ºC) Energía (Kcal/mol) Descomposición Ninguno de H 2 O 2 Fe Catalasa 22 1,7 La especificidad de las enzimas es muy importante para los seres vivos. Cada célula contiene varios cientos de miles de compuestos diferentes, y existen muchas combinaciones posibles entre las reacciones químicas que estos compuestos pueden experimentar. Las enzimas cuidan de que tengan lugar, de manera específica, aquellas reacciones que son esenciales e indispensables para que la célula viva. Los catalizadores intervienen en la reacción pero no en su balance pues no aparecen como productos iniciales ni finales de modo que no alteran el incremento de energía libre y por tanto la termodinámica de la reacción. G o = RT ln K e 74

4 La constante de velocidad aplicando la teoría del estado de transición como veremos puede expresarse como [ S 1 ][ S 2 V = k ] k = KT h e G / RT siendo K la constante de Boltzmann y h la de Planck. Hay una relación inversa entre la constante de velocidad y la energía de activación. Además de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos características que diferencian a las enzimas de los catalizadores químicos, son que las enzimas pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad. 3. Nomenclatura y clasificación de las enzimas Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molécula sobre la cuál ejerce su actividad catalítica. Por ejemplo la ureasa cataliza la hidrólisis de la urea, y la arginasa cataliza la hidrólisis de la arginina (a urea y ornitina). Otras enzimas han recibido su nombre en función del tipo de reacción que catalizan; así la Gliceraldehído-3P-deshidrogenasa cataliza la oxidación del la Gliceraldehído-3P. Incluso algunas se conocen de hace mucho tiempo y mantienen su nombre, sin dar información alguna del sustrato o la reacción que catalizan (tripsina). No obstante existe una clasificación sistemática de las enzimas que las divide en 6 grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases: 1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción) 2: Transferasas (transfieren grupos funcionales) 3: Hidrolasas (reacciones de hidrólisis), 4: Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces) 5: Isomerasas (reacciones de isomerización) 6: Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP). A cada enzima se le asigna un número con cuatro componentes. Los tres primeros indican la clase, subclase y sub-subclase, respectivamente, y el último es un número 75

5 de orden. Así, por ejemplo, la enzima alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidación de etanol a acetaldehído, y por lo tanto pertenece al grupo 1, se designa como EC La Tabla 2 muestra la clasificación internacional de las enzimas en los seis grupos antes citados. Tabla 2 Clasificación internacional de enzimas. 4. Cofactores enzimáticos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína, mientras que otras necesitan, además, uno o más componentes no proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una molécula orgánica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la proteína (suele ser el ión metálico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prostético, o débilmente unido, por lo que en realidad actúa como un sustrato específico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molécula orgánica, coenzima). La Tabla 3 muestra una relación de iones metálicos que actúan como cofactores de enzimas. 76

6 Tabla 3 Iones metálicos como cofactores. La Tabla 4 muestra algunos de los coenzimas más habituales en la catálisis enzimática. Tabla 4 Algunos coenzimas mayoritarios en catálisis enzimática. 77

7 El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es inactiva catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima. HOLOENZIMA = APOENZIMA + COFACTOR Centro activo Apoenzima Holoenzima Cofactor En las enzimas el cofactor puede actuar como centro catalítico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima ó agente estabilizante de la actividad enzimática (conformación). Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su estructura, alguna vitamina (sustancias orgánicas que, en cantidades mínimas, son vitales para el funcionamiento de todas las células, y deben figurar en la dieta de algunas especies) o molécula derivada de ella. Los coenzimas actúan por lo general como transportadores intermedios de átomos específicos o de electrones. 5. Modelos de actuación de las enzimas Las enzimas son catalizadores extraordinarios, consiguen enormes aumentos de la velocidad de la reacción y son altamente selectivos. Como consiguen un descenso tan espectacular de las energías de activación?. Para explicar la actividad catalítica de las enzimas, se ha propuesto un mecanismo general, en dos etapas: S + E ES P + E En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molécula de sustrato (S), para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En una segunda etapa, el complejo se fragmenta 78

8 dando lugar al producto (P) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molécula de sustrato. Por lo general, la molécula de enzima es mucho mayor que la del sustrato por lo que sólo una pequeña parte de la enzima está implicada en la formación del complejo; esta región que interacciona con el sustrato y en la que tiene lugar la reacción, se denomina sitio activo de la enzima. El sitio activo es una región tridimensional de la enzima con una distribución de los grupos única para posibilitar la unión a su sustrato específico. Dichos grupos del enzima no tienen por qué ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la proteína y reciben el nombre de centros catalíticos. En la figura podemos ver los centros catalíticos (Arg-145, Glu-270, tyr-248) y el cofactor (Zn) que conforman el sitio activo de la enzima carboxipeptidasa, implicada en la hidrólisis del extremo C terminal de las proteínas. Figura 2. Sitio activo de la carboxipeptidasa El modelo más conocido sobre el mecanismo de reacción de las enzimas es el de Fischer, quien propuso que la molécula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo haría una llave al encajar en una cerradura, es decir, que tienen una relación estructural complementaria (Figura 3). No obstante, esta hipótesis tiene ciertas limitaciones: si el centro activo posee una estructura prediseñada para el sustrato, en caso de que sea reversible el proceso dicho debería estar perfectamente diseñado para que también encaje el producto de la reacción. De la misma forma, la teoría de la llave-cerradura tampoco explica bien el fenómeno de la inhibición enzimática. Figura 3. Modelos de acción enzimática. Modelo llave-cerradura de Fischer. 79

9 Otra hipótesis más aceptada actualmente es la del enzima flexible o de ajuste inducido (modelo de Koshland), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad geométricamente rígida y preexistente, sino que dicho sitio activo debe tener una disposición espacial, precisa y específica, de ciertos grupos de la enzima que en presencia del sustrato se adaptan a su estructura cuando interaccionan con él (Figura 4). Figura 4. Modelos de acción enzimática. Modelo de ajuste inducido de Koshland. Independientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato, mediante un mecanismo de distorsión, se activan los enlaces que hay que romper y se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formación del producto resultante de la reacción catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso catalítico. La Figura 5 muestra el caso de una enzima (hexoquinasa) que nos sirve para ilustrar el modelo de Koshland, en ella se puede ver como en el sitio activo posee una conformación inicial que se modifica al interaccionar con el sustrato y formal el complejo [ES]. Figura 5. Modelo de ajuste inducido de Koshland. Hexokinasa. 80

10 6. Enzimas no proteícas: ribozimas y deoxiribozimas Hasta hace poco se suponía que todas las reacciones de catálisis bioquímica se llevaba a cabo por proteínas, pero en 1983 Altman y sus colaboradores descubrieron que la parte proteíca de la ribonucleasa P por si sola no era activa, mientras que el supuesto cofactor de ARN de esta enzima si podía por si solo catalizar la reacción. El complejo ARN-proteíco ribonucleasa P fragmenta los precursores de los ARNt para producir ARNt funcionales. Se comprobó que la parte ribonucleica del complejo (en presencia de Magnesio) no solo era capaz de fragmentar la molécula, sino que además obedecía a la cinética de Michaelis-Menten. Después de estos primeros ejemplos se han descrito un gran numero de ARN con propiedades catalíticas, como la actividad peptidil transferasa que cataliza la formación del enlace peptídico durante la síntesis de péptidos en los ribosomas parece que recae en la parte no proteíca de la subunidad 50S. Esto aunque en principio pareció sorprendene no lo es tanto. El hecho de que el ARN posea capacidad de autorreplicación y catálisis confirma el papel primordial de estas moléculas en la evolución. La vida podría haberse basado en el ARN antes de la aparición de las proteínas y el ADN. Muy recientemente (1994). Se ha descrito una desoxirribozoma. Una molécula de ADN monocatenario con Histidina como cofactor, capaz de hidrolizar el ADN. 81