Espectrometría de masas CG-EM CL-EM

Transcripción

1 Espectrometría de masas CG-EM CL-EM

2 Espectrometría de masas Es una técnica instrumental sofisticada que separa y detecta iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar moléculas gaseosas convirtiéndolas en iones (generalmente cationes), que se separan al ser acelerados por un analizador de masas: la separación se basa en la distinta relación m/z de los iones.

3 Espectrómetro de masas Componentes del instrumento Introducción de la muestra Fuente de ionización torr Separador de masas Detector iónico El acoplamiento entre CG y CL con EM se analizará más adelante Sistema de vacío Procesador de señal Registrador

4 Fuentes de ionización Ionización por impacto electrónico Ionización química Fuente de bombardeo con átomos rápidos Desorción con láser Ionización a presión atmosférica: - Electronebulización asistida con un gas: electrospray - Ionización química a presión atmosférica - Fotoionización a presión atmosférica CL

5 Ionización por impacto electrónico moléculas neutras gaseosas filamento de W placas aceleradoras (4000 V) placa de repulsión haz de electrones (70 ev) placas focalizadoras Las moléculas gaseosas son bombardeadas por un haz de electrones de alta E cinética generados por un filamento de tungsteno o renio M + e iones M e ion molecular (alta energía interna)

6 Ionización por impacto electrónico El ión molecular tiene alta energía interna que se disipa por reacciones de fragmentación y reordenamiento +. +.

7 Ionización por impacto electrónico Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos) ABCD + e ABCD. + ABCD e A + + BCD. A. + BCD + BC + + D B + A + CD. + AB + A + B + AB. + CD + D + C + C + D + Fragmentación del ion molecular ABCD. + ADBC. + BC. + AD + AD. + BC + Reordenamiento seguido de fragmentación Colisión seguida de ABCD. + + ABCD (ABCD) + 2. BCD. + ABCDA + fragmentación

8 Ionización por impacto electrónico Porqué se fija a un valor estándar de 70 ev? esta es la E electrónica a la cual ocurre la mayor formación de iones. el espectro de masas cambia solo ligeramente con cambios en las proximidades de esta energía. se obtiene mucha información estructural. la distribución de E interna de los iones formados es prácticamente la misma para distintos instrumentos, volviendo a los espectros virtualmente independientes del equipo usado. En condiciones establecidas (E del haz de electrones constante) el patrón de fragmentación es el mismo para el mismo analito

9 Ionización química Las moléculas de analito son indirectamente ionizadas vía una serie de reacciones con un gas reactivo Gas reactivo: metano, isobutano, amoníaco [cámara de ionización de alta presión a 10 torr (0.013 atm)] CH 4 + ê de alta energía CH 4 + y CH 3 + CH CH 4 CH CH 3 CH CH 4 C 2 H H 2 moléculas reactivas Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito CH MH MH CH 4 C 2 H MH M + + C 2 H 6

10 Separador de masas Utiliza un campo eléctrico o magnético para afectar la trayectoria o la velocidad de las partículas cargadas EM de sector magnético EM de cuadrupolo EM de tiempo de vuelo EM de trampa iónica

11 Espectrómetro de masas de sector magnético Instrumento de sector de 90 o Utiliza un electroimán para hacer que el haz de iones de la fuente se muevan en una trayectoria circular de 180, 90 o 60 grados.

12 Espectrómetro de masas de sector magnético Instrumento de sector de 90 o Los iones formados se aceleran a través de la rendija B hacia el tubo analizador metálico (presión = 10-7 torr). Se puede variar la fuerza del campo del imán o el potencial de aceleración entre las rendijas A y B.

13 Espectrómetro de masas de sector magnético Instrumento de sector de 90 o Cada catión pasa a través de la rendija de salida y cuando llega al detector se neutraliza con un electrón (electrodo colector). La corriente necesaria para neutralizar el haz de cationes es proporcional al número de cationes que llegan al detector.

14 Espectrómetro de masas de sector magnético Instrumento de sector de 90 o El espectro de masas es una representación de esta corriente en función del número de masa seleccionado por el campo.

15 Espectrómetro de masas de sector magnético F M = Bzv F C = mv 2 /r Cómo se separan los iones de distinta masa? Cuando las placas aceleradoras aceleran un ion por aplicación de una diferencia de potencial, el ion adquiere una energía cinética igual a: E cinética = ½ mv 2 = zv v = (2zV/m) ½ mv 2 /r = Bzv v = Bzr/m m : masa v : velocidad de la partícula z : carga V : diferencia de potencial Por otro lado, si el ion circula perpendicularmente a un campo magnético B, sobre él actúan fuerzas centrípeta y centrífuga igual a: F M : fuerza centrípeta F C : fuerza centrífuga B : campo magnético r : radio de curvatura Bzr/m = (2zV/m) ½ m/z = B 2 r 2 /2V

16 Espectrómetro de masas de cuadrupolo 4 barras metálicas cortas de 6 mm de diámetro, paralelas entre sí y dispuestas simétricamente alrededor del haz de iones Ø = 6 mm Un par de barras están conectadas al polo positivo y el otro par a la terminal negativa. A las barras se aplica un voltaje cte que genera una corriente continua o directa y potenciales de corriente alterna de radiofrecuencia variable, desfasadas 180.

17 Espectrómetro de masas de cuadrupolo Ø = 6 mm Los campos eléctricos combinados hacen que los iones oscilen alrededor de su eje central de trayectoria haciéndolos seguir trayectorias distintas hacia el detector. Solo llegan los iones resonantes (con determinada m/z) que no colisionan con las barras

18 Potencial corriente directa Potencial de radiofrecuencia Espectrómetro de masas de cuadrupolo Relación de voltajes durante un barrido de masa con un analizador cuadrupolo tiempo masa

19 EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight) pulsos de 300 V, veces/s Se aplica una ΔV a las rejillas aceleradoras de 300 V (3000 a veces por segundo) para acelerar los iones y lanzarlos a un tubo de deriva con una energía cinética constante. Los iones, con igual energía cinética pero distinta relación masa/carga, adquieren distinta velocidad.

20 EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight) pulsos de 300 V, veces/s E cinética = ½ mv 2 El orden de llegada al detector es: desde los más livianos a los más pesados. En el EM se representa la corriente del detector en función del tiempo.

21 Espectrómetro de masas de trampa iónica (ITD) electrodo anular central V rf tapa tapa Consiste en un electrodo anular y un par de electrodos colectores. Cuando las moléculas llegan a la trampa, se ionizan y fragmentan. Los iones permanecen en la trampa iónica con trayectorias estables. Al electrodo anular se aplica un potencial de radiofrecuencia variable que controla el barrido.

22 Espectrómetro de masas de trampa iónica (ITD) electrodo anular central V rf tapa tapa El análisis de los iones se logra con pulsos sucesivos de radiofrecuencia (rf) creciente: las trayectorias se vuelven inestables y los iones son expulsados sucesivamente por la trampa hacia el multiplicador de electrones donde se detectan. Los iones se retienen o expulsan de la trampa en función de su relación m/z.

23 Espectros de masas Dependen de: Energía de ionización de la molécula Grupos funcionales de la molécula Método de ionización Presión y temperatura de trabajo Diseño instrumental

24 Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico Etilbenceno pico base En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH 3 ion molecular (ion parent ) M + fragmento de mayor masa Átomos y grupos frecuentemente desplazados molécula con número par de N M + con masa par molécula con número impar de N M + con masa impar 4 H M-4 F M-19 CH 3 M-15 HF M-20 NH 3 M-17 C 2 H 2 M-26 H 2 O M-18

25 Espectros de masas de cloruro de metileno Impacto electrónico pico base pérdida de Cl Picos isotópicos 12 C 1 H 2 35 Cl 2 (m= 84) 13 C 1 H 2 35 Cl 2 (m= 85) 12 C 1 H 2 35 Cl 37 Cl (m= 86) 13 C 1 H 2 35 Cl 37 Cl (m= 87) 12 C 1 H 2 37 Cl 2 (m= 88)

26 Espectros de masas de pentobarbital (sedante) Impacto electrónico Ionización química El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue

27 Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158) Impacto electrónico Ionización química

28 Cromatografía Gaseosa EM Sistemas de acople

29 Separador de chorro (columnas rellenas)

30 Ensamblaje con columnas capilares desde el CG cámara de evacuación hacia la bomba A cámara de ionización constricción de entrada tubo de vidrio poroso constricción de salida collarín que se atornilla en el receptáculo de fuente iónica

31 Cromatografía Líquida EM Sistema de acople Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución

32 Consideraciones en la conexión LC/MS

33 Ionización a presión atmosférica (API) Es una familia de técnicas que incluye Electronebulización asistida con un gas: electrospray (ESI) Ionización química a presión atmosférica (APCI) Fotoionización a presión atmosférica (APPI)

34 Electronebulización asistida con un gas Electrospray (ESI)

35 Malla de montaje: V (atraerá cargas + a la superficie de la gota) (ortogonal) HPLC Iones desolvatados La fase móvil con el analito se nebulizan a un elevado voltaje asistidos con una corriente coaxial de N 2 generando un fino aerosol, con formación de microgotas altamente cargadas (la solución ya contiene iones )

36 Malla de montaje: V (atraerá cargas + a la superficie de la gota) (ortogonal) HPLC Iones desolvatados A medida que el solvente se evapora, la densidad de carga en las gotas aumenta y al llegar al límite Rayleigh la gota sufre explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas. Los iones libres de solvente (desolvatados) se mueven hacia el analizador de masa. En el caso mostrado, la diferencia de potencial negativa hace que los cationes entren al capilar

37 La solución se inyecta directamente en el instrumento La caída de voltaje entre la fuente y el analizador genera gotas ionizadas El solvente se evapora a medida que las gotas hacen su recorrido presión atmosférica vacío

38 Expulsión de gotas cargadas La solución inyectada usualmente incluye agentes ionizantes: H +, Na +, K + Agua Metanol Cloroformo Acetonitrilo Gas y/o calor disminuyen el tamaño de las gotas Las gotas grandes espontáneamente se rompen en gotas menores debido a repulsión electrostática Los iones resultantes pueden ser sencillos o con carga múltiple

39 Iones observados frecuentemente

40 Cuándo es apropiado trabajar en ESI? - Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito de interés debe ser capaz de portar carga en solución Ejemplos: a) Muestras con heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas b) Ácidos y bases c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato, aminas, etc d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos, proteínas, oligonucleótidos) e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida Evitar: muestras con grupos no polares (ej. HPAs)

41 Ionización química a presión atmosférica APCI

42 La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersan en pequeñas gotas) y vaporizan a elevada temperatura, y entran en la región corona (entre la aguja y el capilar).

43 Las moléculas de fase móvil se ionizan en la región corona por electrones provenientes de una descarga eléctrica, transformándose en iones gaseosos reactivos

44 Estos iones reactivos (iones formados de la fase móvil) reaccionan con las moléculas de analito, ionizándolas

45 Ionización APCI clásica Reacciones de ionización positiva Reactivo/reacción electrón solvente e - fase gas [solvente+h] + Transferencia protónica [solvente+h] + + analito fase gas [analito+h] + + solvente

46 Captura electrónica Reacciones de ionización negativa e - fase gas + solvente [solvente] - Intercambio de cargas [solvente] - + analito Ionización APCI clásica fase gas [analito] - + solvente Reacciones ion molécula analito + [solvente] - fase gas [analito-h] - + [solvente+h]

47 Cuándo es apropiado trabajar en APCI? Muestras: Compuestos de PM/polaridad intermedias (bifenilos policlorados (PCBs), ácidos grasos, ftalatos, etc). Compuestos sin grupos ácidos/básicos (ej: hidrocarburos, alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres) Muestras con heteroátomos (ureas, benzodiacepinas, carbamatos, etc). Analitos con mal comportamiento ESI Parámetros en solución: Mucho menos sensible a las condiciones de disolución que ESI. Tolera mayores flujos. Admite solventes no compatibles con ESI Evitar: muestras térmicamente lábiles, o cargadas en solución, o biomoléculas (habitualmente no volátiles).

48 Principales características de ESI y APCI Estas interfaces son hoy en día las más utilizadas

49 Fotoionización a presión atmosférica APPI

50 APPI (modo positivo) El solvente y la muestra se nebulizan y son completamente vaporizados por calefacción. La ionización del solvente y la muestra ocurre por bombardeo con fotones a partir de una lámpara UV

51 La molécula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial de ionización del analito es menor a la energía del fotón). El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente para formar [M+H] + Un dopante fotoionizable está en exceso y rinde muchos iones moleculares. El analito se ioniza por transferencia protónica a partir del dopante o solvente El ión molecular del dopante ioniza al analito por transferencia electrónica

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53 Cuándo usar APPI? Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI o APCI (ej: PAHs). Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos (THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no hidrosolubles). Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que APCI. Es robusto y altamente reproducible.

54 Peso molecular Selección del sistema CL/EM ESI APPI GC/MS APCI No polar Polaridad del analito Muy polar

55 Registros gráficos CG-EM y CL-EM Modos de adquisición de la señal Cromatograma de corriente iónica total Cromatograma de ión seleccionado Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo (información cromatográfica) y en función de la relación m/z (información espectroscópica)

56 Registros gráficos CG-EM y CL-EM Modos de adquisición de la señal Modo scan Consiste en hacer barridos entre dos valores de masas para tener la información total de la muestra. Se emplea en análisis cualitativo para la identificación de compuestos por búsqueda en biblioteca de espectros. También se usa para cuantificar.

57 Registros gráficos CG-EM y CL-EM Modos de adquisición de la señal Se puede trabajar con: Modo scan TIC (total ion chromatogram) cromatograma correspondiente a la suma de abundancias a todas las masas adquiridas. Sensibilidad media EIC (extracted ion chromatogram) cromatograma correspondiente a una determinada masa (extraída del barrido) Alta sensibilidad y selectividad

58 Registros gráficos CG-EM y CL-EM Modos de adquisición de la señal Modo SIM Consiste en una monitorización selectiva de iones característicos de la muestra. Ideal para cuantificar vestigios de compuestos conocidos. En este modo, el detector es muy sensible y muy selectivo.

59 Registros gráficos CG-EM y CL-EM Modos de adquisición de la señal Modo SIM La comparación de las respuestas relativas de los distintos iones con respecto a las del patrón permite confirmar la identificación del compuesto analizado. La sensibilidad aumenta con la disminución del número de masas seleccionado.

60 Modos de adquisición en GC/MS SCAN vs SIM

61 Síntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM) CH 3 (CH 2 ) 3 OH + Br - CH 3 (CH 2 ) 3 Br + OH - 1-butanol 1-bromobutano cromatograma EM pico 1 EM pico 2

62 Combustión de tela tratada con producto ignífugo Cromatograma de corriente iónica total (TIC) EM de pico 12 (benceno)

63 Confirmación presencia de cocaína en orina por CG-masa Cromatograma de corriente iónica total EM del pico a 11.5 min EM de testigo de cocaína (m = 303) a igual tiempo de elución

64 Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLCmasas Cromatograma convencional con detección UV Detección de un ion seleccionado m/z = 312 (corresponde a MH + formado a partir de imazaquina de masa = 311) Cromatograma de masas de corriente iónica total

65 Representación de la estructura tridimensional de datos CG-EM en modo barrido completo (full-scan) Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a determinados tiempos de retención)