PRACTICA 1 Determinación por espectrofotometría de la concentración de carbohidratos en una muestra alimentaria.

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1 PRACTICA 1 Determinación por espectrofotometría de la concentración de carbohidratos en una muestra alimentaria. FUNDAMENTO TEÓRICO El término espectrofotometría se refiere al uso de la luz para medir las concentraciones de sustancias químicas. Cuando una molécula absorbe un fotón, su energía se incrementa. Se dice que pasa a un estado excitado. Si por el contrario emite un fotón, su energía disminuye. El estado de menor energía de una molécula se denomina estado basal o fundamental. En la siguiente figura se describe un esquema básico de un espectrofotómetro: Fuente de luz Monocromador (Selección de longitud de onda) P o Celda con el analito P Detector de luz Una fuente de luz se hace pasar por un monocromador. Éste permite seleccionar un haz de luz con una única longitud de onda. Este haz de luz monocromática incide sobre una celda de ancho b que contiene la solución con el analito. Si la solución absorbe la luz, la potencia radiante incidente (P o ) (1) del haz de luz disminuye al emerger de la celda. Los valores de la potencia radiante emergente (P) tienen que cumplir necesariamente la siguiente relación: (1) La potencia radiante se define como energía por unidad de tiempo y por unidad de área o sección. - Magnitudes en Espectrofotometría La transmitancia se define de la siguiente forma: P T = En tanto, la absorbancia se define como: P P o P O A = - log T = log Po P 1

2 Cuando no se absorbe luz, P = P o y por lo tanto A = 0. Cuando se absorbe 90 % del haz de luz, 10 % de éste se transmite, por lo que P = P o / 10 y A = 1. - Ley de Beer A = e Donde: A es la absorbancia (magnitud adimensional) e es un coeficiente de proporcionalidad denominado coeficiente de extinción molar. Indica la absorbancia de una determinada sustancia a una longitud de onda dada y se expresa en M -1. cm -1. b es el ancho o espesor de la celda donde se deposita la muestra y se expresa en cm. c es la concentración expresada en moles / Litro (M) La ley de Beer establece que la absorbancia es proporcional a la concentración de las especies absorbentes. Dicha ley se verifica muy bien en un rango definido de concentraciones ( 0.01 M). Las desviaciones aparentes de la ley de Beer en soluciones más concentradas pueden atribuirse a cambios en las propiedades de las especies absorbentes de la solución. Conforme una solución se vuelve más concentrada, las moléculas de soluto interactúan entre sí debido a su proximidad, modificando sus propiedades de absorber la luz. De ello resulta que la gráfica de Absorbancia en función de la concentración pierde su linealidad. - Carbohidratos en mostos y reacción de color Los hidratos de carbono en los mostos se presentan principalmente en forma de azúcares (glucosa y fructosa). Desde el punto de vista químico, la glucosa y fructosa son monosacáridos. La reacción de color para medir la concentración de carbohidratos solubles por espectrofotometría se basa en la utilización de un compuesto llamado antrona que se disuelve en ácido sulfúrico concentrado. El medio ácido hidroliza el enlace glicosídico de los oligosacáridos y los monosacáridos resultantes reaccionan con la antrona (estructura al margen) produciendo un color verde azulado. PROTOCOLO EXPERIMENTAL AVISO IMPORTANTE: NO SE DEBE PIPETEAR NUNCA CON LA BOCA, SE DEBE USAR SIEMPRE EL PIPETEADOR ADECUADO Y MANTENER LAS PIPETAS LIMPIAS - Preparación del reactivo Antrona-Acido Sulfúrico. Disolver 0.2 g de Antrona en 100 ml de Acido Sulfúrico 96%. El reactivo sirve para 3-4 días conservándolo a 0 C y en botella de color topacio. ESTE REACTIVO YA ESTÁ PREPARADO Y DEBE SER SOLICITADO AL PROFESOR b c 2

3 - Preparación de la curva de calibración Se preparan soluciones patrón realizando diluciones seriadas de una solución madre de glucosa de 200 mg/l utilizando tubos de vidrio y preparando un volumen mínimo aproximado de 3 ml de cada una. Las soluciones patrón que se obtendrán tendrán las siguientes concentraciones: mg/l - 75 mg/l EL DISOLVENTE ES AGUA DESIONIZADA (BOTELLA DE VIDRIO) - 50 mg/l Y ES PREFERIBLE NO INTRODUCIR LA PIPETA DIRECTAMENTE - 25 mg/l EN LA BOTELLA Y USAR UN VASO DE PRECIPITADOS - 10 mg/l MEZCLAR BIEN POR AGITACIÓN CADA TUBO ANTES DE USAR IMPORTANTE: LA PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES PATRÓN DEBE REALIZARSE CON MUCHA ATENCIÓN!! - Preparación de la solución problema Se preparan dos diluciones de un volumen mínimo de 5 ml de la solución problema (mosto) en tubo de ensayo usando agua desionizada como disolvente. Las diluciones finales son 1/10000 y 1/20000 y se preparan haciendo diluciones seriadas (1/10 Ł 1/100 Ł 1/1000Ł 1/10000 Ł 1/20000). - Determinación de la concentración de azúcares solubles en mosto de uva 1. Se rotulan (del 1 al 10) los tubos de vidrio que se utilizarán para medir la curva de calibración y la muestra problema. Cada una de las soluciones patrón (incluido el blanco) se hará por uniplicado y las dos muestras problema diluidas se harán por duplicado. Fíjese en la tabla de la página siguiente. 2. Se agrega 1.00 ml de solución patrón al tubo correspondiente, pudiendo emplearse la misma pipeta en cada tubo ml de agua en el caso del blanco. 3. Se agrega 1.00 ml de muestra problema a los tubos correspondientes, pudiendo emplearse la misma pipeta en cada tubo pero no se puede emplear la misma pipeta usada en la solución patrón. A PARTIR DE AHORA ES IMPRESCINDIBLE EL USO DE GUANTES DE LATEX. 4. Se agregan a cada tubo 2.00 ml del reactivo de color (antrona H 2 SO 4 ) situado en una botella de color topacio para preservarlo de la luz. 5. Se agita con el agitador de tubos para homogeneizar el reactivo de color (que es muy viscoso) y la muestra. ATENCIÓN: HAY QUE SUJETAR FIRMEMENTE EL TUBO PARA QUE NO SE SALGA EL LÍQUIDO (RECUERDE CONTIENE ÁCIDO SULFÚRICO) 6. Se deja reposar 2 min en un baño de agua fría. 7. Se incuba a 100 C durante 10 min en un baño termostatizado. 8. Se espera hasta que los tubos alcancen la temperatura ambiente en el baño de agua fría (5 min) y se vierten aproximadamente 2 ml en las cubetas del espectrofotómetro. 9. Se mide la absorbancia a 625 nm (zona visible) en el espectrofotómetro haciendo el cero previamente con el blanco (tubo 10) y anote el resultado. 10. Muestre los valores al profesor y lave todo el material enjuagándolo con agua destilada. 3

4 1 Patrón ml sol. Patrón 100 mg/l 2 ml Antrona H 2 SO 4 2 Patrón ml sol. Patrón 75 mg/l 2 ml Antrona H 2 SO 4 3 Patrón ml sol. Patrón 50 mg/l 2 ml Antrona H 2 SO 4 4 Patrón ml sol. Patrón 25 mg/l 2 ml Antrona H 2 SO 4 5 Patrón ml sol. Patrón 10 mg/l 2 ml Antrona H 2 SO 4 6 y 7 Muestra ml solución Problema diluida (1/10000) 2 ml Antrona H 2 SO 4 8 y 9 Muestra ml solución Problema diluida (1/20000) 2 ml Antrona H 2 SO 4 10 Blanco 1.00 ml Agua 2 ml Antrona H 2 SO 4 - Cálculos 1. Tabule los datos de concentración (mg de carbohidrato/l) vs Absorbancia (A) en la tabla inferior. (Indique siempre las unidades pertinentes). 2. Dibuje la gráfica Absorbancia en función de la Concentración (mg/l) de la solución patrón (colocando la variable independiente en las abscisas y la dependiente en las ordenadas). 3. Ajuste a la mejor recta posible manualmente o mejor por el método de los mínimos cuadrados con calculadora. 4. Interpole la concentración en mg/l de los valores de la Absorbancia de las muestras problema. 5. Multiplique el resultado por el factor de dilución de las muestras problema y haga la media (el factor de dilución es el inverso de la dilución). 6. Complete el recuadro inferior y exponga el resultado en unidades de porcentaje Tubo Solución Concentración Absorbancia Concentración [ ] [ ] x factor de dilución 1 Patrón mg/l Patrón 2 75 mg/l Patrón 3 50 mg/l Patrón 4 25 mg/l Patrón 5 10 mg/l Muestra 1? 7 Muestra 1? 8 Muestra 2? 9 Muestra 2? MEDIA Concentración de carbohidratos totales en el mosto = g/l = % (p/v) Concentración de carbohidratos teórica = % (p/v) 4

5 PRACTICA 2 Determinación de la concentración de proteínas en leche por espectrofotometría mediante el método de Biuret FUNDAMENTO TEÓRICO El objetivo experimental es medir la absorción de luz por muestras problema para determinar la cantidad de proteína contenida en una muestra de leche. Para ello se utilizará un método colorimétrico cuyo fundamento teórico está explicado en la práctica 1. - Proteínas en la leche y reacción de color La Caseína es la principal proteína de la leche y se encuentra dispersa como un gran número de partículas sólidas tan pequeñas que no sedimentan, y permanecen en suspensión. Estas partículas se llaman micelas y la dispersión de las mismas en la leche se llama suspensión coloidal. La reacción de color para medir la concentración de proteínas solubles por espectrofotometría se basa en la formación de complejos entre el ión cúprico y dos cadenas polipeptídicas contiguas que tengan al menos dos enlaces peptídicos sucesivos. El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre(II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (- CO- NH -)que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada biuret, de fórmula: que, en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una coloración violeta característica. PROTOCOLO EXPERIMENTAL AVISO IMPORTANTE: NO SE DEBE PIPETEAR NUNCA CON LA BOCA, SE DEBE USAR SIEMPRE EL PIPETEADOR ADECUADO Y MANTENER LAS PIPETAS LIMPIAS - Preparación de la curva de calibración Se preparan soluciones patrón realizando diluciones seriadas de una solución madre, ya preparada, de la proteína albúmina de suero bovina (BSA) de 10 mg/ml utilizando tubos de vidrio y preparando un volumen mínimo aproximado de 5 ml de cada una. 5

6 Las soluciones patrón que se obtendrán tendrán las siguientes concentraciones: - 5 mg/ml - 3 mg/ml EL DISOLVENTE ES AGUA DESIONIZADA (BOTELLA DE VIDRIO) - 2 mg/ml Y ES PREFERIBLE NO INTRODUCIR LA PIPETA - 1 mg/ml DIRECTAMENTE E N LA BOTELLA mg/ml MEZCLAR BIEN POR AGITACIÓN CADA TUBO ANTES DE USAR IMPORTANTE: LA PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES PATRÓN DEBE REALIZARSE CON MUCHA ATENCIÓN!! - Preparación del reactivo de Biuret Se preparan, en un tubo de plástico de 50 ml con tapón azul, 22 ml del reactivo diluyendo el reactivo de Biuret comercial con NaOH al 10% (p/v) en una relación de volúmenes: 3 de Biuret más 2.5 volúmenes de NaOH. Mezclar bien con agitación. - Preparación de la solución problema Se preparan dos diluciones de aproximadamente 10 ml de la solución problema (leche) en tubo de ensayo usando agua desionizada como disolvente. Las diluciones finales son 1/10 y 1/20 y se preparan haciendo diluciones seriadas. - Determinación de la concentración de proteínas totales en leche 1.- Se rotulan (del 1 al 10) los tubos de vidrio que se utilizarán para medir la curva de calibración y la muestra problema. Cada una de las soluciones patrón (incluido el blanco) se hará por uniplicado mientras que las muestras problema diluidas se harán por duplicado. Fíjese en la tabla de la página siguiente. 2.- Se agregan 2.00 ml de solución patrón al tubo correspondiente, pudiendo emplearse la misma pipeta en cada tubo ml de agua en el caso del blanco. 3.- Se agregan 2.00 ml de muestra problema a los tubos correspondientes, pudiendo emplearse la misma pipeta en cada tubo pero no se puede emplear la misma pipeta usada en la solución patrón. 4.- Se agregan a cada tubo 2 ml del reactivo de Biuret (sulfato de Cobre(II)-NaOH). 5.- Se mezcla con el agitador de tubos para homogeneizar el reactivo de color y la muestra. ATENCIÓN: HAY QUE SUJETAR FIRMEMENTE EL TUBO PARA QUE NO SE SALGA EL LÍQUIDO (RECUERDA CONTIENE HIDRÓXIDO SÓDICO) NO HACE FALTA USAR GUANTES DE LATEX 6.- Se dejan reposar los tubos 20 minutos a temperatura ambiente para desarrollar el color. 7.- Se vierten aproximadamente 2 ml en las cubetas de plástico de espectrofotómetro. 8.- Se mide la absorbancia a 540 nm (zona visible) en el espectrofotómetro haciendo el cero previamente con el blanco (tubo 10) y anotando el resultado. 9.- Muestre los valores al profesor y lave todo el material enjuagándolo con agua destilada. 6

7 1 Patrón ml sol. Patrón 5 mg/ml 2 ml Reactivo de Biuret-NaOH 2 Patrón ml sol. Patrón 3 mg/ml 2 ml Reactivo de Biuret-NaOH 3 Patrón ml sol. Patrón 2 mg/ml 2 ml Reactivo de Biuret-NaOH 4 Patrón ml sol. Patrón 1 mg/ml 2 ml Reactivo de Biuret-NaOH 5 Patrón ml sol. Patrón 0,5 mg/ml 2 ml Reactivo de Biuret-NaOH 6 y 7 Muestra ml solución Problema diluida (1/10) 2 ml Reactivo de Biuret-NaOH 8 y 9 Muestra ml solución Problema diluida (1/20) 2 ml Reactivo de Biuret-NaOH 10 Blanco 2.00 ml Agua 2 ml Reactivo de Biuret-NaOH - Cálculos 1.- Tabule los datos de concentración (mg de proteína/ml) vs Absorbancia (A) en la tabla inferior. (Indique siempre las unidades pertinentes). 2.- Dibuje la gráfica: Absorbancia en función de la Concentración (mg/ml) de la solución patrón (colocando la variable independiente en las abscisas y la dependiente en las ordenadas). 3.- Ajuste a la mejor recta posible manualmente o mejor por el método de los mínimos cuadrados con calculadora. 4.- Interpole la concentración en mg/ml de los valores de la Absorbancia de las muestras problema. 5.- Multiplique el resultado por el factor de dilución de las muestras problema y haga la media (el factor de dilución es el inverso de la dilución). 6.- Complete el recuadro inferior y exponga el resultado en unidades de porcentaje. Tubo Solución Concentración Absorbancia Concentración [ ] [ ] x factor de dilución 1 Patrón 1 5 mg/ml Patrón 2 3 mg/ml Patrón 3 2 mg/ml Patrón 4 1 mg/ml Patrón 5 0,5 mg/ml Muestra 1? 7 Muestra 1? 8 Muestra 2? 9 Muestra 2? MEDIA Concentración de Proteína total en la leche = g/l = % (p/v) Concentración de Proteína indicada 7 en el bote = % (p/v)

8 PRACTICA 3 Determinación de la capacidad amortiguadora de un tampón FUNDAMENTO TEÓRICO Una disolución reguladora, buffer, amortiguadora o tampón, es aquella cuyo ph se mantiene constante, a pesar del agregado de una pequeña cantidad de ácido o base. Tanto para sistemas químicos como biológicos, la regulación del ph es de capital importancia. Por ejemplo, en algunos sistemas químicos, es necesario mantener el ph constante para que una reacción pueda llevarse a cabo. En Electroquímica, los potenciales de electrodo y la presencia de especies oxidadas o reducidas de algunos metales es dependiente del ph y, por ende, se observan cambios de potencial. De esta forma, en algunas ocasiones, para asegurar la presencia de un metal bajo un determinado estado redox o forma química, es necesario mantener el ph dentro de un rango. En los sistemas biológicos es fundamental el mantenimiento del ph dentro de un rango, de ello depende el óptimo funcionamiento de algunas enzimas y el balance de la presión osmótica. - Cómo funciona un sistema tampón? Para comprender la forma en que un sistema tampón es capaz de mantener constante el ph, analizaremos el caso del sistema ácido acético/acetato de sodio. La constante de disociación del ácido acético (K a ) se puede expresar como: K a = _[H + ] [Ac - ]_ (1) [H + ] = K a _[HAc]_ (2) [HAc] [Ac - ] Tomando el logaritmo negativo a ambos lados de la igualdad : -log[h + ] = -logk a + log[ac - ]/[HAc] (3) Que por definición, se puede expresar como : ph = pk a + log [Ac - ]/[HAc] (4) La ecuación (4) se conoce como ECUACIÓN DE HENDERSON-HASSELBACH. De acuerdo con la misma, el ph de una disolución que contenga un ácido y su base conjugada, dependerá del pka del ácido y del cociente de las concentraciones de ambas especies. Si ambas especies se encuentran en la misma concentración, la adición de un ácido o una base producirá poco cambio en el valor del ph. Veamos un ejemplo numérico. Si las concentraciones del ácido y su base son de 1M, el ph de esta disolución, de acuerdo con la ecuación (4) será: ph = pk a =

9 Ahora supongamos que se agregan 0.10 moles de HCl. Los H + del mismo reaccionarán con la base presente de acuerdo con : Ac - + H + fi HAc Observar que se ha despreciado el efecto de la disociación del HAc. De esta manera, las concentraciones para el ácido y su base serán : [HAc] = = 1.1 M [Ac - ] = = 0.9 M Lo que sustituyendo en la ecuación (4), nos da un valor de ph de Es decir, que se produce un cambio de tan sólo 0.10 unidades de ph. Ahora supongamos que son 0.10 moles de NaOH los que se agregan. En este caso, se producirá la neutralización de una cantidad equivalente del ácido, de acuerdo con : HAc + OH - fi Ac - + H 2 O Por tanto, las concentraciones del ácido y su base conjugada serán : [HAc] = = 0.9 M [Ac - ] = = 1.1 M Con lo que en este caso, el ph será de 4.84, es decir, se produce un cambio de menos de 0.1 unidades de ph. Para comprender mejor el efecto de un sistema tampón en la regulación del ph, basta con calcular cuál hubiera sido el ph de la disolución después del agregado de HCl y de NaOH. En estos casos, por tratarse de ácidos y bases fuertes, sus concentraciones serán las que determinen el ph. Por lo tanto, luego del agregado de HCl, el ph hubiera sido: ph = - log 0.1 = 1.0 Y luego del agregado de la sosa : ph = 14 - poh = Comparación de distintos tampones: En el momento de elegir un tampón, debe tenerse en cuenta previamente el valor del ph que se desea mantener. Para ello, existen tablas donde se tienen los distintos tampones y sus respectivos phs. Por ejemplo, en la tabla siguiente se resumen algunos de estos valores, que cumplen un amplio rango de ph. 9

10 Tampón Rango de ph NaAc/HAc Ftalato de Na y K/Biftalato de K H 2 CO 3 /NaHCO Na 2 HPO 4 /KH 2 PO Tris/HCl Borato de Na/Ac. Bórico Na 2 CO 3 /NaHCO Na 3 PO 4 /NaHPO El otro punto que se debe tener en cuenta es su capacidad reguladora. - Capacidad reguladora de un tampón. La capacidad reguladora de un tampón permite conocer la efectividad de su acción amortiguadora, es decir, la capacidad de mantener su ph constante con el agregado de pequeñas cantidades de ácidos y bases. En 1922, se definió la capacidad reguladora de un tampón como la cantidad de ácido o base que debe agregarse al tampón para producir un cambio de una unidad. B = d(b)/dph En las curvas de variación de capacidad reguladora de los tampones se pueden distinguir tres zonas: una primera porción donde la capacidad tamponadora disminuye desde un valor máximo inicial, una segunda zona donde se observa una campana con un máximo definido de la capacidad amortiguadora y una última porción donde la capacidad amortiguadora aumenta nuevamente. La primera y última zona corresponde al ácido solo sin el agregado de la sosa y al ácido neutralizado, es decir, donde predomina la presencia de la base agregada. El hecho de que exista un valor relativamente alto de capacidad reguladora en ambas zonas indica que un ácido y una base son capaces, de por sí, de regular el ph. En ambos casos, cuanto más fuertes sean éstos, mayor será su capacidad reguladora, puesto que el ph quedará determinado por su concentración. La zona intermedia de la curva es la que nos interesa, puesto que corresponde a la presencia en la disolución tanto del ácido como de su base conjugada. En ambos casos, se observa que el máximo de la capacidad reguladora se da en un valor próximo al pk a del ácido Ácido Acético pk a = 4.8 Bicarbonato/Carbonato pk a = 10.3 Carbónico/Bicarbonato pk a = 6.3 Volviendo a la ecuación (4), vemos que el ph se iguala al pk a cuando las concentraciones del ácido y su base conjugada son iguales. En otras palabras, la máxima capacidad reguladora se dará en un sistema tampón compuesto por iguales concentraciones del ácido y su base conjugada. En las gráficas se aprecia también que el rango de ph en el que se produce el máximo está en el entorno de dos unidades. De hecho, el rango útil de una disolución tampón se considera que corresponde a un ph dado por: ph = pk a 1 10

11 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ATENCIÓN CADA BURETA ESTÁ PREPARADA PARA UNA DISOLUCIÓN DIFERENTE LOS ph-metros SOLO DEBEN SER CALIBRADOS UNA VEZ AL DIA Y EN PRESENCIA DEL PROFESOR TAMPON ACETICO-ACETATO - Materiales y equipamiento Datos: -Disolución 0.1M de ácido acético (50mL) a partir del Ac. Acético glacial. -Disolución 0.1N de NaOH (100mL) a partir de la solución valorada 1N. -ph-metro. -Agitador magnético y barrita metálica. -Pipetas y probetas -Bureta de 25mL. -Vaso de precipitados de 50mL. La densidad del Ac. Acético glacial es 1,050 Kg/L Masas molares: Äcido acético: g/mol - Procedimiento 1. Llene la bureta con la solución de NaOH (0.1N) y enrase a 0 ml abriendo la espita. 2. Vierta 20mL de la solución de ácido acético (0.1M) en el vaso de precipitados de 50mL con la barrita metálica. 3. Calibre el ph-metro según las instrucciones y en presencia del profesor. 4. Coloque el vaso sobre el agitador magnético e introduzca el electrodo del ph-metro con cuidado para que, al girar, la barrita no golpee en el electrodo. Encienda el agitador. 5. Anote el ph de la disolución de ácido acético (ml de base = 0). 6. Vierta el NaOH desde la bureta en porciones de 1 ml apuntando el ph en la tabla de la página siguiente (ml Base/pH). El ph debe variar con cada adición aunque sea poco. 7. Termine la valoración cuando el ph llegue a un valor superior a Si es necesario rellene la bureta con más solución de NaOH controlando el volumen añadido. 8. Sin apagar el ph-metro lave el electrodo y coloque su protector. 9. Lave el vaso (atención con la barrita) y pase las soluciones preparadas y bien etiquetadas al otro grupo para que realicen ellos la práctica. Pasen a la práctica de sus compañeros. - Cálculos 1. Llene la tabla de datos de la página siguiente (ml Base/pH). 2. Traze en una gráfica la relación ml de base agregados vs. ph. 3. Señale en la gráfica la zona de amortiguación y el punto de equivalencia. 4. Determine el ph en el que se produce la máxima capacidad amortiguadora. 5. Compare el valor de ph determinado en el punto anterior con el valor de pk a del ácido acético. ph en el que se produce la máxima capacidad amortiguadora = 11 pk a del ácido acético =

12 ml base ph ml base ph TAMPON CARBONATO-BICARBONATO - Materiales y equipamiento -Disolución 0.1M de carbonato de sodio (100mL) a partir del compuesto puro. -Disolución 0.2M de HCl (100mL) preparada a partir de la solución de 1M. -ph-metro. -Agitador magnético y barrita metálica. -Pipetas, probetas y espátula -Bureta de 25mL. -Vaso de precipitados de 50mL. Datos: La Masa molar del carbonato de sodio es: g/mol - Procedimiento 1. Llene la bureta con la solución de HCl (0.2M) y enrase a Vierta 20mL de la solución de carbonato de sodio (0.1M) en el vaso de precipitados de 50mL con la barrita metálica. 3. Calibre el ph-metro según las instrucciones y en presencia del profesor. 4. Coloque el vaso sobre el agitador magnético e introduzca el electrodo del ph-metro con cuidado para que, al girar, la barrita no golpee en el eletrodo. Encienda el agitador. 5. Anote el ph de la disolución de carbonato (ml de ácido = 0). 6. Vierta el HCl desde la bureta en porciones de 0.5 ml apuntando el ph en la tabla de la página siguiente (ml ácido/ph). El ph debe variar con cada adición aunque sea poco. 7. Termine la valoración cuando el ph llegue a un valor inferior a 2.0. Si es necesario rellene la bureta con más solución de HCl controlando el volumen añadido. 8. Sin apagar el ph-metro lave el electrodo y coloque su protector. 9. Lave el vaso (atención con la barrita) y pase las soluciones preparadas y bien etiquetadas al otro grupo para que realicen ellos la práctica. Pasen a la práctica de sus compañeros. 12

13 - Cálculos 1. Llene la tabla de datos adjunta (ml ácido/ph). 2. Traze en una gráfica la relación ml de ácido agregados vs. el ph. 3. Señale en la gráfica las zonas de amortiguación y los puntos de equivalencia. 4. Determine los phs en los que se produce la máxima capacidad amortiguadora. 5. Compare el valor de los phs determinados en el punto anterior con los valores de pk a del ión bicarbonato y del ácido carbónico. 6. Explique las diferencias con la curva de la disolución reguladora de Acético-acetato. ml ácido ph ml ácido ph phs en los que se produce la máxima capacidad amortiguadora = pk a del ión bicarbonato = pk a del ácido carbónico = Describa las principales diferencias experimentales con la curva de la disolución reguladora de Acético-acetato y razones: 13

14 PRACTICA 4 Determinación de la acidez de un vinagre comercial mediante una valoración ácido-base utilizando un indicador coloreado ANÁLISIS VOLUMÉTRICO FUNDAMENTO TEÓRICO En una titulación o valoración volumétrica, el objetivo es determinar la concentración de una sustancia X en solución. Para ello, se debe disponer de una solución de una sustancia Y de concentración exactamente conocida. La reacción entre X (el analito) e Y (el agente valorante) debe reunir determinados requisitos para ser empleada en una titulación: ser completa (es decir que debe tener una constante de equilibrio elevada) ser rápida poseer una estequiometría definida no tener reacciones secundarias que interfieran con el análisis El procedimiento usual de las valoraciones consiste en añadir desde una bureta, pequeños volumenes de agente valorante a un volumen conocido (toma) de la solución de analito. El momento dónde la cantidad de agente valorante se iguala a la cantidad de analito, se denomina punto equivalente de la valoración. Hallarlo es el fin ideal que se persigue en una titulación. Sin embargo, en la realidad, lo que se determina es el punto final, caracterizado por un cambio brusco en alguna propiedad fisicoquímica de la solución. Los más usuales consisten en observar el cambio de color de un indicador, el cambio de Absorbancia con un espectrofotómetro o la diferencia de potencial entre pares de electrodos sumergidos en la solución de analito. La diferencia entre el punto final y el punto equivalente define el inevitable error de titulación. - Indicadores ácido - base Los indicadores ácido - base son en general ácidos o bases débiles, cuyas formas disociada y sin disociar presentan un color diferente. Como se mencionó anteriormente, se utilizan para visualizar el punto final de una valoración de neutralización. Suponga un indicador ácido de fórmula HIn, con el siguiente equilibrio: HIn H + + In - K a = [H + ]. [In - ] [HIn] Dependiendo de cual sea el valor de [H + ], este equilibrio se encontrará desplazado hacia uno u otro lado y por lo tanto predominará la especie HIn o la In -. El color que presente la solución dependerá de cual sea la especie más abundante en la solución. 14

15 Cada indicador tiene un rango de ph en el cual se produce el cambio de color. El mismo depende del valor de K a. Como regla general, se acepta que un color se visualiza cuando la concentración de la especie responsable del mismo es por lo menos 10 veces mayor que la de la otra especie. En base a esto, el rango de ph en el cual puede apreciarse el cambio de color del indicador, se ubica en: rango de ph = pk a 1 Por lo tanto, el ph de un color a otro varía de pk a +1, esto significa un cambio de ph de dos unidades y el rango de transición de casi todos los indicadores es de dos unidades de ph. Si una de las especies es incolora, la percepción del color de la otra especie es mucho más nítida. Habitualmente, el rango de ph en el cual vira el indicador se determina experimentalmente, pero en el caso de que no se conozca, puede calcularse a partir de la ecuación. Elección de un indicador para una volumetría de neutralización El indicador se elige de modo que el ph del punto equivalente esté comprendido dentro del rango de viraje del mismo. Como consecuencia de ello, el viraje del indicador definirá un punto final de la valoración que no necesariamente coincide con el punto equivalente. La siguiente tabla muestra una lista de los indicadores ácido - base más comunes, su concentración y el solvente dónde se preparan sus soluciones, el color de las especies ácida y básica y el rango experimental de ph en el que viran. Indicador solvente pka (H 2 O) 15 Color ácido básico rango ph Timolftaleína EtOH al 90% 9.9 incoloro azul Amarillo de Alizarina amarillo violeta Fenolftaleína EtOH al 60% 9.3 incoloro rojo Rojo Fenol amarillo rojo p-nitrofenol ---» 6.6 incoloro amarillo Verde de BromoCresol EtOH al 20% 4.7 amarillo azul Rojo de Metilo EtOH al 60% 5.0 rojo amarillo Anaranjado de Metilo Agua 3.5 rojo amarillo Amarillo de Metilo rojo amarillo Patrones Primarios La validez de un procedimiento analítico depende del conocimiento de la cantidad de uno de los reactivos empleados. Hasta el momento, se ha supuesto que se conoce con exactitud la concentración del agente valorante Y en la bureta. Se puede conocer dicha concentración con exactitud si se disuelve una cantidad pesada de reactivo puro en un volumen conocido de solución. En este caso, el reactivo puro se denomina estándar primario o patrón primario, puesto que tiene suficiente pureza para pesarse y utilizarse directamente. Los patrones primarios son sustancias que deben reunir determinadas características para ser empleadas como tales, a saber:

16 pureza absoluta (100,00%) o pureza elevada y conocida las impurezas que posea eventualmente deben ser conocidas y ser inertes a la reacción de interés no debe descomponerse en condiciones normales de almacenamiento debe ser estable al secado por calentamiento o vacío debe mantenerse inalterable al aire durante la pesada alto peso equivalente (para disminuir los errores en la pesada) fácil de adquirir y de bajo costo Ejemplos: Para estandarizar soluciones ácidas Na 2 B 4 O 7.10 H 2 O (Bórax) Na 2 CO 3 (Carbonato de Sodio) Para estandarizar soluciones alcalinas H 2 C 2 O 4.2H 2 O (Ácido Oxálico Dihidratado) En la mayoría de los casos no se dispone de un patrón primario como agente valorante. En su lugar, se utiliza una solución de un reactivo (que no constituye patrón primario) de concentración aproximada que se valora frente a una solución de patrón primario. Este procedimiento se denomina estandarización y determina de manera exacta la concentración del agente valorante a utilizarse en el análisis. La solución alcalina más empleada como agente valorante es la de NaOH. El NaOH no constituye un patrón primario debido a que es un sólido higroscópico (absorbe humedad de la atmósfera) y presenta un peso equivalente bajo. A su vez, debe tenerse en cuenta que las soluciones alcalinas tienen la propiedad de disolver más fácilmente el CO 2 atmosférico, generándose las siguientes reacciones: CO 2 (g) fi CO 2 (ac) CO 2 (ac) + H 2 O fi H 2 CO 3 (ac) H 2 CO 3 (ac) HCO 3 - (ac) + H + (ac) HCO 3 - (ac) CO 3 2- (ac) + H + (ac) La absorción de CO 2 modifica la concentración de base fuerte debido a la generación de Hidrogeniones en las dos disociaciones que sufre el Ácido Carbónico. NOTA Las soluciones alcalinas deben almacenarse en recipientes de plástico ya que disuelven lentamente el vidrio. No deben permanecer en las buretas más del tiempo necesario. 16

17 PROTOCOLO EXPERIMENTAL - Materiales y equipamiento - Procedimiento -Dilución 1/10 de vinagre comercial en agua desionizada (50mL) -Disolución 0.1N de NaOH (100mL) preparada a partir de la solución valorada 1N. -Solución Indicadora: Fenolftaleína al 1% (p/v) en etanol (suministrada) -Agitador magnético y barrita metálica. -Pipetas y probetas -Bureta de 25mL. -Vaso de precipitados de 100mL. 1. Llene la bureta con la solución de NaOH y enrase a Vierta 20mL de la dilución de vinagre en el vaso de precipitados con la barrita metálica. 3. Coloque el vaso sobre el agitador magnético y añada 3 o 4 gotas de la solución indicadora. Encienda el agitador. 4. Vierta el NaOH desde la bureta gota a gota pero con fluidez. 5. Cuando se empiece a ver un primer cambio de color en la disolución problema, añada más lentamente la disolución de NaOH. 6. Cierre el paso del NaOH cuando toda la solución haya virado de color de forma permanente y anote el volumen de NaOH utilizado. Si es necesario rellene la bureta con más solución de NaOH controlando el volumen añadido. REPITA TODO EL PROCEDIMIENTO CON OTROS 20 ml DE VINAGRE DILUÍDO, PARA ELLO DEBE LAVAR PREVIAMENTE EL VASO DE PRECIPITADOS CON AGUA DESTILADA Y DESIONIZADA. SI LA DIFERENCIA ENTRE LAS DOS MEDIDAS FUERA SUPERIOR A 1 ML SE DEBERÁ REPETIR LA PRÁCTICA PARA DECIDIR CUAL ES EL VALOR REAL. Volumen de NaOH utilizado = 1 era ml; 2ª ml; (3ª ml)... Muestre los valores al profesor y después lave el material enjuagándolo con agua destilada - Cálculos Las reacciones químicas de neutralización entre un ácido y una base siempre tienen lugar equivalente a equivalente. Por tanto en esta reacción se cumplirá: número de equivalentes-gramo de ácido = número de equivalentes-gramo de base Y como: se tiene: N = nº de eq. de soluto/litro de disolución número de equivalentes-gramo = Normalidad x Volumen de disolución en litros 17

18 Y por tanto, en nuestra reacción se cumplirá: N ácido V ácido = N base V base y si conozco la normalidad y el volumen de base o de ácido necesario para neutralizar un volumen dado de ácido o de base de concentración desconocida, puedo determinar la concentración del ácido o base problema. La acidez total o grado del vinagre se define como la totalidad de los ácidos volátiles y fijos que contiene el vinagre expresada en gramos de acético por 100 ml de vinagre. Datos: La densidad del vinagre comercial es 1008g/L Masas molares: Ácido acético: g/mol; H 2 O: 18 g/mol 1. Haga la media de las dos medidas del volumen de NaOH utilizado en la valoración Volumen de NaOH utilizado (media de los valores obtenidos) = 2. Calcule la Normalidad y la Molaridad del ácido contenido en el vinagre (atención con la dilución). 3. Determine la acidez total del vinagre en porcentaje peso/volumen. 4. Compare el resultado con el valor indicado en la botella. ml Concentración de Acido acético en el vinagre = N = M Acidez total del vinagre = % (p/v) Acidez indicada en la botella = % (p/v) 18

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