Criopreservación. THeI. Diego H. Santamarina

Transcripción

1 Criopreservación THeI. Diego H. Santamarina

2 Definición La criopreservaciónes el proceso por el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 ºC y - 196ºC para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendidapor mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluídas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas.

3 Antecedentes Glicerol como crioprotector. (Polge et al.) Células madre en sangre periférica en ratones (PBSC) (Brecher et al) PBSC en humanos (Freireich et al) Primer PBSCT en perros (Cavins et al) Primer PBSCT y criopreservación en humanos (Kessinger et al) Primer PBSCT humano con selección de células CD34 + (Shpall et al).

4 Daño Deshidratación Mecánica Baja Velocidad Alta Velocidad

5 Medio Isotónico Medio Hipotónico Medio Hipertónico

6 Lesión por congelación. Causas de daño celular por congelación. Daño mecánico por formación de hielo intra-y extracelular. Daño mecánico por expansión térmica. Hiperosmolaridad extracelular y deshidratación. Cambios en el ph. Desnaturalización de proteínas.

7 Formación de cristales de hielo durante la congelación del agua Estos cristales se forman tanto fuera como dentro de la célula y son los cristales intracelulares los que comportándose como cuchillas cortan las estructuras internas de la célula, especialmente las membranas. El hielo es dinámico El hielo no es inerte, entre los 0 y los -30ºel hielo cambia continuamente de conformación lo que provoca que se acentúe el efecto "cuchilla" del mismo. Debido a estos efectos durante la congelación se debe evitar la formación de hielo intracelular.

8 Deshidratar la célula Hay que extraer el agua de la célula y sustituirla por crioprotectores o criopreservantes que mantengan el equilibrio osmótico. Si la célula llega al 30% de deshidratación se alcanza un punto de no retorno, a partir del cual las condiciones biológicas son irrecuperables (Merymann, 1968).

9 Teoría de la congelación Propiedad coligativa de los solutos. Solución eutéctica (con menor punto de congelación). 0ºC 0ºC Solución superenfriada. Centros de nucleación de hielo. 0ºC 0ºC Solución eutéctica con más solutos segregados (aún con menor punto de congelación).

10 Lesión por congelación Daño mecánico Centros de nucleación de hielo intracelulares. Célula sanguínea. Célula sanguínea destruida. Centros de nucleación de hielo.

11 Lesión por congelación. Daño osmótico (deshidratación). Espacio extracelular normosmótico. Salida de agua intracelular. Célula sanguínea normosmolar. Centros de nucleación de hielo. Célula sanguínea deshidratada. Espacio extracelular hiperosmolal.

12 Tipos de crioprotectores -Agentes penetrantes: Crioprotectores con bajo peso molecular, permeables a través de la membrana. Desplazan el agua intracelular evitando la formación de cristales de hielo. -Agentes no penetrantes: Son crioprotectores con un alto peso molecular, y por lo tanto no permeables a través de la membrana. Promueven la rápida deshidratación celular. Un ejemplo de ellos son los azúcares: sacarosa, glucosa, trealosa...

13 Mecanismo coligativo. Crioprotección Espacio extracelular normosmótico. Molécula de DMSO. Célula sanguínea. Célula sanguínea con poco estrés osmótico. Centros de nucleación de hielo. Espacio extracelular ligeramente hiperosmolal.

14 Crioprotección Mecanismo de la envoltura cristalina. Espacio extracelular normosmótico. Molécula de HES. Célula sanguínea. Envoltura cristalina de HES. Célula sanguínea con ligera deshidratación. Centros de nucleación de hielo. Espacio extracelular hiperosmolal.

15 Crioprotectores. No debe ser tóxico para las células a las concentraciones requeridas para la criopreservación. La concentración de los crioprotectores dependeráde la tolerancia de la célula al crioprotector. Debe de ser eliminable antes de la infusión o inocuo para el paciente.