EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS EN CULTIVOS DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS

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1 EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS EN CULTIVOS DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS CARLOS GUILLERMO HERNÁNDEZ PLATA LYDA KARINA PANTOJA AVILA SANDRA CATALINA TURRIAGO MOJICA Proyecto de grado para optar al título de Ingeniero de Producción Agroindustrial Director DRA. BERNADETTE KLOTZ UNIVERSIDAD DE LA SABANA FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. 2002

2 RESUMEN Para caracterizar el crecimiento de cultivos mixtos y puros de bacterias ácido lácticas (BAL) en medio MRS se evaluaron diferentes parámetros cinéticos como: ph, porcentaje de acidez en función de ácido láctico, sólidos solubles totales, contenido de nitrógeno, conteo de bacterias por métodos indirectos (Densidad óptica) y métodos directos (conteo total y Número más Probable). El antagonismo de las BAL tanto del cultivo mixto como de las cepas puras, se llevó a cabo empleando el método de césped utilizando cuatro indicadores Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa ATCC Se descartó la inhibición por producción de ácido, neutralizando el sobrenadante centrifugado. La inhibición por peróxido de hidrógeno se descartó utilizando un medio catalásico. Después de realizar diferentes tratamientos a los sobrenadantes obtenidos de cultivo mixto y puros y de evaluar su actividad antimicrobiana se estableció que el efecto inhibitorio de los sobrenadantes analizados se debe a productos diferentes del ácido láctico y de los peróxidos de hidrógeno. La inhibición observada puede deberse a sustancias inhibitorias similares a las bacteriocinas llamadas BLIS utilizando la sigla en ingles (Llórente 1998).

3 ABSTRACT To characterize the growth of pure and mix acid lactic bacterias (BAL) cultures were evaluated different cinetic parameters such as ph, acidity, total soluble solids, nitrogen content, optical density, viable cell count and direct cell count. Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa ATCC were utilized as indicator bacteria in the agar diffusion method. The antimicrobial activity of the supernatant of mix and pure culture using unmodified supernatant neutralized, concentrated and neutralized-concentrated supernatant was evaluated. The inhibition was produced for different subproducts than lactic acid and hydrogen peroxides. The bactericins could be the inhibition agent.

4 CONTENIDO INTRODUCCIÓN OBJETIVOS 3 CAPÍTULO 1 4 MARCO TEÓRICO 4 1. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS (BAL) CARACTERÍSTICAS GENERALES GÉNERO STREPTOCOCCUS GÉNERO LACTOBACILLUS Lactobacillus acidophillus Lactobacillus delbrueckii GÉNERO BIFIDOBACTERIUM FASES DEL CRECIMIENTO Fase de latencia Fase logarítmica Fase estacionaria Fase de muerte ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS BAL ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Y OTROS METABOLITOS DEL OXÍGENO 3.3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE OTROS COMPUESTOS ORGÁNICOS Dióxido de carbono Diacetilo Acetaldehido ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LAS BACTERIOCINAS 16 Pag i 14

5 Clasificación y estructura de las bacteriocinas Modo de acción de las bacteriocinas Aplicaciones en la industria alimentaria Formas de aplicación de las bacteriocinas en la conservación de alimentos Factores que afectan la eficiencia de las bacteriocinas en los alimentos Tendencias actuales y futuras MICROORGANISMOS INDICADORES Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Escherichia coli Staphylococcus aureus 28 CAPÍTULO 2 29 MATERIALES Y MÉTODOS PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PRUEBAS PRELIMINARES EXPERIMENTACIÓN ACTIVACIÓN DEL CULTIVO MIXTO DE BAL CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS Conteo cámara de Neubauer Número Más Probable Técnicas turbidométricas DETERMINACIÓN DEL PH DETERMINACIÓN DE LOS SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE ACIDEZ DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO TOTAL NITRÓGENO CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL Titulación Destilación y titulación Digestión, destilación y titulación OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DEL PERFIL BIOQUÍMICO DE LAS BAL CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE CULTIVOS PUROS TÉCNICA DE CÉSPED CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS INDICADORES SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS UTILIZADOS 61

6 CAPÍTULO 3 RESULTADOS 1. PRUEBAS PRELIMINARES CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL COMO CULTIVO MIXTO ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DEL CÉSPED CURVAS DE CALIBRACIÓN EN LA DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO TOTAL TITULACIÓN DESTILACIÓN Y TITULACIÓN DIGESTIÓN, DESTILACIÓN Y TITULACIÓN CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL EN CULTIVO MIXTO DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS EN FUNCIÓN DEL TIEMPO 3.2. DETERMINACIÓN DE OTROS PARÁMETROS DE CRECIMIENTO OBTENCIÓN Y DETERMINACIÓN DEL PERFIL BIOQUÍMICO DE CULTIVOS PUROS CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE CULTIVOS PUROS MEDICIÓN DE LA DENSIDAD ÓPTICA A TRAVÉS DEL TIEMPO PARA LOS CULTIVOS PUROS 5.2. MEDICIÓN DE ph y PORCENTAJE DE ACIDEZ EN FUNCIÓN DEL TIEMPO PARA LOS CULTIVOS PUROS 5.3. MEDICIÓN DEL CONTENIDO DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES A TRAVÉS DEL TIEMPO PARA LOS CULTIVOS PUROS 6. EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS SOBRENADANTE OBTENIDO DIRECTAMENTE DE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO 6.2. CONCENTRACIÓN DEL SOBRENADANTE EFECTO INHIBITORIO DE SOLUCIONES DE ÁCIDO LÁCTICO INFLUENCIA DEL ph EN LA ESTABILIDAD DEL EFECTO INHIBITORIO Sobrenadante con ph final de 4.0, 4.5, 5.0 y Sobrenadantes neutralizados obtenidos de fermentaciones con ph controlado Sobrenadantes neutralizados obtenidos de fermentaciones en ausencia de oxígeno Sobrenadante a diferentes tiempos de fermentación INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA ESTABILIDAD DEL EFECTO INHIBITORIO CAPÍTULO 4 ANÁLISIS DE RESULTADOS 1. CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL EN CULTIVO MIXTO

7 1.1. CURVA DECRECIMIENTO DENSIDAD ÓPTICA (ABSORBANCIA) CON LONGITUD DE ONDA DE 600 nm COMPORTAMIENTO DEL ph Y PORCENTAJE DE ACIDEZ PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES CONTENIDO TOTAL DE NITRÓGENO CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS BAL EN CULTIVOS PUROS CURVA DE CRECIMIENTO COMPORTAMIENTO DEL ph Y PORCENTAJE DE ACIDEZ PORCENTAJE DE SÓLIDOS TOTALES EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE BACTERIOCINAS 90 CONCLUSIONES 93 RECOMENDACIONES 95 BIBLIOGRAFÍA 98

8 LISTA DE TABLAS 1. Diferenciación de los principales géneros de bacterias ácido lácticas Resultados de la fermentación del cultivo mixto utilizando diferentes cantidades de inóculo. 3. Resultados preliminares obtenidos durante la fermentación del cultivo mixto de BAL en caldo MRS a 41 C. 4. Concentración de microorganismos indicadores cultivados durante 24 horas en caldo Mueller Hinton a 37 C. 5. Volumen de 10 gotas de ácido clorhídrico N en una bureta de 25 ml Porcentajes de error de exactitud para la curva de calibración de la destilación en el método de Kjeldahl. 7. Porcentajes de error de exactitud para la curva de calibración de la Digestión, Destilación y Titulación en el método Kjeldahl. 8. Conteo de microorganismos cultivo mixto Parámetros de crecimiento del cultivo mixto en función del tiempo Porcentaje de nitrógeno en función del tiempo cultivo mixto Resultados del perfil bioquímico realizado a los aislamientos del cultivo mixto BIOFLORA ABY Densidad óptica de las cepas aisladas ph y porcentaje de acidez para cepas aisladas Halos de inhibición obtenidos con sobrenadante SCm48AScoSc y ph Halos de inhibición obtenidos con sobrenadantes concentrados de los cultivos aislados y mixto. 16. Halos de inhibición obtenidos con soluciones de ácido láctico Halos de inhibición obtenidos con sobrenadante SCm48AScoSc y ph de , 4.50, 5.00 y Resultados con sobrenadantes obtenidos de fermentaciones con ph 80 controlado y sin controlar. 19. Resultados con sobrenadantes obtenidos de la fermentación en ausencia 81 de oxígeno. 20. Resultados con sobrenadantes a diferentes tiempos de fermentación Tabla de análisis de varianza para la densidad óptica de las cepas aisladas. 22. Comparativo en el análisis de varianza para la densidad óptica de las cepas aisladas. 23. Sumatoria de las densidades ópticas de las cepas aisladas necesarias para el análisis de varianza

9 24. Tabla de análisis de varianza para el ph de las cepas aisladas Comparativo en el análisis de varianza para el ph de las cepas aisladas 89

10 LISTA DE FIGURAS 1. Fermentación de la glucosa en bacterias ácido lácticas homofermentativas y heterofermentativas. 2. Micrografía de contraste y electrónica de Streptococcus Micrografía de contraste y electrónica de Lactobacillus acidophillus Micrografía de contraste de fases y electrónica de Lactobacillus delbrueckii Micrografía de contraste de fases y electrónica de Bifidobacterium Curva de crecimiento en un cultivo bacteriano Mecanismo general de acción de las bacteriocinas de las bacterias lácticas en las células Gram-positivas sensibles. 8. Ejemplo de la interacción de bacteriocinas en un sistema de barreras destinado a mejorar la calidad microbiológica de los alimentos. 9. Micrografía de contraste y electrónica de Pseudomonas aeruginosa Micrografía de contraste y electrónica de Bacillus subtilis Micrografía de contraste y electrónica de Escherichia coli Micrografía de contraste y electrónica de Staphylococcus aureus Espectofotómetro Cary 100 Conc. Varian. UV-visible Potenciómetro Metrohm Equipo de digestión de Kjeldahl (Derecha) y Scruber (Izquierda) Equipo de destilación de Kjeldahl Ejemplo de la galería API 50CH Ejemplo de la técnica de difusión en agar (césped) Espectrofotómetro Spectronic 20 D

11 ANEXOS A. FICHA TÉCNICA DEL CULTIVO BIOFLORA ABY B. COMPOSICIÓN CALDO MRS 100 C. COMPOSICIÓN AGAR MRS 101 D. COMPOSICIÓN CALDO MUELLER HINTON 102 E. COMPOSICIÓN AGAR MUELLER HINTON 103 F. COMPOSICIÓN DEL MEDIO CHL 104 G. COMPOSICIÓN DE LA GALERIA API 50 CH 105 H. RESULTADOS OBTENIDOS CON LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE LA DESTILACIÓN I. RESULTADOS OBTENIDOS CON LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE LA DIGESTIÓN DESTILACIÓN TITULACIÓN J. RESULTADOS PERFIL BIOQUÍMICO OBTENIDO CON EL API 108 K. CÓDIGOS EMPLEADOS PARA IDENTIFICAR LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS QUE SE REALIZARON A LOS SOBRENADANTES L. CONTEO DE BACTERIAS CULTIVO MIXTO UTILIZANDO LA TÉCNICA DEL NMP 110 M. CONTEO EN CÁMARA DE NEUBAUER CULTIVO MIXTO 111 N. DENSIDAD ÓPTICA CULTIVO MIXTO λ = 600nm 112 Ñ. ph DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO 113 O. PORCENTAJE DE ACIDEZ DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO 114 P. PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO Q. VARIACIÓN DEL PORCENTAJE DE NITRÓGENO DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO R. PARÁMETROS DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO MIXTO Y VARIACIÓN DEL ph, PORCENTAJE DE ACIDEZ Y PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES DURANTE LA FERMENTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO. S. VARIACIÓN DEL ph PARA LAS CEPAS AISLADAS 118 T. VARIACIÓN DE PORCENTAJES DE ACIDEZ PARA LAS CEPAS AISLADAS 119 U. PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES CEPAS AISLADAS 120 V. CORRECCIÓN PARA LA DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE SACAROSA. 121 W. GRÁFICA DE COMPARACIÓN ENTRE DENSIDAD ÓPTICA Y CURVA DE CRECIMIENTO EN FUNCIÓN DEL TIEMPO X. PORCENTAJE DE ACIDEZ CULTIVO MIXTO PRUEBAS PRELIMINARES 123 Y. ph CULTIVO MIXTO PRUEBAS PRELIMINARES 124 W. PORCENTAJE DE SÓLIDOS SOLUBLES CULTIVO MIXTO PRUEBAS PRELIMINARES

12 INTRODUCCIÓN Las enfermedades gastrointestinales (salmonelosis, tifoidea, cólera, listeriosis, shiguelosis, tuberculosis, yersiniosis, difteria y hepatitis infecciosa) están asociadas al consumo de alimentos contaminados con microorganismos patógenos o sus toxinas, que al ser ingeridos por el ser humano subsisten en el tracto intestinal y pueden iniciar un proceso infeccioso (Doyle 1997). Los microorganismos patógenos más comunes en alimentos son: Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Clostridium sporogenes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Shigella sonnei, Bacillus cereus y Vibrio cholerae (Carminati et al. 1989). Para prevenir el crecimiento de microorganismos patógenos en alimentos se requiere del uso de métodos de conservación tales como: tratamiento térmico, refrigeración, congelación y conservadores químicos. El tratamiento térmico y la congelación alteran las características fisicoquímicas del alimento. La refrigeración por sí sola garantiza una corta vida de anaquel, además que microorganismos como Listeria monocytogenes que son psicrótrofos pueden crecer a temperaturas de refrigeración comercial (4 C). La alternativa ha sido por mucho tiempo el uso de conservadores químicos como: dióxido de sulfuro, sulfitos, parabenos, ácido acético, ácido láctico, ácido propiónico, ácido benzóico, ácido sórbico, nitritos y nitratos (Stiles 1996). En la actualidad el mercado demanda productos libres de conservadores químicos y mínimamente tratados, de manera que no se modifiquen las características fisicoquímicas del alimento. Una alternativa para la solución de este problema es el uso de bacteriocinas (Stiles 1996). Las bacteriocinas son un grupo de sustancias antimicrobianas de origen bacteriano caracterizadas por poseer un componente proteico biológicamente activo y por ejercer una acción bactericida (Tagg et al. 1976). Hasta el momento, la única bacteriocina permitida para uso en más de 45 países es la nisina (Stiles 1996) por lo que la búsqueda de nuevas bacteriocinas ha constituido un campo extenso de investigación en los últimos años. Con este proyecto se pretende evaluar la presencia de bacteriocinas en cultivos puros y mixtos de bacterias ácido lácticas y estandarizar la metodología a emplear en el proyecto macro "Caracterización fisicoquímica y microbiológica del Suero Costeño y evaluación de la presencia de bacteriocinas. El Suero Costeño es un producto lácteo fermentado, elaborado con leche de vaca y obtenido por la separación mecánica del lacto suero. La zona típica de producción está localizada en la región de la costa Atlántica en la mayoría de los municipios de los departamentos del Magdalena, Cesar,

13 evaluación de la presencia de bacteriocinas. Para caracterizar el crecimiento de cultivos mixtos y puros de bacterias ácido lácticas (BAL) en medio MRS se evaluaron diferentes parámetros cinéticos como: ph, % de acidez en función de ácido láctico, sólidos solubles totales, contenido de nitrógeno, conteo de bacterias por métodos indirectos (Densidad óptica) y métodos directos (conteo de totales y Número más Probable). El antagonismo de las BAL tanto del cultivo mixto como de las cepas puras, se llevara a cabo empleando el método de césped utilizando cuatro indicadores Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa ATCC La inhibición por producción de ácido, se evitará neutralizando el sobrenadante centrifugado. La inhibición por peróxido de hidrógeno se descartará utilizando un medio catalásico.

14 OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Evaluar la presencia de bacteriocinas en cultivos puros y mixtos de bacterias ácido lácticas de paquetes comerciales. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Caracterizar el crecimiento de las bacterias ácido lácticas en cultivos mixtos y puros comerciales. Evaluar la presencia de bacteriocinas en el sobrenadante de cultivos mixtos y puros comerciales. Establecer las condiciones de ph y temperatura óptimas de estabilidad de las bacteriocinas.

15 CAPÍTULO 1 MARCO TEÓRICO 1. BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS 1.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES Son un grupo de bacterias Gram-positivas, muy heterogéneo desde un punto de vista filogenético. A los cuatro géneros tradicionales: Streptococcus (actualmente subdividido en Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus y Enterococcus), Lactobacillus, Pediococcus y Leuconostoc, se han añadido otros como Weissella, Oenococcus, Atopobium, Alloicoccus, Aerococcus, Tetragenococcus y Carnobacterium (Schleifer et al., 1995). Estas bacterias no esporuladas, comúnmente no móviles producen ácido láctico como un producto principal o único del metabolismo fermentativo. Los miembros de este grupo carecen de porfirinas y citocromos, no realizan fosforilación por transporte de electrones y de ahí que reciban su energía sólo por fosforilación a nivel sustrato. Todas las bacterias ácido lácticas crecen de manera anaeróbica. Sin embargo, a diferencia de muchos, la mayor parte de ellas no son sensibles a O 2 y pueden crecer en su presencia o ausencia; por tanto, son anaerobios aerotolerantes. Algunas cepas son capaces de tomar O 2 por medio de sistemas de flavoproteína oxidasa, produciendo H 2 O 2 aunque la mayoría de las cepas carecen de catalasa y muchas disponen de H 2 O 2 por medio de enzimas alternativas llamadas peroxidasas. No se forma ATP en la reacción flavoproteínas oxidasa, pero el sistema oxidasa puede emplearse para reoxidación de NADH. La mayor parte de las bacterias ácido lácticas pueden obtener energía solo de la fermentación de los carbohidratos y compuestos relacionados y de ahí que estén restringidos a habitats en que existen azúcares. Por lo general, tienen una capacidad biosintética limitada y sus requerimientos nutricionales complejos incluyen necesidades de aminoácidos, vitaminas, purinas y pirimidinas. Una diferencia importante entre los subgrupos de las bacterias ácido lácticas se basa en la naturaleza de los productos que se forman en la fermentación de los azúcares. Un grupo denominado homofermentativo, produce un único producto de fermentación, el ácido láctico, mientras que el otro grupo denominado heterofermentativo produce otros productos, en

16 particular etanol y CO 2.(Figura 1) Figura 1. Fermentación de la glucosa en bacterias ácido lácticas homofermentativas y heterofermentativas. Fuente: Microbiología de Brock T, Smith D. y Madigan M Las diferencias observadas en los productos de fermentación son determinados por la presencia o ausencia de la enzima aldolasa, una de las enzimas claves en la glucólisis. Los heterofermentadores carentes de aldolasa no pueden descomponer el difosfato hexosa a fosfato triosa. En lugar de ello, oxidan glucosa-6-fosfato a 6-fosfogluconato y entonces descarboxilan esto a pentosa fosfato que se transforma en triosa fosfato y

17 acetilfosfato por medio de la enzima fosfocetolasa. La triosa fosfato se convierte por último en ácido láctico con la producción de 1 mol de ATP, mientras el acetilfostato entonces descarboxilan este a pentosa fosfato que se transforma en triosa fosfato y acetilfosfato por medio de la enzima fosfocetolasa. La triosa fosfato se convierte por último en ácido láctico con la producción de 1 mol de ATP, mientras el acetilfostato acepta electrones a partir de NADH generado durante la producción de pentosa fosfato y así se convierte en etanol sin producción de ATP. Debido a esto, los heterofermentadores producen solo 1 mol de ATP a partir de glucosa en lugar de 2 moles, como los homofermentadores. Esta diferencia en el producto de ATP a partir de glucosa refleja el hecho de que los homofermentadores producen el doble de masa que los heterofermentadores de la misma cantidad de glucosa. Dado que los heterofermentadores descarboxilan 6-fosfogluconato, producen CO 2 como un producto fermentativo, mientras que los homofermentadores producen poco o nada de CO 2 ; por tanto, una forma simple de detectar un heterofermentador es observar la producción de CO 2 en cultivos de laboratorio. A nivel de enzima, los heterofermentadores se caracterizan por la falta de aldolasa y la presencia de fosfocetolasa. Muchas cepas de heterofermentadores pueden utilizar oxígeno como aceptor de electrones con una flavoproteina que sirve como donador de electrones. En esta reacción, la mitad de NADH generada por la oxidación de la glucosa a ribosa es transferida a una flavina y en O 2. El acetil fosfato puede entonces convertirse en acetato en lugar de ser reducido a etanol y se sintetiza un ATP adicional. Los diversos géneros de bacterias ácido lácticas han sido definidos en base a la morfología y al tipo de metabolismo fermentativo como aparece en la siguiente tabla. Tabla 1. Diferenciación de los principales géneros de bacterias ácido lácticas. Género Forma de célula y organización Fermentación DNA (mol % G + C) * Streptococcus Cocos en cadenas Homofermentativa Leuconostoc Cocos en cadenas Heterofermentativa Pediococcus Cocos en tétradas Homofermentativa 38 Lactobacillus 1 Bacilos generalmente en cadena 2. Bacilos generalmente en cadena Homofermentativa Heterofermentativa Fuente: Microbiología de Brock T, Smith D. y Madigan M * (Guanina, Citosina) Los miembros de los géneros Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus tienen composiciones de relación de bases de DNA bastante similares. Además existe una pequeña variación de cepa a cepa. El género Lactobacillus por el contrario, tiene miembros con composiciones de DNA diversas y de aquí que no constituya un grupo homogéneo.

18 Las bacterias ácido lácticas tienen una gran importancia económica ya que las actividades metabólicas que desarrollan en los alimentos y fundamentalmente la producción de ácido láctico con el consiguiente descenso del ph, inducen cambios en la textura, aroma, sabor, color, digestibilidad y palatabilidad de las materias primas, originando unos productos finales con unas características organolépticas diferentes y deseables. (Martinez Mago, Martinez J.M a, Herranz C., Suarez A.M. y Rodriguiez J.M., 2000). Además de su función tecnológica las bacterias lácticas secretan metabolitos que inhiben el crecimiento de microorganismos alterantes y patógenos potencialmente presentes en los alimentos que incluyen entre otros, bacterias de los géneros Pseudomonas, Salmonella, Clostridium, Staphylococcus y Listeria, lo que las convierte en la flora predominante de una gran variedad de productos fermentados, de carnes y pescados conservados en refrigeración, envasados al vacío y en atmósferas modificadas. Por otra parte la seguridad e inocuidad de las bacterias ácido lácticas (BAL) asociadas a los alimentos se ha aceptado durante mucho tiempo y en la actualidad se consideran microorganismos GRAS (Generally Recognized as safe ), lo que sugiere su utilización como agentes antimicrobianos (bioconservantes) para incrementar la calidad higiénica y extender la vida útil de los alimentos. Los principales mecanismos de antagonismo microbiano de las BAL son la competencia por los nutrientes del sustrato y la formación de ácidos orgánicos (ácido láctico y ácido acético), principalmente con el consiguiente descenso del ph. No obstante las bacterias ácido lácticas también producen otras sustancias antimicrobianas como: diacetilo, acetaldehído, peróxido de hidrógeno y otros metabolitos del oxígeno y otros compuestos no proteicos de pequeño tamaño molecular. Por último las BAL también producen sustancias antimicrobianas proteicas de síntesis ribosomal denominadas bacteriocinas. 1.2 GÉNERO STREPTOCOCCUS Los cocos de éste género, perteneciente a las BAL, se disponen característicamente en pares o cadenas largas o cortas, dependiendo de las especies y condiciones de crecimiento, pero nunca en paquetes o en masas. Todos son homofermentativos. Los estreptococos se pueden clasificar serológicamente mediante una reacción de precipitinas en grupos llamados de Lancefield, que se designan con letras mayúsculas (A,B,C,D, etc.), pero generalmente los que son importantes en los alimentos se dividen en cuatro grupos: piógenos, viridans, lácticos y enterococos. Los del grupo viridans incluyen el Streptococcus. Thermophilus (Figura 2), importante en los quesos y leches fermentadas como el yogur. Estas especies crecen a 45 C pero no a 10 C. El grupo láctico comprende las bacterias de la leche Streptococcus lactis y Streptococcus cremoris, que crecen a 10 C pero no a 45 C. El género Streptococcus contiene una alta variedad de especies con habitats muy diferentes cuyas actividades son de importancia práctica para el hombre. Algunos miembros son patógenos para las personas y los animales. Como productores de ácido

19 láctico, ciertos Streptococcus, desempeñan papeles importantes en la producción de leche agria, de ensilados y otros productos fermentados. Para distinguir los Streptococcus generalmente no patógenos de las especies patógenas para el hombre, se realizó una reclasificación. El género Lactococcus contiene Streptococcus significativos en la industria de lácteos, mientras que el género Enterococcus se ha creado para agrupar los estreptococos, en primer lugar de origen fecal. Algunas cepas de Streptococcus, producen un color rojizo al crecer en agar o forman un pigmento amarillo o naranja al crecer en caldo que contenga almidón. El crecimiento en medios artificiales es escaso. Las colonias crecidas en agar son pequeñas. La superficie de las colonias es traslúcida. La mayoría de las especies son aerotolerantes y unas pocas cepas son anaerobias estrictas. Otras cepas atacan las proteínas con la producción de gas y olor fétido. Algunas cepas son homofermentativas y en su fermentación producen principalmente ácido láctico. No transforman el nitrato en nitrito. No son solubles en bilis. Se encuentran principalmente en la boca y el intestino del hombre y otros animales, en productos lácteos, y en fermentos. Figura 2. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Streptococcus Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods. C. (Mayo de 2002) Streptococcus salivarius Son células Gram-positivas, esféricas o elipsoidales de 0.6 a 0.8 micrones de diámetro y usualmente forman pequeñas cadenas. Las células son relativamente largas en medio líquido, especialmente en leche. En un medio sólido común las colonias son blancas, pequeñas y no crecen más de 0.5 mm de diámetro. En un medio sólido que contenga 5% de sucrosa o rafinosa, las colonias son largas, suaves, mucosas y el diámetro de la colonia es como el producido por las bacterias coliformes y las levaduras. Esto es distintivo de esta especie, ya que ningún otro Streptococcus produce colonias de este tipo en agar que contenga sucrosa o rafinosa. En agar sangre no se ha demostrado la producción de toxinas solubles ni la hemólisis en este medio. En caldo el crecimiento es variable, en algunas ocasiones los microorganismos floculan y el sobrenadante es fluido y se forman cadenas largas, o hay turbidez uniforme o granular en el sobrenadante con poca decantación del flóculo y pequeñas cadenas.

20 Tolerancia química: Toleran un 2% de sal, pero no alcanzan a tolerar 4 %. El ph final en caldo glucosado se encuentra entre 4.4 y 4.0. No crecen a un ph de 9.6. Toleran el azul de metileno en 0.01% pero no lo hacen en 0.1 %. Son inhibidos en agar sangre que contenga un 30% de bilis. No producen catalasa. Relaciones de temperatura: El crecimiento óptimo se encuentra entre 37 C y 43 C. La máxima temperatura de crecimiento es 45 C, pero a 47 C y a 10 C no hay crecimiento. No sobreviven 30 minutos a 60 C. Son anaerobias facultativas. Se pueden encontrar en la saliva y esputo, en varias infecciones pulmonares, abscesos dentales, en caries de los dientes y en el tracto intestinal. Su hábitat se encuentra en la boca humana, garganta y nasofaringe. 1.3 GÉNERO LACTOBACILLUS Son bacilos, generalmente largos y delgados, que en la mayoría de las especies forman cadena. Son aerotolerantes, aunque existen algunos anaerobios estrictos; catalasanegativos y Gram-positivos. Los lactobacilos homofermentativos presentan temperaturas óptimas de 37 C o incluso superiores y comprenden especies como L. bulgaricus, L. helveticus, L. lactis, L. acidophillus, L. thermofilus y L. delbrueckii. Todas las especies citadas, excepto L. delbrueckii son fermentadoras de la lactosa con producción de ácido láctico y, en consecuencia, de interés en la industria láctea. En los lactobacillos es característica la forma de bastoncillo que varía de largos y delgados a Lactobacillus acidophillus curvos. La mayor parte de las especies son homofermentativos, pero algunos son heterofermentativos. La formación de pigmentos es escasa, pero cuando se presenta es de color amarillo, naranja o color ladrillo. El crecimiento en superficie es pobre (excepto el género Microbacterium), porque esta bacteria es generalmente anaeróbica. Los carbohidratos y polisacáridos son transformados por la homofermentación en ácido láctico o por heterofermentación en ácido láctico, propiónico o butírico, en alcohol y dióxido de carbono. El crecimiento en papa es pobre. No licua la gelatina, los nitratos no los reduce a nitritos (excepto el género Microbacterium). Varias especies crecen a temperaturas relativamente altas. Pueden producir o no, catalasa. El género se ha dividido en dos subgrupos principales: o Homofermentativos: su producto principal es el ácido láctico, no forma gas a partir de glucosa. Existen dos sub-grupos: 1. Crecen a 45 C pero no a 15 C y son Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus Lactis. 2. Crecen a 15 C, desarrollo variable a 45 C y son Lactobacillus acidophillus y corineformes, ácidos teitóicos del glicerol y del ribitol (Lactobacillus caseii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus). o Heterofermentativos: produce alrededor de 50% de ácido láctico a partir de glucosa; produce CO 2 y etanol; fosfocetolasa presente; Lactobacillus acidophillus, ácido teicoico del glicerol y son Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri y Lactobacillus kefir.

21 1.3.1 Lactobacillus acidophillus Tienen un tamaño de 0.6 a 0.9 por 1.5 a 6.0 micrones. Se encuentran solos, en parejas y en cadenas pequeñas que se redondean al final (Figura 3). No tienen movimiento, sus dimensiones son variables y son Gram-positivas. En agar Wort o agar de tomate se forman vellosidades delicadas y torcidas en la superficie y la periferia de las colonias. En el centro se forma una masa que parece filtro la cual es gruesa y oscura. Las colonias son gruesas y de forma irregular. En leche el crecimiento es lento con poco inóculo y coagula del fondo a la superficie. Forma ácido o gas de la glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, galactosa, manosa, maltosa. Algunas cepas fermentan la rafinosa y la trealosa y actúan levemente sobre la dextrina. Temperatura óptima de crecimiento: 37 C. No crecen entre 20 a 22 C. La temperatura máxima de crecimiento 43 C a 48 C. Son microaerófilos. Figura 3. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Lactobacillus acidophillus. Fuente: Microbiología de Brock T, Smith D. y Madigan M Lactobacillus delbrueckii Tienen un tamaño de 0.5 a 0.8 por 2.0 a 9.0 micrones (Figura 4). Figura 4. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Lactobacillus delbrueckii. Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods.C. (Mayo de 2002) Pueden encontrarse solos y en pequeñas cadenas, no son móviles y Gram-positivos. Las colonias sembradas en gelatina son pequeñas, grises, y circulares no licuadas. Colonias sembradas en agar: Pequeñas y planas.

22 Las colonias sembradas en eslant: son angostas, traslúcidas y con líneas grisáceas. No trasforman los nitratos en nitritos, el ácido lo obtienen de la fermentación de la maltosa, sucrosa, glucosa, fructosa galactosa y dextrina. Es el organismo que tolera la más alta temperatura durante la fermentación. La temperatura óptima de crecimiento es de 45 C y son microaerófilos. 1.4 GÉNERO BIFIDOBACTERIUM Son células Gram-positivas, no móviles, catalasa negativos presentes generalmente en microcolonias lisas y no poseen filamentos al final de la célula, presentan bifurcación (sencilla o doble) y son anaeróbicos. Este género es uno de los cuatro géneros de las bacterias ácido lácticas con forma de bastón (Figura 5) y producen ácido láctico dextrorrotatorio. Figura 5. Micrografía de contraste de fases y electrónica de Bifidobacterium Fuente: Meehan.M, Lynagh. Y, Woods.C. (Mayo de 2002)

23 2. FASES DE CRECIMIENTO Después de la inoculación de una solución nutritiva estéril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiológicas se observan cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte (Figura 6). 2.1 FASE DE LATENCIA Cuando las células se transfieren de un medio a otro no existe inicialmente aumento en el número de células, aunque la masa celular puede cambiar. Durante la fase de latencia, los microorganismos se adaptan a su nuevo ambiente. Debido a este cambio de ambiente, es probable que las células inoculadas produzcan cambios en varios parámetros: cambios en el valor de ph, aumento en el suministro de nutrientes, descenso en los inhibidores del crecimiento. En las células deben ser inducidos nuevos sistemas de transporte. Fuera de la célula pueden difundir cofactores esenciales y las enzimas del metabolismo primario deben ajustarse a las nuevas condiciones. Además, sistemas de transporte. Fuera de la célula pueden difundir cofactores esenciales y las enzimas del metabolismo primario deben ajustarse a las nuevas condiciones. Además, la condición fisiológica del inóculo es crucial respecto de la longitud de la fase de latencia. Si el cultivo que se va utilizar como inóculo se encuentra todavía en la fase logarítmica, puede no existir periodo de latencia y el crecimiento puede comenzar inmediatamente. Sin embargo, el inóculo que se toma de un cultivo en el que se ha detenido el crecimiento debido a una limitación de un substrato necesita más tiempo para adaptarse a la nueva solución de nutrientes. La concentración del inóculo tiene también influencia en la fase de latencia.

24 Figura 6. Curva de crecimiento de un cultivo bacteriano. Fuente: Manual de Microbiología Industrial FASE LOGARÍTMICA Al final de la fase de latencia las células se han adaptado a las nuevas condiciones de crecimiento. El crecimiento de la masa celular puede ahora ser descrito cuantitativamente en función de la duplicación del número de células por unidad de tiempo (levaduras y bacterias) o por la duplicación de la biomasa por unidad de tiempo (organismos filamentosos como estreptomicetos y hongos). Representando el número de células o la biomasa frente al tiempo en una relación lineal. Aunque las células alteran el medio debido a la toma de substratos y la secreción de productos metabólicos, la velocidad de crecimiento permanece constante durante la fase logarítmica. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentración de substrato en tanto que exista exceso de substrato.

25 2.3 FASE ESTACIONARIA Tan pronto como el substrato es metabolizado o se han formado sustancias tóxicas, el crecimiento desciende o se detiene completamente. La biomasa aumenta solo gradualmente o permanece constante durante esta fase, aunque la composición de la células puede cambiar. Debido a la lisis se liberan nuevos substratos (carbohidratos, proteínas) que pueden servir como fuente de energía para el crecimiento de los supervivientes. Los distintos metabolitos formados en la fase estacionaria son frecuentemente de gran interés biotecnológico. 2.4 FASE DE MUERTE En esta fase la reservas de energía de las células se agotan. Cuando se representan en forma semilogarítmica los supervivientes en función del tiempo, puede ser obtenida una línea recta, lo que indica que las células mueren a una velocidad exponencial. La longitud de tiempo entre la fase estacionaria y la de muerte dependen del organismo y del proceso utilizado. En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica o antes de que comience la fase de muerte. Estas fermentaciones discontinuas (en batch ) pueden ser consideradas como sistemas cerrados. A tiempo cero T = 0, la solución esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el ph. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de las células.

26 3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS BAL Las BAL además de su función tecnológica, contribuyen a la conservación de los alimentos fermentados debido a su capacidad de inhibir el desarrollo de microorganismos alterantes y patógenos, que incluyen, entre otros, bacterias de los géneros Pseudomonas, Salmonella, Clostridium, Staphylococcus y Listeria. El efecto antimicrobiano primario de las BAL se debe a la competencia por los nutrientes y a la producción de ácidos orgánicos, con el consiguiente descenso del ph. No obstante, también producen otras sustancias antimicrobianas como el etanol, el dióxido de carbono, el diacetilo, acetaldehído, el peróxido de hidrógeno y las bacteriocinas. A continuación se describen las principales características bioquímicas, modo de acción y espectro antimicrobiano de los ácidos orgánicos, metabolitos del oxígeno y productos finales del catabolismo. 3.1 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS Las BAL producen ácido láctico por la fermentación de la glucosa y otras hexosas, así como también pueden producir ácido fórmico, ácido acético y etanol por la fermentación de otros sustratos. Estos ácidos una vez sintetizados se liberan al medio extracelular, donde además de contribuir a las características organolépticas, inhiben o retardan el desarrollo de un gran número de microorganismos alterantes y patógenos, entre los que se encuentran Escherichia coli, Pseudomonas spp, Salmonella spp. y Clostridium spp. También se ha determinado que los ácidos orgánicos inhiben la germinación de las esporas de Bacillus cereus, de Clostridium tyrobutyricum, así como el desarrollo de algunos hongos y levaduras. La eficacia antimicrobiana de los ácidos orgánicos débiles esta relacionada principalmente con la concentración de las formas moleculares (fracción no disociada), por lo tanto a valores bajos de ph aumenta la eficacia antimicrobiana de estas sustancias. 3.2 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO Y OTROS METABOLITOS DEL OXÍGENO Los metabolitos producidos en el desarrollo en aerobiosis de la mayoría de las BAL conlleva la formación de metabolitos del oxígeno, principalmente peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), aniones superóxido (O 2 - ) y radicales hidroxilo (-OH), los cuales poseen una gran toxicidad debido a su elevado poder oxidante. Estos metabolitos poseen un efecto bacteriostático o bactericida sobre un gran número de microorganismos debido principalmente a la inactivación de enzimas, como gliceraldehido- 3P -deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa o determinadas coenzimas como la

27 coenzima A, por la oxidación de sus grupos sulfidrilo. No obstante, esta actividad antimicrobiana también puede deberse al aumento de la permeabilidad de las membranas debido a la peroxidación de los lípidos y a los daños del material genético, como la rotura de enlaces inter e intra catenarios del ADN, la alteración de bases nitrogenadas, la liberación de nucleótidos y la inhibición de la replicación cromosómica. 3.3 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE OTROS COMPUESTOS ORGÁNICOS Además de los ácidos orgánicos y de los metabolitos del oxígeno existen diferentes compuestos que se presentan en menor proporción Dióxido de carbono Las BAL producen CO 2 como consecuencia de un metabolismo heterofermentativo de los hidratos de carbono. El efecto antimicrobiano del CO 2 se conoce desde hace tiempo y parece deberse a: 1. La creación de condiciones anaeróbicas que inhiben el crecimiento de microorganismo aerobios obligados; 2. Un descenso del ph por la formación de ácido carbónico; 3. Una acción antimicrobiana específica de la propia molécula Diacetilo Es un compuesto volátil producido en la vía de degradación del piruvato, por algunas especies y cepas de los géneros Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus y Lactobacillus. En la mayoría de los casos debido al efecto represor del metabolismo fermentativo de las hexosas la producción de diacetilo se limita a la fase estacionaria, ya que durante esta disminuyen los requerimientos en ATP por lo que el piruvato que comienza a acumularse se transforma en diacetilo. Una vez sintetizado, se libera al medio extracelular donde además de contribuir al desarrollo de la aroma de productos fermentados como la mantequilla y algunos tipos de quesos, ejerce una fuerte acción antimicrobiana frente a un gran número de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, hongos y levaduras. Aunque aun no se conocen con exactitud los mecanismos por los que el diacetilo ejerce esa actividad antimicrobiana parece ser que en los microorganismos sensibles inactiva enzimas, como la alcohol deshidrogenasa, la adenilato ciclasa y la glutamato deshidrogenasa. La concentración de diacetilo en los alimentos es tan pequeña que no es suficiente por si sola para ejercer una acción antimicrobiana, aunque su actividad se incrementa a valores bajos de ph, generalmente inferiores a 5.

28 3.3.3 Acetaldehído Es el principal componente aromático de algunos productos lácteos fermentados, como el yogur, contiene una aldolasa que metaboliza la treonina en acetaldehído y glicina. Estos microorganismos no degradan el acetaldehído, por lo que éste se acumula en el medio a una concentración aproximada de 25 ppm. Se ha demostrado que concentraciones de acetaldehído entre ppm inhiben el crecimiento de microorganismos alterantes y patógenos de la leche, como St. aureus, S. typhimurium y E. coli. 3.4 ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LAS BACTERIOCINAS Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos que se sintetizan a nivel ribosómico y que, posteriormente, pueden sufrir modificaciones postraduccionales. Anteriormente se pensaba que sólo eran activas frente a bacterias que guardaban una estrecha relación taxonómica con la especie productora, hoy en día se sabe que existen algunas bacteriocinas que son activas frente a microorganismos taxonómicamente distantes de la especie bacteriocinogénica. Por esta razón Koninsky realizó una definición más general sobre las bacteriocinas: son agentes antimicrobianos de naturaleza peptídica cuya síntesis no es letal para la célula productora. Klaenhammer las definió como un grupo heterogéneo de compuestos antibacterianos de naturaleza peptídica que varían en su espectro de actividad, modo de acción, peso molecular, determinantes genéticos y características bioquímicas. Las bacteriocinas poseen una parte proteica necesaria para su actividad, son bactericidas, para actuar, la bacteriocina se fija sobre un receptor específico localizado sobre la célula diana; la célula productora de bacteriocina sintetiza igualmente una molécula que la inmuniza contra su propia bacteriocina; el soporte genético de las dos moléculas bacteriocinas y moléculas de inmunidad es un plásmido. Para poner en evidencia el efecto inhibidor de las bacterias lácticas por la acción de una bacteriocina es preciso trabajar en condiciones experimentales eliminando la influencia del ácido láctico, o del peróxido de hidrógeno. La capacidad bacteriocinogénica de las bacterias lácticas se suele evaluar mediante pruebas de difusión en agar, utilizando la técnica de Césped en placas réplicas y empleando diversos microorganismos indicadores. En este sentido, la acción de los ácidos orgánicos se puede evitar neutralizando el ph de los cultivos o sobrenadantes evaluados y la del peróxido de hidrógeno añadiendo catalasa al medio o empleando medios de cultivo que posean una marcada actividad catalásica como el MRS. Los sobrenadantes de los cultivos de las cepas presuntamente bacteriocinogénicas se suelen someter a diversos tratamientos enzimáticos y térmicos con el fin de determinar su naturaleza química y su termoresistencia. A continuación se suele proceder a la purificación de la(s) bacteriocina(s) producidas. Tras la purificación a homogeneidad de una bacteriocina, se suele proceder a la determinación de su peso molecular por espectrometría de masas y de su composición y secuencia aminoacídica Clasificación y estructura de las bacteriocinas Clase I (lantibióticos): péptidos pequeños (<5 kda), termoestables y con aminoácidos modificados de los que los más comunes son la deshiroalanina (DHA) y la deshidrobutirina (DHB), originados por deshidratación postraduccional de la serina y la treonina, respectivamente.

29 Se divide en: Lantibióticos Tipo A: Son péptidos formadores de poros, catiónicos y elongados que en algunos casos, como el de la lacticina 3147, constan de dos componentes. La nisina, es la bacteriocina perteneciente a este tipo y ha sido la más estudiada hasta el momento. Lantibióticos Tipo B: son péptidos globulares inmunológicamente activos que actúan como inhibidores enzimáticos. Clase II: son péptidos pequeños (<10 kda), termoestables y sin aminoácidos modificados en su estructura primaria. A su vez, se pueden clasificar en cuatro subclases: Subclase IIa: Se caracterizan por ser particularmente activas frente a los microorganismos del género Listeria. Esta subclase también se conoce como "familia Pediocina", en alusión a la bacteriocina más estudiada de este grupo, la pediocina PA-1. Subclase IIb: Contiene bacteriocinas cuya actividad depende de la acción complementaria de dos péptidos, como la lactococina G. Subclase IIc: Incluye a las bacteriocinas de la clase II que se transportan utilizando un sistema sec-dependiente, a pesar de que algunas, como la enterocina P, muestran ciertas características propias de las bacteriocinas de la subclase IIa. Subclase IId: Engloba a las bacteriocinas de la clase II que, como sucede con la alctococina A, no se pueden clasificar en ninguno de los subgrupos anteriores. Clase III: Proteínas de más de 30 kda, termolábiles y sin aminoácidos modificados en su estructura primaria. Estas bacteriocinas son las que poseen un menor interés industrial en la actualidad Modo de acción de las bacteriocinas Las bacteriocinas actúan sobre la membrana celular de las células sensibles a través de un proceso que consta de tres etapas básicas: 1. Unión a la membrana. 2. Inserción en la misma. 3. Formación de poros. La unión inicial de las bacteriocinas a las membranas esta gobernada por interacciones electrostáticas entre los residuos cargados positivamente de los péptidos y los grupos negativos de los fosfolípidos de las membranas. Las regiones de las bacteriocinas que determinan la especificidad deben reconocer e interaccionar de una forma específica con entidades localizadas en las membranas de las células diana. No obstante, en el caso de las bacteriocinas de amplio espectro, parece más probable que sea un componente determinado de la membrana y no un receptor como tal el que reaccione con la región de la bacteriocina que determina la especificidad. La interacción no sería quiral ya que la especificidad de cepa que muestran las bacteriocinas no depende de interacciones estereoespecíficas. Actualmente existen dos grandes modelos que explican el mecanismo por el que la bacteriocinas generan poros en las membranas plasmáticas: el modelo de cuña, aplicable a la nisina y otros lantibióticos y el modelo de duela de barril, aplicable a diversas bacteriocinas de la Clase II (Moll et al,1999). En cualquier caso, la formación del complejo de poración de las membranas provoca la disipación de la fuerza protón motriz (PMF) y en última instancia la muerte celular (Jack et al, 1995). La PMF es un gradiente electroquímico necesario para que se efectúen gran parte de los procesos metabólicos dependientes de energía que tienen lugar en

30 las células; consta de dos componentes: un potencial de membrana y un gradiente de ph. En los últimos años, el desarrollo de técnicas para estudiar por separado ambos componentes y de sistemas de membranas artificiales a permitido evaluar el efecto de diversas bacteriocinas sobre la PMF, un parámetro clave para comprender su mecanismo de acción. En general, el colapso de la PMF conduce a una reducción significativa del contenido de ATP intracelular, inhabilita el transporte activo de nutrientes e impide el mantenimiento de concentraciones adecuadas de ciertos iones como los K + y Mg ++. En este sentido, los resultados obtenidos con diversas bacteriocinas, como la nisina (Bruno et al., 1992., Gao et al., 1991., Kordel et al., 1989., Okerere y Montville, 1992., Ruh y Sahl, 1985) la pediocina PA1, la Lactococina A y Lactococina B, condujeron a la conclusión de que las bacteriocinas de las BAL compartían un mecanismo de acción común: La disipación de la PMF en las células sensibles. ( Figura 7). Figura 7. Mecanismo general de acción de las bacteriocinas de las bacterias lácticas en las células Gram-positivas sensibles. Fuente: Revista Alimentaria Julio-Agosto 2000 Recientemente, se ha sugerido que la constitución global de las membranas, y no solo su composición lipídica podría ejercer una marcada influencia en la actividad formadora de poros de una bacteriocina ya que las proteínas de membrana podrían intervenir decisivamente en el ordenamiento lipídico de esta estructura. En este sentido aunque las bacterias naturalmente resistentes a una bacteriocina no puedan evitar la inserción de monómeros de una bacteriocina la composición global de sus membranas impediría que se formaran poros de suficiente duración y diámetro como para causar la muerte celular. Una vez que las moléculas de bacteriocina han formado un complejo de poración la muerte de las células sensibles puede ir acompañada o no de un proceso de lisis celular. La muerte celular puede activar sistemas autolíticos que ha su vez serían responsables de la lisis en algunas cepas. Se ha observado