El riñón es un órgano muy vascularizado que ejerce funciones de síntesis, metabólicas y de excreción.

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1 Tema 9: Estudio de la función renal 9.1. Objetivos Conocer la forma de recogida, conservación y transporte de una muestra de orina problema. Conocer en que consiste un análisis de anormales y sedimento urinario. Conocer las pruebas más utilizadas para valorar la función renal. Comprender el fundamento de las determinaciones llevadas a cabo en el laboratorio clínico Introducción El riñón es un órgano muy vascularizado que ejerce funciones de síntesis, metabólicas y de excreción. Durante muchos años, la orina ha sido el fluido corporal más utilizado para la detección y diagnóstico de las enfermedades. Así, los cambios en la composición de la orina son en ocasiones la primera y/o única indicación de un trastorno renal. Los objetivos fundamentales de cualquier análisis de orina son: 1. Obtener información sobre el estado general del riñón 2. Detectar la existencia de una alteración en vías urinarias 3. Detectar alteraciones funcionales de otros órganos 4. Poner de manifiesto la existencia de alteraciones metabólicas. Al igual que en toda determinación, para que los resultados obtenidos sean fiables es primordial una toma de muestras adecuada, por tanto comenzaremos el tema analizando la recogida de orina y lo completaremos estudiando: el análisis de anormales y sedimento urinario valoración de la función glomerular valoración de la función tubular 9.3. Recogida de orina La muestras de orina deben recogerse en recipientes perfectamente limpios y secos. Existen recipientes desechables de plástico de diversos tamaños provistos de tapaderas herméticas que evitan la contaminación. Cuando los pacientes son niños se suelen utilizar bolsas plegables de polietilen. Los recipientes deben rotularse con el nombre del paciente, la fecha y hora de recogida. Para análisis de rutina se recogerá orina de una sola micción, preferiblemente la porción intermedia de la primera micción. Para análisis cuantitativos se recogerá la orina de 24 horas. En general las muestras se deben analizar antes de 3-4 horas. La demora provoca lisis de glóbulos rojos, degeneración de cilindros y leucocitos, aumento de ph, crecimiento bacteriano y metabolización de glucosa. En ocasiones se adicionan conservantes (ej. fluoruro sódico para consevar la glucosa en orinas de 24 horas, formaldehído que retrasa la destrucción de cilindros y elementos formes...). 1

2 9.4. Análisis de anormales Un análisis de orina se define como aquel procedimiento técnico encaminado a examinar los componentes que integran la orina, su cantidad y la proporción en que se encuentran. Se intenta encontrar: -Sustancias o componentes que normalmente no están en la orina -Alguna alteración en la concentración (por exceso o por defecto) de componentes que habitualmente están en ella. En la siguiente figura se observa el lugar de los exámenes bioquímicos en el examen general de la orina. El análisis rutinario de orina consiste en un análisis de anormales y sedimento urinario Concepto Un análisis de anormales es una investigación química básica de orina llevada a cabo mediante tiras reactivas. La tira reactiva diagnóstica de inmersión es una tira de plástico a la que se fija una o más almohadillas de celulosa, que están químicamente impregnada de tampón y varios indicadores químicos. Cuando se humedece en orina, cada almohadilla se convierte en un medio químico en miniatura que responde a la presencia de compuestos químicos específicos presentes en la muestra. Para obtener resultados semicuantitativos, es importante observar los tiempos que se especifican para la realización de cada lectura. Las zonas reactivas, una vez impregnadas de orina se comparan con las escalas colorimétricas del envase. 2

3 Se debe considerar la tira reactiva como un dispositivo de selección primaria que junto con el examen visual, permite separar las muestras anormales de las normales. Las anomalías deben dilucidarse usando pruebas de seguimiento y confirmación. Las tiras reactivas disponibles en el mercado tienen tests para: glucosa, bilirrubina, cuerpos cetónicos, densidad, sangre, ph, proteínas, urobilinógeno, nitritos y leucocitos Técnica Las instrucciones deben ser seguidas cuidadosamente para obtener resultados fiables. 1. Utilizar orina fresca recogida en un recipiente limpio y seco 2. Sacar una sola tira del frasco y utilizarla inmediatamente. Sumergir brevemente la tira en la muestra y sacarla con rapidez 3. Escurrir el exceso de orina con el borde del frasco. Mantenerla en posición horizontal 4. Si estamos leyendo visualmente comparar los colores con la carta de colores del frasco mantener la tira cerca de la tabla de colores y escoger cuidadosamente-. La mayor precisión se obtendrá ajustándola a los tiempos de lectura correctos. Algunos colores toman mayor intensidad con el tiempo y después decrecen, por lo cual colores que aparezcan transcurridos 2 minutos carecen de significado. Si el color de una zona reactiva no es uniforme debemos fijarnos en la zona más oscura. Todas las zonas, excepto los leucocitos, se pueden leer entre 1 y 2 minutos como screening de positivo o negativo. Leer los test de leucocitos a los 2 minutos. 5. Si se lee instrumentalmente, seguir las instrucciones de manejo del aparato. 6. Como todos los tests de laboratorio, el diagnóstico definitivo o la decisión terapéutica no debe basarse en un solo resultado o test Instrucciones de almacenaje y cuidado Almacenar las tiras en su propio frasco. No extraer el desecante. No sacar la tira hasta el momento de su uso. No tocar las áreas reactivas de la tira. Almacenar a temperaturas inferiores a 30ºC, pero no en refrigerador. No almacenar bajo luz directa. 3

4 Información sobre las áreas reactivas Glucosa La glucosa no debe ser detectable en orina en condiciones normales. Este test es específico de glucosa; no hay otra sustancia que se conozca presente en orina que dé resultados positivos En orinas diluidas o con glucosa en pequeña cantidad, concentraciones de ácido ascórbico superiores a 2,2 mmol/l pueden dar falsos positivos Método analítico: GOD-POD. Bilirrubina Normalmente, la bilirrubina no es detectable en orina Resultados traza de bilirrubina son suficientes para iniciar una investigación. Método analítico: diazorreacción Cetonas El test reacciona sólo con el ácido acetoacético en orina Ciertas orinas de ph bajo y/o densidad alta pueden dar falsos positivos Las muestras de orina no patológicas suelen dar negativo con este reactivo Método analítico: reacción con nitroprusiato sódico. Densidad Este test permite la determinación de densidades entre 1-1,03 Orinas alcalinas altamente tamponadas pueden causar lecturas relativamente bajas en comparación con otros métodos. Pueden salir resultados falsamente altos en presencia de concentraciones moderadas de proteínas (1-7,5 g) Método analítico: el aumento de electrolitos de orina hace que se liberen protones de la tira y se produzca una disminución de ph que ocasiona un cambio de color. Sangre ph El desarrollo de unos puntos verdes (eritrocitos intactos) o de color verde difuminado (hemoglobina/mioglobina libre) indican la necesidad de una investigación más profunda La sensibilidad de este test puede disminuir algo en las orinas de alta densidad Falsos positivos pueden aparecer por ciertos contaminantes oxidantes o por la peroxidasa microbiana asociada a una infección Método analítico: se valora la actividad pseudoperoxidasa de la hemoglobina, puesta de manifiesto por la oxidación de o-toluidina en presencia de H 2 O 2. El área de ph mide de una en una unidad en el rango de 5 a 8,5 en lectura visual y de 5 a 9 en lectura instrumental Si no sigue el procedimiento correcto y permanece un exceso de orina en la tira, se puede producir un fenómeno conocido como runover, en el cual el tampón del reactivo de proteína contamina la prueba de ph dando un resultado anormalmente bajo Método analítico: se emplean indicadores ácido-base como el rojo de metilo o el azul de bromotimol. 4

5 Proteínas Generalmente no se suele detectar proteínas por este método en orina a pesar de que normalmente se excreta una pequeña cantidad. Cualquier color por encima de trazas es indicador de proteinuria. Se pueden encontrar falsos positivos en orinas alcalinas o altamente tamponadas y por contaminación con compuestos cuaternarios amoniacales y detergentes. Método analítico: se detecta básicamente la presencia de albúmina, el color de determinados indicadores de ph se altera en presencia de proteínas. Urobilinógeno El área reactiva puede tener interferencias con sustancias que interfieran con la reacción de Ehrlich. Reacciones de color atípicas se pueden presentar en caso de presencia de ácido p-aminobenzoico o formalinas. Sustancias altamente coloreadas como riboflavinas pueden enmascarar el desarrollo del color Con este test no se puede determinar la ausencia de urobilinógeno Método analítico: diazorreacción con el reactivo de Ehrlich. Nitritos Este test depende de la conversión de los nitratos en nitritos a través de las bacterias presentes en la orina, generalmente Gram negativas. Puntos o bordes rosados no deben confundirse con un resultado positivo. Pueden aparecer falsos negativos cuando la orina no ha pasado tiempo suficiente en la vejiga (4 horas o más) para el proceso de reducción. Método analítico: reacción de los nitritos con una amina aromática para dar un compuesto de diazonio que se acopla para formar un azocolorante rosado. Si el resultado es positivo se hará un cultivo de la orina. En el siguiente cuadro se resumen los fundamentos de las distintas determinaciones: 5

6 9.5. EXAMEN MICROSCÓPICO DE ORINA. SEDIMENTO URINARIO El estudio del sedimento urinario comprende la investigación, hallazgo e interpretación de una serie de elementos o estructuras, del más variado origen y composición, que aparecen suspendidas en la orina y que proporcionan ayuda para el diagnóstico y evolución de las enfermedades renales Procedimiento experimental Para un correcto análisis, es necesario procesar las muestras en las tres horas siguientes a su toma, y seguir los siguientes pasos: 1. Homogeneizar la muestra 2. Tomar unos 10 ml en un tubo de fondo cónico 3. Centrifugar a 2000 r.p.m. durante 5 minutos 4. Decantar el sobrenadante 5. Resuspender el sedimento residual en unas gotas de orina 6. Montar una preparación en fresco evitando la formación de burbujas y 7. Observar al microscopio con el objetivo 40x, luz media y condensador a media altura Estructuras del sedimento urinario El sedimento urinario contiene todos aquellos materiales insolubles que se han acumulado durante el proceso de formación de la orina. Concretamente, podemos encontrar: células, cilindros, microorganismos y cristales Células: podemos encontrar células hemáticas (hematíes y leucocitos) y células endógenas. Hematíes: la presencia de glóbulos rojos en orina recibe el nombre hematuria. Son células de menor tamaño que los leucocitos o las células epiteliales, cuya presencia no se puede considerar anómala siempre que no excedan de 3 por campo. Su apariencia puede variar en función de la densidad de la orina, así en orinas poco densas se hinchan y se lisan ( células fantasma ), mientras que en orinas con alta densidad aparecen con forma dentada. Leucocitos: el aumento de leucocitos en orina (más de 5 por campo) recibe el nombre de piuria o leucocituria. Más del 50% se lisan tras 2-3 horas a temperatura ambiente. Células endógenas: frecuentemente aparecen células epiteliales cuyo tamaño es superior al de los leucocitos Cilindros: los cilindros son conglomerados alargados de material proteico (mucoproteína de Tamm-Horsfall) formados en los túbulos renales o en los conductos colectores. Su existencia no indica obligatoriamente la existencia de una patología renal aunque se suelen asociar con alteraciones en la filtración y/o reabsorción de proteínas (se suelen acompañar de proteinuria). Si aparecen en algunos campos y no en otros se informan como raros u ocasionales. Si existe un número contable por campo se suelen contar 4 o 5 campos e informar del valor medio. En la siguiente imagen se aprecian los principales tipos de cilindros: 6

7 Microorganismos: la presencia de bacterias en orina recibe el nombre de bacteriuria y su existencia (se informa como moderada, escasa o intensa) implica la necesidad de un examen bacteriológico. Si bien, en ocasiones pueden aparecer por contaminación de la orina durante la toma de la muestra o por una mala conservación (en general un ph elevado, bacteriuria y bajo número de leucocitos suele indicar que la muestras se ha mantenido a temperatura ambiente durante un tiempo prolongado). Por último destacar que es frecuente la presencia de la levadura Candida albicans Cristales: La presencia de cristales en orina recibe el nombre de cristaluria. Los cristales se forman por precipitación de las sales excretadas aunque su existencia no suele tener gran importancia. En la imagen aparecen los principales cristales del sedimento urinario PRUEBAS DE VALORACIÓN DE LA FUNCIÓN GLOMERULAR 7

8 El proceso de formación de la orina comprende: 1. La filtración glomerular como consecuencia de la cual se genera la orina primaria, con una composición es similar a la del plasma pero sin proteínas. 2. reabsorción tubular 3. secreccióm tubular El primer paso en la formación de la orina es la filtración del plasma en el glomérulo, originando la llamada orina primaria cuya composición es similar a la del plasma sin la mayoría de las proteínas. Por ello parece lógico que la existencia de proteinuria indique una lesión en la membrana glomerular. Por otra parte, si el caudal de filtrado glomerular desciende por ejemplo como consecuencia de una enfermedad renal, se produce retención en la sangre de los productos de desecho del metabolismo ej. Urea, creatinina y ácido úrico. Por último, probablemente el índice de filtración glomerular sea la determinación más útil en la valoración de la función glomerular. Vamos a comentar algunas de estas determinaciones: 1. Determinación de la concentración de urea sérica La urea es un producto de desecho de las proteínas que se sintentiza en el hígado, pasa a la sangre, se filtra en el gomérulo y en sufre reabsorción parcial en el túbulo. La concentración de urea en plasma no es excesivamente útil como medida de la función glomerular, puesto sufre reabsorción tubular y está sujeta a otras variables: ingestión de proteínas en la dieta, sangrado gastrointestinal Determinación: 1. Análisis químico directo: reacción de Fearon en la que la urea se condensa en caliente y en medio ácido con diacetil monoxima para dar un cromógeno que se determina espectrofotométricamente: método poco utilizado. 2. Reacciones en dos pasos: tratamiento de la urea para producir amoniaco (ej. Por acción del enzima ureasa) y posterior cuantificación del amoniaco generado ej. Por método espectrofotométricos 2. Determinación de la concentración de creatinina en plasma La creatinina es un producto de desecho del metabolismo muscular (deriva del fosfato de creatinina y la creatina). Pasa a sangre y se excreta de manera constante por la orina: se retira del plasma por filtración glomerular casi en su totalidad y no sufre reabsorción tubular. Ventajas: Los niveles de creatinina dependen de la masa muscular y no se afectan por la dieta. Es por tanto constante al formarse y al excretarse lo que lo convierte en un índice útil para evaluar la filtración glomerular. Inconveniente: Es poco sensible, los valores no aumentan hasta que no se pierde entre 2/3 y ½ de la funcionalidad renal. Determinación: reacción de Jaffé: reacción con el ácido pícrico en medio básico para formar un compuesto de color rojo que se determina espectrofotométricamente. 8

9 3. Determinación de la concentración de ácido úrico en plasma El ácido úrico es el producto de degradación de las bases púricas. Parte del ácido úrico formado se excreta por orina y en menor proporción por vía biliar. Un aumento de la concentración de ácido úrico en plasma puede indicar insuficiencia renal, gota Determinación: se pueden emplear métodos químicos o enzimáticos, los segundos utilizan el enzima uricasa que descompone el ácido úrico generando agua oxígenada que por acción del enzima peroxidasa libera oxígeno que a su vez oxida a otro compuesto que se convierte en un cromógeno cuya concentración se determina espectrofotométricamente. 4. Determinación del índice de filtración glomerular (IFG) Es sin duda la valoración más importante, se basa en el concepto de depuración: cantidad de plasma liberado de una sustancia determinada por el riñón en un minuto. El caudal máximo al cual se puede depurar del plasma cualquier componente es igual al caudal de filtrado glomerular. IFG (ml/min) = (concentración en orina del componente / concentración en plasma del componente) diuresis (ml/min) Se utilizan sustancias que se eliminan exclusivamente por filtración glomerular y no sufren reabsorción ni secreción tubular, gracias a esta característica se puede relacionar IFG y aclaramiento o depuración. La inulina (un glúcido vegetal) puede ser perfundido y utilizado con este fin pero lo más frecuente es emplear la creatinina que ya está presente en la sangre. Metodología: - Determinar la concentración de creatinina en orina de 24 horas ( a una hora determinada ej. 8 de la mañana se le pide al paciente que vacíe su vejiga. Esta orina se desecha. Toda la orina producida durante el resto del día y la noche se recoge. Al día siguiente, a la misma hora de la mañana se vacía la vejiga y se recoge la orina completándose así la recogida de la orina de 24 horas). - Al finalizar la recogida de orina y en ayunas se toma una muestra de suero y se hace la determinación de creatinina en ella. - Se calcula la diuresis como el volumen total (ml) de orina recogida en 24 horas dividido entre 24 (horas) x 60 (min/hora) para obtener ml/min. - Se aplica la fórmula considerando que las concentraciones en orina y suero deben tener las mismas unidades. V.R ml/min NOTA: la velocidad de aclaramiento de una sustancia es proporcional a la superficie del cuerpo y al tamaño del riñón por eso se hace una corrección multiplicando por 1.73/ S donde 1.73 es la superficie media del cuerpo humano y S es la superficie del paciente que se puede calcular conociendo su peso y altura. 5. Proteinuria La membrana glomerular no suele dejar pasar a la albúmina y las grandes proteínas por ello cuando se detecta en orina de 24 horas valores superiores a 250 mg es que ha tenido lugar una lesión importante de la membrana glomerular PRUEBAS DE VALORACIÓN DE LA FUNCIÓN TUBULAR 9

10 En los túbulos renales se pueden diferenciar distintas regiones con diferentes funciones: responsables de la reabsorción de distintas sustancias (ácido úrico, agua, glucosa, aminoacidos ) y de la secreción de otras (H + ). Las pruebas de valoración de la función tubular son marcadores muy sensibles de enfermedad renal pero no específicas. La lesión tubular renal suele ser secundaria a otras alteraciones ej. Exposición a metales mesados o fármacos nefrotóxicos. Las principales determinaciones son: 1. Determinación de la densidad de la orina La determinación de la densidad nos indica de manera indirecta la cantidad de solutos disueltos en una cantidad determinada de solvente. Se puede determinar: -Mediante un urinómetro: instrumento en forma de bulbo con un rabillo cilíndrico y una escala calibrada para la lectura de la densidad. La orina se coloca en una probeta, se introduce el urodensitómetro y en la escala se lee por la línea hasta donde llega la orina. Inconvenientes: requiere mucho volumen de orina y corrección por la temperatura. - Mediante el uso de tiras reactivas: ya visto - Mediante el uso de refractómetros: aparatos que determinan el índice de refracción de una solución pero en una escala calibrada para peso específico. Sólo requiere unas gotas de orina y la medida se realiza en segundos. Fundamento: el índice de refracción aumenta con la cantidad de solutos 2. Medición de la osmolalidad en el plasma y la orina La osmolalidad determina el número de partículas de soluto disueltas en una disolución (e independientemente del tamaño o carga del ión o la molécula) por unidad de masa de solvente (mosm/kg). Una solución que contiene 1 osmol de soluto por Kg de disolvente tiene una concentración 1 osmolal. Por tanto esta determinación valora la capacidad del riñón para concentrar o diluir la orina. Está sujeta a menos interferencias que la densidad y presenta como ventajas: 1) No se producen interferencias con la temperatura 2) Las partículas grandes como proteínas, glúcidos no elevan sus valores de forma tan evidente como en el caso de la densidad. 10

11 Inconveniente: requiere un aparato especial, osmómetro, basado en que el punto de congelación del agua disminuye dependiendo del número de partículas en solución. Los más frecuente es calcular la relación entre osmolalidad en orina y en suero. Relación O/P osmolal = osmolalidad urinaria / osmolalidad sérica o plasmática V.R Es decir, la orina está más concentrada que el plasma. Cuando dicha razón es menor o igual a 1 los túbulos renales no están reabsorbiendo agua. 3. Prueba de restricción hídrica Se utiliza para determinar la causa de una poliuria excesiva. Supone la privación completa de líquido durante un período de 24 horas y la medición de la osmolalalidad en orina y plasma tras la prueba. La razón entre la osmolalidad de la orina y el plasma debe ser 2 o superior. Esta prueba es potencialmente peligrosa y muy desagradable. 4. Prueba de carga ácida Se emplea para valorar si existe una disminución de la secreción tubular de iones hidrógeno que produzca una acidosis (ph ácido en plasma). Realización: se administra cloruro amónico vía oral y se recogen muestras de orina en las 8 horas siguientes. Si la función renal es normal, el ph de al menos una muestra debe ser inferior a 5,3. 5. Proteinuria específica La β 2 - microglobulina y la α- microglobulina son proteínas pequeñas que se filtran en el glomérulo y se suelen reabsorber en los túbulos. Una concentraciòn alta de estas proteínas en orina es un indicador sensible de lesión de las células tubulares renales. 6. Glucosuria y aminoaciduria: la presencia de glucosa o aminoácidos en orina con concentraciones plasmáticas fisiológicas suelen reflejar lesión tubular específica Bibliografía GAW, Allan. Bioquímica Clínica. Madrid: Harcourt, p. ISBN: SALVE, Maria Luisa. Laboratorio Clínico. Bioquímica. Madrid: McGraw-Hill- Interamerica, p. ISBN: PRIETO, Santiago. Laboratorio Clínico. Principios generales. Madrid: McGraw-Hill- Interamerica, p. ISBN: D OCON NAVAZA, Mª Carmen. Fundamentos y Técnicas de Análisis Bioquímico. Análisis de Muestras Biológicas. Madrid: Paraninfo, p. ISBN: GLOSARIO Aminoaciduria: presencia de aminoácidos en orina. O 11

12 Cetonas: compuestos que presentan un grupo ceto (-C-) Diazocompuestos: compuestos que presentan el grupo funcional diazo (R 2 =N N) Glucosuria: presencia de glucosa en orina. GOD/POD: método analítico de determinación de glucosa mediante un procedimiento en dos pasos: 1. Oxidación de la glucosa por el enzima glucosa oxidasa (GOD) generándose H 2 O 2 2. Descomposición del H 2 O 2 por acción del enzima peroxidasa (POD) como consecuencia de la cual se genera un cromógeno. Indicador ácido-base: ácido cuya base conjugada presenta distinto color. orina de 24 horas: orina recogida durante un período de 24 horas siguiendo el siguiente procedimiento: vaciar la vejiga a las 8 de la mañana y desechar la orina. Recoger toda la orina evacuada durante las siguientes 24 horas en recipiente adecuado y guardándolo en el frigorífico. A las 8 de la mañana del día siguiente se recogerá la última muestra. Proteinuria: presencia de proteínas en orina. Refractómetros: aparatos que determinan el índice de refracción de una solución pero en una escala calibrada para peso específico. Sólo requiere unas gotas de orina y la medida se realiza en segundos Preguntas de revisión 1. Defina el término análisis de anormales 2. Cómo se lleva a cabo el análisis de anormales? 3. Describa el fundamento de las determinaciones más frecuentes en un análisis de anormales 4. Qué es el sedimento urinario? 5. Cómo se analiza el sedimento urinario en un laboratorio clínico? 6. Cite los principales componentes que puede encontrar en un sedimento urinario 7. Cuál es el fundamento de la determinación de urea sérica? 8. Cuál es el principal indicador de alteración de la función glomerular? Justifique su respuesta e indique el procedimiento experimental para su determinación. 9. Cómo podría valorar la función tubular? 10. Qué y cómo se mide la relación O/P osmolal? 12