Principios de Endocrinología

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1 FACULTAD DE MEDICINA U.N.N.E. Principios de Endocrinología Hormonas - Receptores 2008 Brandan, Nora Profesora Titular. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE. Llanos, Cristina Jefa de Trabajos Prácticos. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE. Miño, Claudia Jefa de Trabajos Prácticos. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE. Ragazzoli, Maximiliano A. Ayudante Alumno por Concurso. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE. Ruiz Díaz, Daniel A. N. Ayudante Alumno por Concurso. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. UNNE.

2 INTRODUCCIÓN A LA ENDOCRINOLOGÍA... 1 HORMONAS... 2 NATURALEZA QUIMICA... 2 PROPIEDADES GENERALES... 3 TIPOS DE ACCIONES PROMOVIDAS POR HORMONAS... 3 SECRECIÓN HORMONAL... 4 CIRCULACIÓN Y TRANSPORTE HORMONAL... 5 REGULACION DE LA SECRECIÓN HORMONAL... 5 RECEPTORES... 6 CLASIFICACIÓN... 7 Receptores Nucleares (RN)... 7 Receptores de Membrana RECEPTOR DE TIROSINA QUINASA RECEPTOR SERINA QUINASA RECEPTOR GUANILATO CICLASA RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G (GPCR) RECEPTORES DE CITOQUINAS (receptores asociados a TQ extrínseca) SISTEMAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES CORRIENTE ABAJO Sistema Ras-quinasa y MAP-quinasa Sistema de la Proteína-Quinasa A Sistema de la Proteína-Quinasa C Sistema de la Proteína-Quinasa G COMUNICACIÓN CRUZADA (CROSS-TALK) BIBLIOGRAFÍA INTRODUCCIÓN A LA ENDOCRINOLOGÍA La especialidad de la endocrinología abarca el estudio de las glándulas y de las hormonas que éstas producen, en sus diferentes aspectos fisiológicos y patológicos. El término endócrino fue acuñado por Starling para marcar el contraste entre las hormonas de secreción interna (endócrinas) y las de secreción externa (exócrinas) o secretadas hacia una luz como por ejemplo las del aparato digestivo. Su nombre proviene del griego, y significa ciencia de las secreciones internas. El sistema endócrino (SE) comprende el conjunto de órganos y tejidos que forman hormonas. El sistema endócrino y nervioso regulan casi todas las actividades metabólicas y homeostáticas del organismo, determinan el ritmo del crecimiento y desarrollo, influyen sobre muchas formas de conducta y controlan la reproducción. Un tercer sistema que media la comunicación intercelular es el sistema inmunológico, éste se halla sujeto a una modulación nerviosa y hormonal, y las citoquinas producidas por los linfocitos pueden modificar la función endócrina. Glándula endócrina es todo órgano o tejido con cierta individualidad anatómica que secreta una o varias hormonas. El término hormona proviene también del griego y significa "poner en movimiento" y describe las acciones dinámicas de estas sustancias circulantes que despiertan respuestas celulares y regulan los procesos fisiológicos a través de mecanismos de retroalimentación o feedback. Página 1

3 No existe relación anatómica entre las diversas glándulas endócrinas, pero entre algunas existen ciertas relaciones hormonales de interdependencia, control o servomecanismos, por lo que hablamos de ejes endocrinos, por ej.: eje sistema nervioso central (SNC)-hipotálamo-hipófisisgónada. La histología de las glándulas endócrinas es muy diversa pero, por lo general, poseen características parecidas. HORMONAS Las hormonas son auténticos mensajeros químicos, y se considera a cualquier sustancia de un organismo que actúe como una señal capaz de producir un cambio a nivel celular. Las hormonas endócrinas se originan en una glándula y realizan un trayecto considerable a través de la sangre para alcanzar la célula blanco (target cell). Las hormonas funcionan como un sistema mayor de comunicación entre diferentes órganos y tejidos (comunicación intercelular), permitiendo a las células, responder en forma coordinada a los cambios en los ambientes interno y externo. En las últimas décadas, la consideración de hormona como mensajero químico de acción distante ha sobrepasado su concepto clásico, surgiendo las siguientes definiciones: Endocrinia: proceso por el cual una hormona es liberada desde un órgano endócrino, vertida a la circulación y alcanza luego la célula blanco, a distancia de su origen. Paracrinia: proceso por el cual la hormona, luego de ser liberada, ejerce su acción en células o tejidos vecinos. Autocrinia: proceso por el cual la hormona, post-liberación actúa como ligando de receptores a nivel de la misma célula que le dio origen. Neuroendocrinia: Síntesis hormonal a nivel neuronal con posterior acción a distancia vía sanguínea. Neurocrinia: síntesis hormonal a nivel neuronal con posterior acción parácrina. Neurotransmisión: Señalización intercelular a nivel neuronal. Ferocrinia: síntesis hormonal con posterior liberación al medio ambiente y efecto sobre organismos ajenos. Dado que los factores parácrinos y las hormonas pueden compartir la maquinaria de señalización, no debe sorprender que las hormonas puedan, en algunos escenarios, actuar como factores parácrinos. NATURALEZA QUIMICA De acuerdo a ésto pueden clasificarse las hormonas en 5 categorías: 1. Estereoides: derivan del colesterol. A este grupo pertenecen los glucocorticoides, aldosterona y andrógenos de la corteza suprarrenal, estrógeno y progesterona del ovario, testosterona del testículo, y 1,25-dihidroxi-D3. (metabolito activo de la vitamina D3). Debido a su carácter poco polar, estas hormonas atraviesan con facilidad (difusión simple) las membranas celulares. 2. Derivados de aminoácidos: adrenalina o epinefrina y noradrenalina o norepinefrina (catecolaminas) de la médula suprarrenal, tiroxina y triiodotironina de tiroides son derivados de tirosina y la melatonina de la glándula pineal es producida a partir de triptófano. No penetran en las células blanco. Página 2

4 3. Derivados de ácidos grasos: prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos, llamados genéricamente eicosanoides, se originan de ácidos grasos poliinsaturados. El ácido araquidónico es el precursor más importante. Sus acciones primarias son de tipo autócrino o parácrino. 4. Péptidos: en esta categoría se incluyen los factores reguladores y las hormonas antidiurética y oxitocina del hipotálamo, adrenocorticotrofina y hormona melanocito estimulante, glucagón del páncreas, gastrina, secretina, pancreozimina y otras hormonas del tracto gastrointestinal y calcitonina de la glándula tiroides. 5. Proteínas: hormonas paratiroidea, insulina, prolactina, foliculoestimulante, luteinizante, hormona de crecimiento y tirotrófica de adenohipófisis son de naturaleza proteica. Todas estas poseen un peso molecular igual o superior a 6000 Daltons o un número de residuos aminoacídicos igual o superior a 50 aminoácidos. PROPIEDADES GENERALES Actividad: actúan en concentraciones muy pequeñas dado que una ínfima cantidad es capaz de generar respuestas notablemente intensas. Los niveles de hormonas circulantes en sangre suelen ser muy bajos. Vida media: es el tiempo en que la concentración de la hormona desciende a la mitad. Debido a su actividad biológica las hormonas deben ser degradadas y convertidas en productos inactivos, pues su acumulación en el organismo tiene efectos perniciosos. El tiempo promedio de duración de las hormonas en sangre varía de una a otra y puede oscilar desde segundos hasta días. Será más corta cuanto más rápidamente sea metabolizada y más prolongada si su metabolismo es lento. Velocidad y ritmo de secreción: la secreción hormonal se produce de forma pulsátil, con períodos de secreción (pulsos) y otros de reposo. Frecuentemente responden a estímulos del ambiente y del medio interno. Por ejemplo la secreción de insulina es promovida por el incremento de la glucosa en sangre. Especificidad: una de las propiedades más notables de las hormonas es su gran especificidad de acción. Una hormona determinada solo actúa sobre las células que constituyen su blanco, objetivo o diana. La hormona es vertida a la circulación general y alcanza a todos los tejidos, sin embargo, su acción se ejerce únicamente a nivel de un número limitado de células en las cuales provoca un tipo definido de respuesta. Esta propiedad indica la existencia de un mecanismo por el cual la hormona reconoce a sus células efectoras y las distingue de las demás. TIPOS DE ACCIONES PROMOVIDAS POR HORMONAS La función hormonal se desarrolla en 4 ámbitos generales: reproducción; crecimiento y desarrollo; mantenimiento del medio interno; y producción, utilización y almacenamiento de energía. Los efectos de las hormonas son complejos. Una sola hormona puede tener efectos distintos en diferentes tejidos, e inclusive en un mismo tejido en momentos distintos de la vida, y del mismo modo, ciertos procesos biológicos son regidos por una única hormona, mientras que otros requieren interacciones complejas entre varias de ellas. Por ejemplo la testosterona promueve la formación de eritropoyetina y ésta a su vez estimula la eritropoyesis y origina las diferencias que existen en los niveles de hemoglobina entre los hombres y las mujeres. Página 3

5 Los distintos procesos metabólicos que se hallan bajo regulación endócrina son influidos por más de una hormona, un ejemplo clásico es el mantenimiento de los niveles de glucosa dentro de determinados límites: lo suficientemente altos como para prevenir la disfunción del sistema nervioso central, pero lo bastante bajos como para evitar los efectos nocivos. Esta regulación (control) no se podría cumplir con exactitud por influencia de una sola hormona por potente que fuera. Por lo tanto, podemos decir que la presencia de estos complejos mecanismos de control tiene 2 implicancias fundamentales: primero, permite un extraordinario grado de regulación fina, como en el caso de la glucosa sanguínea, que puede mantenerse dentro de límites normales en condiciones nutricionales variadas; segundo, pueden proveer un amplio margen de seguridad, en la medida en que otros mecanismos alternativos entren en acción cuando la hormona de la serie es deficitaria (sistema de autoprotección). Las acciones hormonales se pueden agrupar en 3 categorías relacionadas y que no son excluyentes entre sí y se asocian con: Mecanismo de trasporte en membranas celulares: : algunas hormonas modifican el flujo de metabolitos o iones a través de membranas por su acción sobre sistemas de trasporte o canales iónicos. Modificación de la actividad enzimática: : se ejerce principalmente a nivel de enzimas regulatorias cuya actividad es aumentada o disminuida por modificación covalente. Modificación sobre la síntesis de proteínas: : muchas hormonas modulan la síntesis de enzimas y otras proteínas, actúan predominantemente a nivel del ADN nuclear, regulando el proceso de transcripción génica. Esta acción requiere más tiempo para manifestarse que la anterior y tiene efectos más sostenidos. SECRECIÓN HORMONAL La secreción hormonal no tiene lugar de forma continua y uniforme, sino pulsátil, con períodos de secreción (pulsos) y otros de reposo. En los pulsos se distingue un pico, un nadir, una amplitud y una frecuencia (Fig. 1). Las características de los pulsos pueden variar a lo largo del día o en diversas circunstancias fisiológicas o patológicas. Cuando la secreción varía ostensiblemente a lo largo del día se habla de ritmo circadiano,, que puede presentar su punto máximo en uno u otro momento del día (Fig. 2).. Cuando el período es mayor a 28 horas, se habla de ritmo infradiano y cuando los ciclos ocurren varias veces en un día, con períodos menores a 19 horas se habla de ritmo ultradiano. Conocer que las hormonas tienen distintos ritmos de secreción es importante para realizar una correcta determinación hormonal dado que estos ritmos determinarán el momento Página 4

6 adecuado para la toma de muestra. No obstante, debemos aclarar que algunas hormonas cuyos ritmos son pulsátiles, muchas veces es necesario hacer pruebas de estimulación o inhibición dado que una determinación aislada no aporta ningún dato clínico de valor. CIRCULACIÓN Y TRANSPORTE HORMONAL Por lo general, las hormonas peptídicas pueden circular libremente por el plasma o débilmente unidas a la albúmina, mientras que las hormonas esteroideas, por ser hidrofóbicas, necesitan proteínas transportadoras que facilitan su circulación en el medio acuoso que es el plasma sanguíneo. Algunas hormonas peptídicas utilizan también proteínas transportadoras, así la GH (grow hormone) se une a la GH-BP (GH-binding protein). El transporte también impide su pronta metabolización o su rápida filtración renal aumentando así su vida media plasmática (t1/2). Generalmente una pequeña fracción de la hormona circula en forma libre, siendo ésta la auténtica hormona funcionalmente activa. REGULACION DE LA SECRECIÓN HORMONAL Regulación por el SNC-SE: : una multitud de factores influyen en el SE a través fundamentalmente del SNC. Estas relaciones se establecen principalmente entre el SNC y el hipotálamo, pero también mediante el aporte sanguíneo a las glándulas endócrinas mediante la regulación nerviosa de la presión arterial. Otra forma de regulación se realiza a través de la inervación directa de diversas glándulas endócrinas, ya que las terminaciones nerviosas liberan neurotransmisores que influyen modulando las mismas; estimulando o inhibiendo a las secreciones endócrinas. Regulación por hormonas tróficas: Las hormonas tróficas son aquellas que controlan el crecimiento y función de las glándulas endócrinas periféricas relacionadas, estas hormonas tróficas son controladas a su vez por las propias hormonas cuya secreción regulan (Fig. 3). Este mecanismo es conocido como sistemas de servomecanismo, retrocontrol, retroalimentación o Feed Back ; y puede clasificarse en: Directo: entre glándula periférica (ej. glándula tiroides) e hipófisis. Indirecto o largo: con la glándula periférica y el hipotálamo. Corto: entre hormonas hipofisiarias e hipotalámicas Ultracorto: entre hormonas hipotalámicas y el propio hipotálamo Hipotálamo-SNC. Habitualmente, los servomecanismos suelen ser negativos. Cuando una hormona periférica aumenta, induce la disminución de la hormona hipotalámica, y ésta de la hipofisiaria, provocando una menor producción de la hormona periférica regulando el sistema. Lo contrario ocurre si ésta disminuye. En ocasiones, el servomecanismo es positivo, como cuando el estradiol aumenta al final del Figura 3. Mecanismo de Feed Back Página 5

7 período folicular e induce un estímulo de la secreción de la LH que provocará la ovulación. Así sucede con los diferentes sistemas hipotálamo-hipofisario-glándula periférica. Regulación por metabolitos: Existen hormonas cuya regulación principal tiene lugar por vías diferentes a los servomecanismos mencionados. Así sucede con las hormonas que intervienen en el metabolismo del Ca 2+ : parathormona (PTH), calcitonina y vitamina D. También ocurre con la insulina y glucagón respecto a la glucemia. Para que la respuesta endócrina sea efectiva es necesario adecuar el proceso de síntesis proteica a las necesidades del organismo. Este acoplamiento dependerá, entre otras cosas, de la cantidad de hormona almacenada por la célula, y de la intensidad y frecuencia de la demanda. Por ejemplo, la regulación de la síntesis de la proinsulina tiene lugar fundamentalmente a nivel de la traducción del ARNm de insulina, que en unos minutos se incrementa cinco o diez veces, cuando aumentan los niveles de glucosa en sangre. Sin embargo, la liberación de PTH permanece prácticamente constante a lo largo del tiempo, reflejando la necesidad del organismo de mantener constantes los niveles de Ca 2+, dentro de un intervalo muy estrecho. Existen mecanismos de regulación en cada uno de los pasos que participan en la transmisión de la información genética. El objetivo de la regulación es que las hormonas disponibles en cada momento sean las adecuadas a cada estímulo a los que se enfrenta el organismo. La regulación fisiológica de la expresión de los genes que codifican las hormonas está mediada por dos grandes grupos de macromoléculas: las proteínas susceptibles de fosforilación y los receptores de hormonas esteroides, que son los intermediarios de las hormonas peptídicas y de las hormonas esteroides, respectivamente. RECEPTORES Son macromoléculas o asociaciones macromoleculares, responsables del reconocimiento de la hormona, ya que proveen el sitio de fijación para la misma, de manera selectiva en virtud de una estrecha adaptación conformacional o complementariedad estructural. La especificidad de las hormonas y su capacidad para identificar sus células efectoras es posible gracias a la presencia de receptores. No solo es necesario que la hormona sea reconocida sino que la combinación de la hormona con el receptor tiene que iniciar una serie de acontecimientos bioquímicos (transducción de señal) que conduzcan a una acción biológica. La hormona (H) y su receptor (R) forman un complejo (H-R), que presenta las siguientes características: 1. Adaptación inducida: la fijación de la hormona al receptor implica una adaptación estructural recíproca de ambas moléculas, similar a lo que sucede a la unión sustrato enzima. Página 6

8 2. Saturabilidad: el número de receptores existentes en una célula es limitado; si se representa en un sistema de coordenadas la cantidad de hormona fijada a receptores en una porción determinada de tejido en función de la concentración de hormona, se obtiene una curva hiperbólica. 3. Reversibilidad. La unión hormona-receptor es reversible. 4. Afinidad. Es la capacidad de fijación de un ligando al receptor, que es determinada por las propiedades moleculares del receptor. Los tejidos diana o blanco son aquellos que contienen los receptores específicos y resultan afectados por una hormona. El carácter y naturaleza de la respuesta dependen de la especialización funcional de la célula blanco. A veces una misma hormona desencadena respuestas diferentes en células distintas. Por ejemplo, la adrenalina produce activación de la glucogenólisis en músculo esquelético y estimula la lipólisis en adipocitos. Se denominan agonistas a los compuestos de estructura semejante a la del agente fisiológico (hormona, neurotransmisor) con capacidad para unirse al receptor y provocar una respuesta. Esta puede ser de igual, mayor, o menor intensidad que la inducida por el agente natural. Los antagonistas se fijan al receptor, pero no producen respuesta, comportándose como inhibidores competitivos. No es necesario que la totalidad de los receptores de la célula esté unida a hormona para obtener una respuesta máxima. Comúnmente esto ocurre cuando alrededor del 20% de los receptores está ocupado por hormona. El resto corresponde a los llamados receptores de reserva. La membrana no es un dispositivo rígido sino que dotado de un alto grado de fluidez, gracias a la cual las proteínas asociadas a la membrana tienen libertad para desplazarse en todas direcciones, por ello se habla de receptores móviles. El número de receptores de un tipo determinado en la superficie de una célula puede variar entre y La cantidad de receptores intracelulares es generalmente mucho menor. CLASIFICACIÓN Algunos receptores están localizados dentro de la célula y éstos funcionan como factores de transcripción (por ejemplo receptores para hormonas esteroides), actuando a nivel nuclear regulando la expresión génica. Otros receptores están localizados sobre la superficie celular y funcionan primariamente para transportar los ligandos dentro de la célula por un proceso llamado endocitosis mediada por receptor, que también actúan a nivel nuclear regulando la expresión génica. También en la superficie celular se localizan receptores que desencadenan caminos de señalización intracelular (transducción de señal) mediante la formación de segundos mensajeros. Receptores Nucleares (RN) Son receptores intracelulares que funcionan en el núcleo de la célula blanco para regular la expresión génica (independientemente de su ubicación original que puede ser nuclear, citoplasmática o incluso mitocondrial, como es el caso de un subtipo de receptores de hormonas tiroideas). Página 7

9 CARACTERISTICAS GENERALES Todos los ligandos de receptores nucleares son pequeños, lipofílicos siendo posible su entrada a la célula a través de un mecanismo pasivo, pero en algunos casos se necesita una proteína transportadora de membrana, como sucede en el transporte de hormonas tiroideas al interior de la célula. SUBCLASE DE LIGANDOS DE RN Hormonas clásicas: las clásicas hormonas que utilizan receptores nucleares son las hormonas tiroideas y esteroideas. Estas últimas incluyen al cortisol, aldosterona, estradiol, progesterona, y testosterona. Vitaminas: las vitaminas A y D (liposolubles) son importantes moléculas de señalización que funcionan como ligandos de receptores nucleares. La vitamina A es activada a ácido trans-retinoico, que tiene alta afinidad por los Receptores del Acido Retinoico (RARs). Este ligando es convertido a su isómero 9-cis, el cual es ligando para otro receptor nuclear llamado Receptor Retinoide X (RXR). Estos retinoides son esenciales para el desarrollo de múltiples órganos y tejidos. Metabolitos intermedios y productos: ciertos ácidos grasos poliinsaturados sirven de ligando, activando a receptores denominados Receptores Activados para la Proliferación de los Peroxisomas (PPAR). Es posible que estos receptores funcionen como integradores de la concentración de un cierto número de ácidos grasos. En la biosíntesis del colesterol los intermediarios oxiesteroles son ligandos de otro receptor nuclear denominado Receptor Hepático X (LXR). La falta del mismo trae aparejado la incapacidad para metabolizar el colesterol. Receptores huérfanos: las hormonas y vitaminas recién descriptas aportan a la función de sólo una fracción del total de receptores nucleares. El resto han sido designados como receptores huérfanos, porque sus ligandos no son conocidos. Está claro que muchos de estos receptores se requieren para la vida y el desarrollo de órganos específicos, desde el núcleo cerebral hasta las glándulas endócrinas. Es probable que en un futuro se descubran funciones adicionales como receptores para ligandos fisiológicos, farmacológicos y ambientales. ESTRUCTURA Los receptores nucleares son proteínas, en algunos casos hay múltiples genes que codifican para múltiples receptores. Además hay múltiples receptores para una misma hormona que pueden derivar de un solo gen, ya sea por utilización de un promotor alternativo o por splicing (corte y empalme) alternativo. Finalmente, algunos receptores pueden mediar la señal de más de una hormona, por ejemplo, el receptor de mineralocorticoides (aldosterona) tiene igual afinidad por el cortisol y probablemente funciona como receptor de glucocorticoides en algunos tejidos, como el cerebro. Página 8

10 Los receptores nucleares, que poseen una serie común de dominios funcionales denominados de la A a la F (Fig. 4).. Esta representación lineal es útil para describir y comparar los receptores pero no muestra el rol de los plegamientos proteicos y de la estructura terciaria que median la función de varios receptores. Dominio A/B: : posee una función activadora independiente del ligando, lo que le confiere una cierta autonomía, esta región se denomina también AF-1 (activation function-1). Dominio C: : es el dominio de unión al ADN, contiene una estructura denominada dedos de zinc, consiste en una cadena polipeptídica que contiene cuatro cisteínas unidas a un átomo de zinc y contiene la información necesaria para el reconocimiento de las secuencias específicas en el ADN. Los receptores nucleares poseen dos dedos de zinc, uno es determinante de la especificidad de unión, y el otro es determinante de la funcionalidad. También aquí se encuentra un subdominio denominado caja P que se une a secuencias hexaméricas de nucleótidos del ADN llamados half-sites, que es otro de los factores determinantes de la especificidad de la unión. Por último, este dominio contiene parte de la señal de localización nuclear (NLS; nuclear localization signal). Dominio D: representa la región bisagra. Contiene además el resto de la NLS. Dominio E: representa el dominio de unión al ligando (LBD; ligand binding domain), así como la función activadora de la transcripción dependiente de ligando AF-2 (activation function-2), y una función represora. Dominio F: es un centro de interacción con proteínas coactivadoras. El transporte del RN al núcleo depende Figura 4. de la NLS Estructura receptores nucleares situada entre los dominios C y D. La mayoría de los RN residen siempre en el núcleo en presencia o en ausencia del ligando. Un caso diferente es el receptor de glucocorticoides (GR) que en ausencia de la hormona se asocia a un conjunto de chaperonas formando un complejo en el citosol. MECANISMO DE SEÑALIZACION DE LOS RN Los receptores nucleares son proteínas multifuncionales que transducen las señales de sus respectivos ligandos. Todos estos receptores actúan facilitando o dificultando la trascripción de los genes, algunos residen fundamentalmente en el citoplasma, mientras que otros están siempre en el núcleo. Se hallan formando complejos con proteínas de shock térmico (heat shock protein; Hsp90, Hsp70, del tipo de las chaperonas) que los mantienen en estado inactivo. Página 9

11 Primero y principal, el ligando y el receptor nuclear deben alcanzar el núcleo. El receptor debe unirse a su ligando con alta afinidad. Debido a que la función mayor del receptor es regular selectivamente la transcripción génica, debe reconocer y ligar a los elementos del promotor en genes diana apropiados. Un mecanismo discriminatorio es la dimerización del receptor con una segunda copia de sí mismo o con otro receptor nuclear (homo o heterodimerización respectivamente). El receptor unido al ADN debe trabajar también en el contexto de la cromatina para señalizar la maquinaria basal de transcripción para incrementar o disminuir la transcripción del gen diana. Figura 5. Mecanismo señalización RN Secuencia del mecanismo de acción (Fig. 5): Ingreso de la hormona al interior celular. Unión de la hormona a su receptor específico (en citosol o núcleo), con desplazamiento de las Hsp: formación del complejo Hormona-Receptor (H-R). Cambio conformacional del receptor con formación de dímeros (homo o heterodímeros). Traslocación del complejo H-R al núcleo (si antes se hallaba en citosol). Unión del complejo H-R a secuencias específicas del ADN denominadas Elementos de Respuesta a Hormona (HRE; hormon receptor element), generalmente ubicados corrientes arriba del promotor del gen blanco. Interacción del complejo H-R con factores de transcripción unidos al sitio promotor. Esta unión influye sobre el complejo de iniciación para ubicar correctamente a la ARN Polimerasa II. Iniciación o represión de la trascripción del gen blanco. REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN DE GENES 1) El reclutamiento de enzimas que modifican la estructura de la cromatina: las más importantes son las Acetil-transfererasas de Histonas (HATs, Histone Acetyl Transferase), ya que la acetilación de las histonas abre y desenreda la estructura cromatínica. 2) Interacciones con cofactores de la transcripción: que son un grupo de proteínas; las cuales pueden ser de acción positiva denominándose coactivadores o de acción negativa llamándose entonces correpresores. 3) Modificación de la actividad de la ARN polimerasa II: a través del reclutamiento de los Factores de Transcripción Generales (GTF), inducido por la unión del complejo H- R al gen diana. En este caso, la unión del ligando al receptor incrementa la trascripción de genes. La trascripción de genes es mediado por un complejo de factores (factores de trascripción basal) que en última instancia regulan la actividad de la ARN polimerasa II (enzima encargada de la síntesis de ARN mensajero). Esta enzima utiliza un grupo de GTF, incluidos factores de la transcripción basal. Página 10

12 Figura 6. Reclutamiento de coactivadores Activación de la expresión génica dependiente del ligando: unión al ADN y reclutamiento de coactivadores. (Fig. 6) El complejo H-R se encuentra unido al ADN activándose la transcripción del gen diana. Para esta activación se reclutan proteínas coactivadoras (CBP y p300 especialmente). Las proteínas coactivadoras poseen actividad acetilasa, por lo que su reclutamiento por los receptores activados origina la acetilación de las histonas en los residuos de lisina y facilita la transcripción génica, al hacer que la cromatina adopte una conformación desenrollada. En este modelo, entonces, el mecanismo es la activación de las enzimas HATs, responsables de dicha acetilación. Represión de la expresión génica independiente del ligando: unión al ADN y reclutamiento de correpresores. (Fig. 7) Algunos RN están unidos al ADN en ausencia de la hormona reprimiendo negativamente la transcripción del gen diana. Esta represión no solo anula al gen diana, sino que también amplifica la magnitud de la posterior activación del gen al unirse la hormona. El RN no unido a la hormona recluta a cofactores de acción negativa, llamados correpresores hacia el gen diana, como ser el N- CoR (Correpresor del Receptor Nuclear) y el SMRT (Mediador para silenciar a los receptores de retinoides y de hormona tiroidea; Silencing Mediator for Retinoid and Tiroid receptors) principalmente. El mecanismo de acción es la inhibición de la actividad de la enzima HAT, mediante el reclutamiento de enzimas Desacetilasas de Histonas (HDACs), llevando a la compactación de la cromatina. Regulación negativa de la expresión génica dependiente del ligando (Transrepresión): unión al ADN y reclutamiento de correpresores o coactivadoras. Es la represión de la transcripción en presencia de hormona ligada a su receptor. Uno de los mecanismos incluye la unión del RN a sitios del ADN que revierten la activación llamados elementos de respuesta negativa (NRE; Negative Response Elements), en este caso el complejo H-R recluta correpresores y HDACs a estos sitios. Página 11

13 Figura 7. Reclutamiento de correpresores Receptores de Membrana Son receptores localizados en la superficie celular que funcionan ya sea para transportar sus ligandos al interior celular (endocitosis mediada por receptor) o bien gatillando vías o cascadas de señalización intracelular, desde su ubicación en la membrana plasmática. REGULACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A HORMONA: Se realiza por diversos mecanismos: Sobre el número de R: la cantidad de receptores para un determinado ligando varía en distintos estados fisiológicos. Generalmente la concentración de hormona presente regula la cantidad de receptores específicos en las células blanco. Un aumento sostenido del nivel de hormona provoca disminución del número de receptores disponibles o su inactivación. Este fenómeno es denominado regulación "hacia abajo" ("down regulation") o "desensibilización". El fenómeno contrario, aumento del número de receptores en la membrana externa, regulación "hacia arriba" o "up regulation", se produce cuando hay deficiencia del ligando específico. Las variaciones en número de los receptores se producen ya sea por exocitosis o bien endocitosis mediada por receptor; en tanto que la activación o inactivación puede mediarse por modificaciones covalentes (como fosforilaciones o desfosforilaciones) que alteran su conformación. La disminución absoluta o relativa de la actividad de receptores puede obedecer a causas patológicas, ya sean alteraciones genéticas (mutaciones) que afectan la proteína del receptor o de algunos de los eslabones del sistema de transducción de señales más allá del receptor, o a procesos autoinmunes en los cuales se producen anticuerpos contra un receptor determinado. Página 12

14 Modificaciones post-traduccionales del R: que aumentan o disminuyen la eficacia de la unión. Modificaciones de los mecanismos post R: que modifican la vía final común y la respuesta celular. La transducción de señal es el conjunto de procesos o etapas que ocurren de forma encadenada por el que una célula convierte una determinada señal o estímulo exterior, en otra señal o respuesta específica. Este mecanismo es detonado cuando algún ligando se une a su receptor presente en la membrana plasmática de la célula produciéndose la activación del receptor que es transmitida a modo de cascada corriente abajo. En el proceso de transducción de señal; mediante una cadena de pasos (cascada de señalización), están implicados cada vez más un número mayor de sustancias y enzimas (segundos mensajeros y proteínas señales) cuyo resultado es la amplificación de la señal, es decir, que un pequeño estímulo provoca una gran respuesta celular. La señal de transducción que se desarrolla corriente abajo en el interior celular es llevada a cabo en gran parte por moléculas denominadas segundos mensajeros, siendo el primer mensajero, la propia hormona que desencadenó este proceso. Estas moléculas se caracterizan por poseer un bajo peso molecular y por su facilidad para variar en un rango de concentraciones amplio, dependiendo de la presencia o no de señales que estimulen su presencia, hasta inducir un cambio fisiológico en un efector, como, por ejemplo, una quinasa o un factor de transcripción. Los segundos mensajeros más usuales son: el 3',5'- AMP cíclico (AMPc), 3',5'-GMP cíclico (GMPc), 1,2-diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5- trifosfato (IP3), el calcio (Ca 2+ ) y diversos fosfolípidos denominados fosfoinosítidos, presentes en las membranas celulares. Las proteínas señales son proteínas que se encuentran en el citosol de la célula y se encargan de llevar la información desde la superficie de la célula hasta el núcleo. Una proteína señal activa a otra, y así sucesivamente hasta llegar a activar proteínas reguladoras de genes en el núcleo (llamadas factores de transcripción) y así provocar la transcripción del ADN a ARNm, con la consiguiente síntesis de proteínas. La activación de la proteína señal es mediante fosforilación en distintos aminoácidos, generalmente tirosina, serina o treonina (proteína-quinasa). Una proteína-quinasa es una enzima que modifica a otras proteínas (sustratos), mediante fosforilación, y por tanto activándolas o desactivándolas. Unas dependen de AMPc, otras de GMPc, de DAG, de Ca 2+ y de receptores tirosina quinasa. Mediante las proteínas quinasas se produce modificaciones covalentes de enzimas y otras proteínas de variada naturaleza y funciones. La fosforilación juega un papel importante en la regulación de sistemas de transporte de membranas, en la multiplicación celular, en la modulación de la actividad de la síntesis de nucleótidos y proteínas. Por lo tanto, las proteínas quinasas ocupan un lugar central en la transducción de señal: sirven de puente entre un segundo mensajero, y las respuestas celulares al estímulo (activación o desactivación de factores de transcripción, por ejemplo). Del mismo modo las proteínas fosfatasas son reconocidas como componentes esenciales en los sistemas de transducción de señales; a través de su acción de desfosforilación ocupan un lugar de igual importancia que el de las fosforilaciones en procesos de activación-inactivación covalente de proteínas. Página 13

15 Las proteínas señales más destacadas son algunas MAP Quinasas: ERK1/2, p38 y JNK. Las MAP quinasas son proteínas quinasa activadas por mitógenos. Un mitógeno es un inductor de proliferación y diferenciación celular, como por ejemplo la insulina, o factores de crecimiento como IGF-1, y otras proteínas señal como AMP quinasa, Akt, GSK3 y p70s6k. Estas MAP quinasas, son activadas por una gran variedad de señales (insulina, factores de crecimiento, factores de stress ambiental) y transmiten estas señales fosforilando numerosos substratos, obteniéndose como resultante varios efectos biológicos. Algunos de ellos son inducción de proliferación, diferenciación celular, hipertrofia, inflamación, apoptosis, metabolismo de carbohidratos y transcripción de genes. La activación de estas proteínas, es mediada por receptores del tipo tirosina quinasa, como el receptor de insulina. CLASIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES DE MEMBRANA Los receptores de superficie celular pueden ser clasificados en: 1- Canales Iónicos Dependientes de Ligando. 2- Receptor Tirosina-Quinasa. 3- Receptor Serina-Treonina-Quinasa. 4- Receptor Guanilato Ciclasa. 5- Receptor Acoplado a Proteína G (GPCR; G Protein Coupled Receptor) 6- Receptores de Citoquinas. Los receptores de la clases 1 a 4 son moléculas bifuncionales que unen hormona y sirven a su vez como efectores al actuar como canales iónicos o enzimas. En cambio, los receptores 5 y 6 ligan hormona pero deben reclutar otra molécula para catalizar su función. RECEPTOR DE TIROSINA QUINASA Estructuralmente están constituidos por una cadena polipeptídica cuyo extremo N-terminal posee el sitio de unión del ligando; sigue una hélice α transmembrana y la porción citosólica correspondiente al extremo C-terminal donde se encuentra el sitio activo de función catalítica de Tirosin-Quinasa (TQ). El receptor de insulina, que pertenece a esta clasificación, es algo más complejo; está formado por dos heterodímeros α y β unidos entre sí por puentes disulfuro. La fijación del ligando al dominio extracelular de estos receptores, produce un cambio conformacional que induce dimerización (excepto en el de insulina, formado por dos heterodímeros) y activación de la TQ del dominio citosólico. Se produce fosforilación cruzada de una cadena a otra en varios restos de tirosina de este dominio; se habla de autofosforilación del receptor. Como resultado de estas fosforilaciones, aumenta la actividad de la quinasa y se crean sitios a los cuales pueden unirse otras proteínas señales que actúan como eslabones en la cadena de transmisión de la señal corriente abajo, como lo son las que constituyen los sistema Ras y MAP Quinasa (ver más adelante). Existen por lo menos dos mecanismos donde la fosforilación de tirosina regula la función proteica. a) Induciendo un cambio conformacional en la proteína. b) Regulando las interacciones proteína-proteína (mecanismo indirecto). Página 14

16 Algunos de los sustratos proteicos fosforilados por este receptor son: a) IRS (sustrato del receptor de insulina, Insulin Receptor Substrate) ) 1,2,3 y 4. b) Dominios SH2 (consisten en una secuencia de aproximadamente 100 aminoácidos que ligan residuos de tirosina. Los dominios SH2 varían con respecto a su ligando específico, por ejemplo: PI3K (fosfatidil-inositol inositol 3 quinasa) y Grb-2 (Growth factors binding 2, ligando 2 de factores de crecimiento). c) Dominios SH3 (que consisten en una secuencia de aproximadamente 50 aminoácidos que ligan secuencias ricas en prolina). Por lo tanto, a modo de ejemplo, las IRS sirven como proteínas de anclaje, muelle o docking que en general ligan dominios SH2, y entre estos, a PI3K y Grb-2. Esta unión desencadena múltiples vías de señalización corriente abajo, de las cuales algunas de las más importantes son la cascada Ras, JAK-STAT, MEK y MAP-quinasa,, encadenadas entre sí, partiendo corrientes abajo a partir de Ras. Estas cascadas contribuyen a la habilidad de las tirosina-quinasas para promover el crecimiento celular y regular la expresión de varios genes. Los ligandos que utilizan este tipo de receptor son los siguientes: Factor de crecimiento epidérmico (EGF), Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), Factor de crecimiento derivado de gliomas (GDGF), Factor de crecimiento similar a insulina I y II (IGF I e IGF II) y la Insulina. Para la activación de la función TQ de estos receptores es importante el papel que juega la dimerización.. Hay tres mecanismos: 1) Por ligando dimérico: cada subunidad del ligando se une a un R, por un lado y por otro lado a otra subunidad del mismo ligando. En total se ligan dos R. (Fig. 8; izquierda). Figura 8. Receptores Tirosina Quinasa. Activación por Dimerización. 2) Dos sitios de unión al R dentro de un mismo ligando: El ligando posee en su estructura dos sitios de unión al R, cada uno de los cuales se une a un R. Ej Tyr-quinasa y GH. (Fig. 8; derecha). 3) Dímero de R preexistente: El R en este caso ya está dimerizado, aún en ausencia de ligando, pero dispuesto y orientado de tal forma que no puede activarse antes de unión con el ligando, ej R de insulina. (Fig. 9). Figura 9. Receptor de Insulina RECEPTOR SERINA QUINASA Página 15

17 Figura 10. Receptores Serina-Treonina Quinasa. Mecanismo de Acción. Estructuralmente estos receptores poseen un dominio N-terminal extracelular, donde se une el ligando; un simple dominio transmembrana y un dominio C-terminal intracelular que es la que posee actividad quinasa. Estos receptores fosforilan residuos de serina y treonina en sus proteínas sustrato. Hay 2 tipos de receptores serina quinasa: tipo I y tipo II. El receptor de serina quinasa media las acciones biológicas de la familia de ligandos del TGF (transforming growth factor)-β y de la familia de citoquinas MIS/BMP (Müllerian Inhibitory Substance /Bone Morphogenic Protein). Estos receptores contienen actividad serina-treonina quinasa en su dominio citoplasmático y forman heterodímeros os para ser activados. El receptor tipo II tiene una actividad serina treonina quinasa constitutiva, no modulada por la unión a su ligando. Sin embargo, la unión del ligando al receptor tipo II es reconocida por el receptor tipo I, uniéndose a aquél para formar un complejo. A continuación el receptor tipo I es fosforilado por el II. Esta fosforilación activa la proteína-quinasa del receptor I, lo que conduce a la fosforilación de los factores de transcripción Smad. Estas proteínas fosforiladas se unen a otro miembro de la familia Smad y como resultado, se produce su translocación al núcleo para finalmente regular la expresión génica. (Fig. 10). RECEPTOR GUANILATO CICLASA Estos receptores están constituidos por una cadena polipeptídica con un dominio extracelular al cual se une el ligando, una hélice α transmembrana y un dominio citosólico con actividad enzimática. Así, una sola cadena polipeptídica proporciona el sitio de unión de hormona, el dominio transmembrana y la actividad guanilato ciclasa. (Fig. 11). Esta enzima cataliza la formación de GMPc a partir de GTP. La fijación del ligando estimula la ciclasa y genera en el citosol GMPc que actúa como segundo mensajero. A esta clase de receptores pertenecen los de péptidos natriuréticos atriales. Existe un tipo de guanilato ciclasa solubles (que no son receptores de membrana) citosólicas que son activadas por pequeñas moléculas que atraviesan las membranas como Figura 11. Receptor Guanilato Ciclasa Página 16

18 el óxido nítrico (NO) y el monóxido de carbono (CO). RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNA G (GPCR) Es una numerosa familia de receptores de superficie, que presentan siete hélice α transmembranas. El extremo N-terminal, extracelular, posee varias cadenas de oligosacáridos; la hormona se une a un nicho formado por los extremos externos de varias de las hélices α transmembrana; el extremo C-terminal se encuentra en el lado citosólico e interaccionan, cuando el receptor es activado por la hormona, con proteínas G ubicadas en la cara interna de la membrana plasmática. Las Proteínas G, así llamadas por su propiedad de unirse a nucleótidos de guanina (GDP o GTP), juegan un papel esencial en sistemas de transducción de señales. Sirven de nexo entre los receptores y proteínas efectoras dentro de la célula. Las proteínas G constan de tres tipos de subunidades: α, β y γ. Este heterotrímero está anclado a la cara interna de la membrana plasmática, a través de uniones covalentes con los fosfolípidos. La subunidad α es el componente de fijación del nucleótido de guanina, las subunidades βγ forman un conjunto estrechamente asociado que funciona como una unidad (dímero βγ). Figura 12. Activación de GPCR Página 17

19 La subunidad α fija con alta afinidad nucleótidos de guanina (GDP o GTP). Mientras está unido a GDP se mantiene firmemente asociada al dímero βγ para integrar el heterotrímero que es inactivo. La unión de la hormona al receptor de membrana produce en éste un cambio conformacional que determina su interacción con la proteína G inactiva, se produce entonces la liberación del GDP e ingreso del GTP a la subunidad α. El complejo α-gtp se disocia del dímero βγ y adquiere actividad moduladora sobre la proteína efectora (ej: adenilato ciclasa, fosfolipasas) que le sigue en el sistema de señales, en donde en general se forman segundos mensajeros. Además, la subunidad α tiene actividad GTPasa; es decir que es capaz de hidrolizar el GTP fijado para dar GDP + Pi libre. Este complejo subunidad α-gdp vuelve a fijarse al dímero βγ y reconstituye el heterotrímero inactivo. (Fig. 12). En realidad existen varias formas de la subunidad α, dos de ellas designadas α s (estimuladora, stimulating) y α i (inhibidora), ambas actúan con la adenilato ciclasa, y una tercera, denominada α q, involucrada en la acción de la Fosfolipasa C, que mencionaremos más adelante. Mecanismo de Activación de los GPCR Paso 1: La hormona se une al receptor en la membrana. Paso 2: se produce un cambio conformacional en el receptor que deja expuesto un sitio para la fijación del dímero βγ. Paso 3: la subunidad α intercambia el GDP unido por GTP Paso 4: la disociación de GDP provoca la separación de la subunidad α del dímero βγ. Paso 5: en la superficie del complejo subunidad α- GTP se origina un sitio de unión para la interacción con la Proteína Efectora que sigue en el sistema de transmisión de señal. Paso 6: el GTP se hidroliza a GDP por la actividad GTPasa de la subunidad α, devolviéndola a su conformación original y permitiendo de nuevo su interacción con el dímero βγ retornando el sistema al estado no estimulado en espera de otro ciclo de actividad. En el caso en que una proteína G inhibidora se acople al receptor, los fenómenos son similares, pero la inhibición de la actividad de la proteína efectora puede producirse aquí por interacción directa de la subunidad α inhibidora con la misma, o alternativamente la subunidad α inhibidora puede interaccionar directamente con la subunidad α estimuladora del otro lado y evitar así indirectamente la estimulación de la actividad de la proteína efectora. Las arrestinas son una familia de proteínas que son importantes para regular la transducción de señal dentro de la célula. Son parte de un mecanismo de 2 pasos para regular la actividad de GPCR. En respuesta a un estimulo, el GPCR activa a una proteína G, para desactivar esta respuesta o adaptarse a un estimulo constante, los receptores activados necesitan ser bloqueados. El primer paso consiste en una fosforilación por una clase de serina-treonina quinasa llamada GRK (G protein Receptor Kinase). Esta fosforilación marca específicamente al receptor activado para que pueda ligar a la arrestina. Una vez que la arrestina ha sido ligada el receptor es incapaz de continuar transduciendo la señal. Página 18

20 Diversos experimentos han permitido identificar al menos 15 genes distintos que codifican las subunidades α en mamíferos. También parece existir diversidad entre las formas β y γ de mamíferos. Se han descripto al menos 4 ADNc de subunidades β y probablemente un número igual en las γ. RECEPTORES DE CITOQUINAS (receptores asociados a TQ extrínseca) Son semejantes en estructura a los receptores TQ descriptos, sin embargo estos se componen generalmente de 2 o más subunidades, con un máximo de 6. Aunque no presentan en su dominio citosólico la función catalítica, sino que tienen la capacidad para asociarse a proteínas TQ citoplasmáticas. Hay más de 25 ligandos conocidos incluyendo: hormona de crecimiento, prolactina, leptina, eritropoyetina, la mayoría de las interleuquinas e interferones α, β y γ. Cuando el ligando se fija al dominio extracelular, se produce dimerización y la porción citosólica interacciona con TQ citoplasmáticas, que pertenecen a una familia denominada Familia Janus de Tirosinas Quinasas (JAKs; Just Another Kinase). Existen 4 miembros conocidos: JAK1, JAK2, JAK3 y Tyk2. En la mayoría de los casos las JAKs se asocian al receptor incrementando su actividad, su afinidad por el ligando o ambas. Un vez activadas las JAKs estas se fosforilan a si mismas y al receptor en múltiples tirosinas constituyendo el complejo Receptor de Citoquina-JAK, esto genera sitios de unión para diversas proteínas señales que contienen dominios de unión a fosfotirosinas como por ejemplo los Figura 13. Receptor de citoquinas. SH2. Las proteínas señales reclutadas al complejo receptor de citoquinas-jak son generalmente las mismas que para la vía de la tirosina quinasa antes descripta (IRS, Grb2; que llevan a la activación de la cascada Ras- MAP quinasa, fosfolipasa C e IP3-K). Sin embargo existe una familia de proteínas señales importantes para la función de citoquinas, denominadas STATs (Signal Transducers and Activators of Trascription), estas STATs son factores de trascripción citoplasmáticos latentes que se unen a través de sus dominios SH2 a una o más fosfotirosinas del Complejo Receptor Citoquina-JAK activado. Luego, las STATs se autofosforilan y se disocian de este complejo y se dimerizan con otras STATs, traslocándose al núcleo y uniéndose a elementos del promotor dentro de los genes de respuesta a citoquinas. (Fig. 13). Página 19

21 Las proteínas SOCSs (Suppressors Of Cytokine-Signaling) juegan un rol importante en la terminación de la señal de las citoquinas a través de un bucle de feed-back negativo. Son generalmente sintetizadas en respuesta a las citoquinas, y se unen a través de su dominio SH2 a las fosfotirosinas del complejos receptor citoquina-jak inhibiendo la posterior señalización. SISTEMAS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES CORRIENTE ABAJO Sistema Ras-quinasa y MAP-quinasa Esta vía de transducción de señales pone en acción una cascada de proteínas quinasas muy importantes en la regulación de numerosas funciones celulares. Todos sus componentes son proteínas, no se generan segundos mensajeros de molécula pequeña. Figura 14. Sistema RAS Quinasa y MAP Quinasa. Las proteínas Ras forman una familia de unos 50 miembros. Son proteínas pequeñas que unen nucleótidos de guanina, integrantes de sistema de transmisión de señales relacionado con la modulación de la multiplicación y desarrollo celular. A esta familia pertenecen también las proteínas ARF y Rab, vinculadas a la regulación del tránsito vesicular de proteínas, las Ran, relacionadas con la importación de proteínas en el núcleo y las Rho, involucradas en la organización del citoesqueleto. En realidad, existen diversas vías activadas por Ras, una de ellas comienza con la activación por Ras-GTP de la proteína Raf (MAPKKK), la que a su vez fosforila y estimula a MEK (MAPKK), esta última a restos serina-treonina y también tirosina, activando a miembros de la familia de quinasa reguladas por señales extracelulares, denominadas ERK (MAPK).Estas quinasas fosforilan una variedad de proteínas blanco que incluyen otras proteínas quinasa y factores de transcripción en el núcleo, modulando la actividad génica. (Fig. 14). Página 20