TÉCNICAS GENÓMICAS. 2) Cuantificación del número de virus presentes en muestras de sangre o suero: carga vírica

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1 TÉCNICAS GENÓMICAS Utilidad/Objetivos: 1) Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo concreto 2) Cuantificación del número de virus presentes en muestras de sangre o suero: carga vírica 3) Identificación de un microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales (cultivo) 4) Detección de factores de virulencia 5) Determinación de determinantes de resistencia a los antimicrobianos directamente en muestra o sobre las bacterias tras el cultivo 6) Estudios epidemiológicos mediante la comparación de las cepas aisladas. Técnicas Actualmente son muchas, variantes de las preexistentes o nuevas. En general se clasifican en 2 tipos: a) Técnicas de hibridación b) Técnicas de amplificación Premisas En cualquiera de ellas el primer paso es la EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS que implica la lisis celular, la concentración de ácidos nucleicos, la protección frente a la degradación enzimática y la inhibición de las reacciones que se vayan a realizar. Se realiza por métodos físicos (sonicación, ciclos de congelación/descongelación ), químicos (proteinasa K -sóla o asociada a tratamiento con fenol/cloroformo- isotiocianato de guanidina ) y/o enzimáticos (lisozima )

2 Cuando se calienta ADN por encima de 90ºC las 2 cadenas se separan desnaturalización. Al descender la temperatura las bases vuelven a aparearse específicamente reconstituyéndose el ADN original Sonda: pequeños fragmentos de ADN (20-50 nucleótidos) sintetizados en el laboratorio y cuya secuencia es complementaria de la de un fragmento genético, en este caso, el que queremos detectar. HIBRIDACIÓN Es la unión de la sonda con su secuencia complementaria. Es una unión muy específica, tanto que la diferencia en un solo nucleótido hace que no se produzca. Las sondas se marcan (sustancia radiactiva, fluorescente o un enzima) para detectar la producción de la hibridación. En la detección también pueden utilizarse anticuerpos marcados frente a la cadena de ADN bicatenario. La hibridación puede realizarse en solución, sobre un soporte sólido e in situ. A) hibridación en solución: se realiza en un medio líquido. La hibridación se produce rápidamente (1 hora o menos) por lo que es un método práctico y sencillo.

3 HIBRIDACIÓN NEG HIBRIDACIÓN POS 1:introducción en el tubo del ADN extraido (en un solvente adecuado); 2: desnaturalización mediante calor y se añade la sonda marcada por ejemplo con un ester de acridina que es un marcador luminiscente; 3: al bajar la temperatura si hay complementariedad la sonda hibrida (derecha); 4: se añade un alcali para crear el ambiente adecuado para poder detectar la reacción; 5: en presencia de alcali se inhibe la luminiscencia de las sondas no fijadas mientras que en las sondas hibridadas la acridina queda protegida de la acción del alcali y emite luminiscencia B) Hibridación sobre fase sólida. Tras la extracción de ácidos nucleicos y desnaturalización del ADN problema, se deposita una gota en una membrana de nilon o nitrocelulosa y se fija. Se sumerge en una solución de hibridación que contiene, entre otras cosas, a la sonda. Tras eliminar la sonda no unida se detecta la fijada por dot blot o spot blot según se deposite el material sobre la membrana como una gota circular o alargada. Se utiliza fundamentalmente en investigación. En la práctica clínica existen kits comerciales como (INNO-LIPA) C) La hibridación in situ se realiza sobre un corte histológico.

4 Tecnología de los chips o de los arrays La traducción de arrays seria similar a cepillos genéticos por la similitud de las sondas fijadas y las cerdas de un cepillo. Sería una superficie generalmente de vidrio de aproximadamente 1 cm2 dividida en numerosos cuadrados imaginarios en los que se fijan las sondas. Si las subáreas son grandes (>200 μm) se habla de macroarrays y si son pequeñas (<200 μm) de microarrays. La gran cantidad de sondas unidas y, por consiguiente, de posibles detecciones hace que de considere a cada chip como un laboratorio total. Se utiliza fundamentalmente en investigación. TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN La hibridación en ocasiones posee una baja sensibilidad debido a la presencia de un escaso número de copias en la muestra original. Por ello en ocasiones como paso previo se realiza una amplificación que no es más que una clonación in Vitro que permite obtener múltiples copias de ADN. También puede realizarse sobre ARN tras su conversión en ADN complementario (ADNc) mediante una transcriptasa inversa. Técnicas Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): la secuencia diana del microorganismo concreto se amplifica utilizando una polimerasa (habitualmente Taq polimerasa) y cambios de temperatura Permite "multiplicar" de forma exponencial el número de copias de de cualquier fragmento de un ácido nucleico por medio de una simple reacción enzimática de polimerización. La PCR es más conocida por las siglas de la terminología anglosajona (Polimerase Chain Reaction), y en 1989 llegó a ser considerada el "mayor descubrimiento científico del año".

5 Fundamento: La PCR no es más que un proceso de clonación in vitro que permite obtener múltiples copias de un fragmento de un ácido nucleico mediado por un enzima (ADN polimerasa) y a partir de unas secuencias de iniciación se síntesis (iniciadores, cebadores o primers), en presencia de deoxinucleótidos de las 4 bases e iones Mg+, entre otros componentes y sometido a ciclos repetidos de DESNATURALIZACION que se realiza a temperaturas superiores a 94ºC con lo que se logra la ruptura de los puestes de hidrógeno y la separación de las cadenas, APAREAMIENTO DE INICIADORES a las secuencias complementarias de la hebra simple de ADN diana que se produce al disminuir la temperatura hasta 55-68ºC y EXTENSION O SINTESIS a la T óptima de actividad del enzima, que en el caso de la Taq polimera son 72ºC. Finalizado este paso de síntesis, el ciclo se repite entre veces, actuando los productos sintetizados como moldes para los siguientes ciclos, dando lugar a un crecimiento exponencial del número de copias. Por tanto, en una reacción de amplificación tenemos que considerar unos : 1) Parámetros o elementos químicos: -ácido nucleico diana o molde, es decir el fragmento que se quiere amplificar y detectar. En el caso que sea ADN se hace directamente la reacción de amplificación. Si es ARN es necesario realizar un paso previo de retrotranscripción de ARN ADN y a partir de ahí realizar la PCR, - secuencias de iniciación - polimerasa (la más utilizada es la Taq polimerasa, una polimerasa termoestable obtenida a partir de Termus aquaticus y que permitió la automatización del proceso). dntps, Mg++ 2) Parámetros o elementos físicos: la temperatura ya que en cada ciclo de amplificación cambia en las tres fases: desnaturalización, apareamiento de iniciadores y extensión o síntesis de nuevas cadenas

6 Desnaturalización Apareamiento Extensión Nested PCR: Tras la amplificación de un fragmento se realiza una reamplificación de un fragmento interno utilizando otros cebadores diferentes. Puede realizarse en un tubo (utilizando temperaturas diferentes para ambos cebadores) o en dos tubos, uno para la amplificación y otro para la reamplificación. PCR múltiple: a la muestra extraída se le añaden varios juegos de cebadores (cada par específico de un microorganismo o región concreta). Al realizar la reacción, se amplifican diferentes dianas. Por ejemplo puede realizarse para hacer una identificación y detección de varios determinantes de resistencia a los antimicrobianos. PCR cuantitativa: Se utiliza para determinar el número de copias de la muestra inicial. Suele utilizarse una técnica competitiva, para ello se incorpora a la reacción un ARN o un ADN competidor según el tipo de ácido nucleico diana a amplificar-, que tenga la misma longitud y utilice los mismos cebadores que el ADN ó ARN problema. La cantidad incorporada del competidor debe ser conocida, de forma que al final de la reacción puedan determinarse las cantidades respectivas de amplicones producidos por el problema y el competidor.

7 Al ser las condiciones de la reacción idénticas, se produce una relación lineal entre los cocientes iniciales y finales tanto del problema como del competidor, pudiendo obtenerse de una forma sencilla la concentración inicial del ácido nucleico problema (conocemos la concentración final del problema y tanto la inicial como la final del competidor) ADN ó ARN problema + Cantidad conocida ADN ó ARN competidor Mismos cebadores Igual longitud amplificados Mismas condiciones Cantidad Cantidad Ci Cf = Ci Cf Relación lineal PCR a tiempo real: se realiza en muy poco tiempo (aproximadamente 30 minutos) y proporciona una cuantificación continua y precisa del ADN que se va formando. El fundamento es el mismo que el de la PCR convencional pero con algunas modificaciones técnicas: -Se realiza en un capilar por lo que los cambios de temperatura se realizan con mucha rapidez - Los fragmentos amplificados son más cortos - Requiere un termociclador y lector específicos - Se utilizan diferentes métodos de detección Amplificación basada en la transcripción: existen una gran variedad de técnicas: NASBA, TMA, 3SR Otras técnicas de amplificación

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