PROCEDIMIENTO PARA LA UTILIZACIÓN DEL POLIMORFISMO DEL GEN COMT (CATECOL-OXI-METILTRANSFERASA) EN EL DIAGNÓSTICO DEL SÍNDROME DE FIBROMIALGIA

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1 2 PROCEDIMIENTO PARA LA UTILIZACIÓN DEL POLIMORFISMO DEL GEN COMT (CATECOL-OXI-METILTRANSFERASA) EN EL DIAGNÓSTICO DEL SÍNDROME DE FIBROMIALGIA D E S C R I P C I Ó N OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente memoria descriptiva se refiere a una solicitud de un Modelo de Utilidad correspondiente a un procedimiento para la utilización del polimorfismo del gen COMT (catecol-oxi-metiltransferasa) en el diagnóstico del Síndrome de Fibromialgia, cuya finalidad estriba en demostrar la significación del polimorfismo del gen COMT en relación con la Fibromialgia y la gravedad de la misma, proponiendo la obtención de un diagnóstico basado en la detección del citado polimorfismo, ya que sea solo o en un conjunto de genes más amplio. La detección del gen COMT, ya sea solo o en combinación con otros, permite la detección precoz de grupos de riesgo de sufrir el Síndrome de Fibromialgia (FM), así como la segmentación entre pacientes del grupo más afectado por la enfermedad. En síntesis, la invención consiste en el desarrollo de un procedimiento que, a través de la detección del polimorfismo del gen COMT, permite detectar pacientes con riesgo de sufrir Fibromialgia y entre éstos, detectar a los más graves. 3 CAMPO DE LA INVENCIÓN

2 3 Esta invención tiene su aplicación dentro de la industria de la medicina en general y, más especialmente, dentro del campo de la investigación médica para obtener diagnósticos precoces, identificación de poblaciones de riesgo y segmentar grupos de pacientes en función del pronóstico. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Síndrome de Fibromialgia (FM) se ha asociado a desórdenes neuroendocrinos con un anormal funcionamiento del eje hipotálamo-hipofisiariosuprarrenal (HHS), incluyendo hiperactividad de la hormona ACTH y baja respuesta suprarrenal, siendo muy relevante la disminución del IGF-1 (Insulin Growth Factor-1). El enzima COMT (catecol-oxi-metiltransferasa) tiene, entre otras funciones, la inactivación de la dopamina y las catecolaminas, así como los catecolestrógenos. El enzima COMT es codificado por el gen COMT y su grado de actividad del polimorfismo del citado gen. Existen tres polimorfismos alélicos del gen COMT: HH (alta actividad), HL (actividad media) y LL (baja actividad). Por parte del solicitante se desconoce la existencia en la actualidad de un procedimiento para la utilización del polimorfismo del gen COMT similar al que se describe en la presente memoria. 3 DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

3 4 El procedimiento para la utilización del Fibromialgia que la invención propone, es efectuado a partir del análisis del polimorfismo por técnicas de PCR (reacción en cadena de las polimerasas), con detección específica de Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (RFLP). Para la realización previa del procedimiento se seleccionó un grupo de 316 pacientes (mujeres) con Fibromialgia, diagnosticadas según los criterios internacionales vigentes (Criterios del Colegio Americano de Reumatología del año 1990) y 9 voluntarios o controles sanos (también mujeres). Tanto los pacientes como los voluntario o controles sanos tenían el mismo origen étnico, demostrándose, tras el análisis estadístico de los datos, que el genotipo LL es más frecuente en pacientes con FM y que, además, esta frecuencia aumenta mucho en el grupo de pacientes con FM severa o hiperálgica. El protocolo del trabajo y el objetivo consistía en comprobar si existía significación estadística según el polimorfismo del gen COMT en los pacientes con Fibromialgia en relación al grupo control y, si se confirmaba la hipótesis, valorar si la gravedad clínica del proceso y su resistencia al tratamiento mostraban también diferencias respecto al grupo de pacientes con buena respuesta terapéutica. 3 Debe tenerse en cuenta que la causa de la FM así como sus mecanismos de producción son desconocidos en la FM, no existiendo en la actualidad un tratamiento

4 curativo de la misma. Los polimorfismos del gen COMT determinan la actividad del enzima del mismo nombre y la capacidad de degradar o inactivar las catecolaminas, la dopamina y los llamados catecol-estrógenos. Consecuentemente, debe indicarse que un enzima COMT de baja actividad COMTLL) degrada con menor eficacia tanto las catecolaminas como la dopamina. También, debe tenerse en cuenta que, en condiciones normales, las catecolaminas promueven la liberación de algunas interleukinas como la IL-1, IL-6 y TNF, que entre otras funciones activan el eje HHS y, adicionalmente, la Noradrenalina ha sido descrita como alteradora de la relación señal/ruido a nivel neuronal y es frecuente el hallazgo de niveles elevados de Noradrenalina en pacientes con FM. La invención demuestra que el genotipo COMTLL es más frecuente en enfermas con FM que en la población control, en tanto que el genotipo COMTHH es menos frecuente en las pacientes con FM que en la población control, no siendo significativo el COMTHL. Con respecto al grupo de pacientes no respondedores, la frecuencia de genotipo COMTLL se eleva hasta un 77,3%, lo que permite considerar a este genotipo no solo como un factor de riesgo sino como un factor pronóstico. REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN 3 El procedimiento para la utilización del

5 6 Fibromialgia está constituido a partir de la extracción de ADN de leucocitos en sangre periférica venosa, utilizándose la técnica de Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (RFLP) para detectar la presencia de la sustitución de la base Guanina por Adenina en la posición 1947 del gen COMT (Z26491), utilizándose la técnica de PCR (Reacción en Cadena de las Polimerasas) para amplificar el fragmento 18-bp de ADN genómico conteniendo el polimorfismo. Las secuencias utilizadas son - GGAGCTGGGGGCC-TACTGTG-3 (directa) y - GGCCCTTTTTCCAGGTCTG-ACA-3 (inversa). La PCR se realizó en una proporción de 0:1 con -0 ng de ADN, 0mM de Deoxinucleótido Trifosfato (dntp), pmol de cada uno, 1 mm de Cl 2 Mg, mm Tris-ClH (ph 8,6), 0 mm ClK, 0,2% de suero bovino de albúmina y 1 U Taq polimerasa. 3 La amplificación es efectuada a cabo de un termociclo MWG Biotech y las condiciones de la PCR son tres minutos para la desnaturalización inicial a 94ºC, 3 ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 60ºC y un minuto a 72ºC para la fase de extensión inicial, seguido de siete minutos a 72ºC para la extensión final. Los productos resultantes de la PCR son sometidos a restricción de endonucleasas durante tres horas a 37ºC utilizando U de Nla III y el resultado se aplica a 0 V durante un espacio que oscila entre y minutos en un medio al 4% NuSieve 3:1 Agarosa,

6 7 un biomarcador 0-bp se utilizada como medida estándar para cada línea de gel, y el gel fue visualizado bajo luz ultravioleta (UV) utilizando un sistema visualizador por electroforesis, y el genotipo COMT-LL se representa por fragmentos 114-bp, 3-bp y 36-bp, COMT-LH por 114-bp, 96-bp, 36-bp, 3-bp y 18-bp, en tanto que el COMT-HH se representa por 96-bp, 3-bp, 36-bp y 18-bp. Los fragmentos 18-bp son difíciles de visualizar debido a su pequeño tamaño y a fenómenos de coemigración con fragmentos de longitud parecida pero, en todo caso, su detección no es crítica en la identificación de los genotipos. 3

7 8 R E I V I N D I C A C I O N E S 1.- Procedimiento para la utilización del Fibromialgia, utilizándose para la obtención de las estadísticas un análisis de datos con un software adecuado para el test de chi-cuadrado y el análisis de varianza (ANOVA), caracterizado por estar constituido a partir de la extracción de ADN de leucocitos en sangre periférica venosa, empleándose la técnica de Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (RFLP) para la detectar la presencia de la sustitución de la base Guanina por Adenina en la posición 1947 del gen COMT (Z26491), empleándose la técnica de PCR (Reacción en Cadena de las Polimerasas) para amplificar el fragmento 18-bp de ADN genómico conteniendo el polimorfismo. 2.- Procedimiento para la utilización del Fibromialgia, según la primera reivindicación, caracterizado porque las secuencias directa son - GGAGCTGGGGGCC-TACTGTG Procedimiento para la utilización del Fibromialgia, según la primera reivindicación, caracterizado porque las secuencias inversas son - GGCCCTTTTTCCAGGTCTG-ACA Procedimiento para la utilización del

8 9 Fibromialgia, según la primera reivindicación, caracterizado porque la PCR se efectúa en una proporción de 0:1 con -0 ng de ADN, 0mM de Deoxinucleótido Trifosfato (dntp), pmol de cada uno, 1 mm de Cl 2 Mg, mm Tris-ClH (ph 8,6), 0 mm ClK, 0,2% de suero bovino de albúmina y 1 U Taq polimerasa..- Procedimiento para la utilización del Fibromialgia, según la primera reivindicación, caracterizado porque la amplificación es efectuada en un termociclo y las condiciones de la PCR son de tres minutos para la desnaturalización inicial a 94ºC, 3 ciclos de un minuto a 94ºC, un minuto a 60ºC y un minuto a 72ºC para la fase de extensión inicial, seguido de siete minutos a 72ºC para la extensión final. 6.- Procedimiento para la utilización del Fibromialgia, según la primera y quinta reivindicaciones, caracterizado porque los productos resultantes de la PCR son sometidos a restricción de endonucleasas durante tres horas a 37ºC utilizando U de Nla III y el resultado se aplica a 0 V durante - minutos en un medio al 4% NuSieve 3:1 Agarosa. 3

9 R E S U M E N Procedimiento para la utilización del Fibromialgia que consiste en la extracción de ADN de leucocitos y posteriormente utilización de la técnica PCR amplificando el fragmento 18-bp de ADN genómico, realizándose la PCR en una proporción de 0:1 con - 0 ng de ADN, 0mM de Deoxinucleótido Trifosfato (dntp), pmol de cada uno, 1 mm de Cl 2 Mg, mm Tris- ClH, 0 mm ClK, 0,2% de suero bovino de albúmina y 1 U Taq polimerasa. 3

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